Name: Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Apprenez à évaluer l'intégrité de l'ADN dans les cellules souches iPS avant transplantation cardiaque. Ces protocoles détaillés utilisent le test des comètes et l'immunomarquage γ-H2AX pour garantir la qualité cellulaire.

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Ce travail a été soutenu en partie par le National Heart, Lung, and Blood Institute subventions RO1-HL-99507, HL-114120, HL-131017, HL138023 et UO1-HL-134764 (à J. Zhang) et par l’American Heart Association scientifique Development Grant 17SDG33670677 (de Gigi R.).

1. essai de comet
<ol><li>
Préparation du réactif
	<ol>
<li>D’agarose de la bas-fondre-point, lieu 500 mg de bas point de fusion d’agarose dans 100 mL d’ADN- / eau exempte de RNA. Faire chauffer la bouteille dans un four à micro-ondes jusqu'à ce que l’agarose se dissout. Placer la bouteille dans un bain d’eau de 37 ° C jusqu'à ce que nécessaire. Remarque : Pour en savoir plus, voir Azqueta et al., qui a étudié les effets de la concentration d’agarose sur le temps de déroulement d’ADN et plusieurs électrophorèse facteurs23.</li>
		<li>Diluer le colorant SYBR green ADN dans un tampon Tris-EDTA (TE) à un ratio de 1/10 000 pour obtenir un 1 x solution de colorant stock de travail. Ce colorant est sensible à la lumière, donc stockez-la dans un endroit sombre.</li>
		<li>Pour le tampon de lyse cellulaire, dissoudre 100 mL de tampon de lyse (2,5 M NaCl, EDTA de 0,1 M, 10 mM Tris, 1 % Triton X-100) dans l’eau désionisée (DI H2O). Ensuite, ajoutez 10 M de NaOH pour ajuster le pH à 10.0. Cool le tampon à 4 ° C.</li>
		<li>Pour le tampon déroulement/électrophorèse d’ADN en cours d’exécution alcalin, dissoudre 1 L de solution alcaline (0,3 M NaOH, 1 mM EDTA) dans DI H2O. Cool le tampon à 4 ° C. S’assurer que le pH > 13.</li>
		<li>Pour les lames d’un préenduisage comète, versez quelques gouttes de 0,5 % d’agarose sur une lame de verre. Immédiatement, en utilisant la surface plane d’une autre diapositive, étaler sur l’agarose pour former une fine couche d’enduit de gel d’agarose. Remarque : Sécher les lames avant d’utiliser.</li>
		<li>Brièvement pour culture de cellules iPS, cellules iPS culture basement-membrane-matrice-enduit (voir Table des matières) culture plaques en milieu de culture de mTESR1 jusqu'à la confluence est atteint. Remarque : Cardiaque-fibroblaste-anthropique CSPI ont été utilisés dans le présent protocole. La reprogrammation de la dérivation de cellules iPS et les conditions de culture est décrites dans les articles récents de notre groupe de recherche12,13,21.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des échantillons
	<ol>
<li>Jeter le milieu de culture et laver les cellules. Dissocier les cellules à l’aide de la solution de détachement (voir Table des matières). Laver le culot cellulaire avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remettre en suspension les cellules dans du PBS 1 x 105 cellules/ml.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des échantillons diapositive Remarque : Effectuez les opérations suivantes dans des conditions de faible luminosité pour éviter les dommages cellulaires induites par la lumière ultraviolette.<ol>
<li>Mix 10 μl de suspension cellulaire et 90 μL de solution d’agarose (01:10 ratio) dans un tube. Placer le tube dans un bain d’eau de 37 ° C pour empêcher l’agarose de solidification.</li>
		<li>Mélanger les solutions sans introduire des bulles d’air et pipeter 70 μL/spot sur le toboggan de la comète prêtes à l’emploi. À l’aide d’un embout de la pipette, étendre le mélange de gel d’agarose de cellules pour former une couche mince. Placez la lame à 4 ° C pendant 15 minutes.</li>
		<li>Dans un récipient, submerger complètement la lame dans le tampon de lyse froid. Placer le récipient dans l’obscurité à 4 ° C pendant 1 h.</li>
		<li>Remplacer le tampon de lyse par une solution alcaline froide. Assurez-vous que les lames sont complètement immergés. Placer le récipient dans l’obscurité à 4 ° C pendant 30 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Électrophorèse
	<ol>
<li>Placer la diapositive dans une cuve d’électrophorèse horizontale. Remplissez le réservoir avec le tampon d’électrophorèse alcalin froid jusqu'à ce que les lames sont complètement immergés. Appliquer la tension de 1 V/cm pour 15 à 30 min. Remarque : Total de tension = distance entre les électrodes x 1 V</li>
		<li>Dans un récipient, submerger complètement la lame dans le froid DI H2O. Après 2 min, retirer le DI H2O et ajouter frais DI H2O. répéter cette étape.</li>
		<li>Remplacez le DI H2O froid éthanol à 70 %. Attendre 5 min. délicatement enlever la culasse, ne pas incliner et laissez-le sécher à l’air.</li>
		<li>Une fois sec, ajouter 100 μL de colorant dilué de l’ADN à chaque endroit. Attendre 15 min à température ambiante. À l’aide d’un filtre FITC dans un microscope à épifluorescence, prendre des photos de 50 à 100 comètes au total par échantillon.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analyse d’images et de calcul des résultats
	<ol>
<li>Pour marquer les comètes, utiliser les instituts nationaux de la santé (NIH) ImageJ avec plugin test comète (télécharger ImageJ ici : https://imagej.nih.gov/ij/download.html; télécharger le plugin ici : https://www.med.unc.edu/microscopy/resources/imagej-plugins-and-macros/comet-assay/). Remarque : Le plugin est fourni avec une instruction de PDF qui contient tous les détails pour effectuer l’analyse. En outre, captures d’écran de l’analyse de la comète sont indiquées dans la Figure 2 a-C. Images de la comète représentatif de contrôle et de la doxorubicine (Doxo)-CSPI traitée et la quantification des comètes sont indiquées dans la Figure 3 a-C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. réponse aux dommages de l’ADN
<ol><li>Préparation d’échantillons et de réactifs
	<ol>
<li>Pour une culture de cellules iPS-CM, culture iPS-CM cellules basement-membrane-matrice-enduit (voir Table des matières) plaques de culture dans un milieu RPMI additionné de B-27 (CMM) jusqu'à la confluence est atteint. Remarque : IPS-cellule-anthropique cardiomyocytes ont été utilisés dans le présent protocole. Le protocole pour la différenciation des cellules iPS dans les cardiomyocytes se trouvent dans les articles récents de notre groupe de recherche12,13,21.</li>
		<li>IPS-CMs dans les diapositives de la chambre de graines.<ol>
<li>Jeter le milieu de culture des puits iPS-CM. Laver les cellules trois fois avec du PBS.</li>
			<li>Ajouter 1 mL de 0,25 % de trypsine chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 5 min. vérifier la plaque sous un microscope pour le détachement cellulaire. Ajouter 1 mL de CMM pour arrêter la trypsine.</li>
			<li>Placer suspension de cellules dans un tube de 15 mL et centrifuger pendant 5 min à 4 ° C et 200 x g. Jeter le médium, ajouter 1 mL de CMM et remettre les cellules en suspension. Compter les cellules et d’ajuster le nombre de cellules pour obtenir 20 x 105 cellules en 1,6 mL de CMM.</li>
			<li>Graine de 200 µL de la suspension de cellules / puits de la chambre de 8 puits glisser (voir Table des matières). Cliquez sur la diapositive doucement pour répandre les cellules autour du puits et incuber à 37 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour le traitement de doxorubicine iPS-CM, jeter le milieu de culture des puits iPS-CM. Laver les cellules avec du PBS. Traiter les cellules avec 1 doxorubicine μM et CMM pour 4 h. aspirer le milieu et laver les cellules avec du PBS.</li>
		<li>Pour le tampon de blocage, préparer 10 mL de solution d’albumine sérique bovine (BSA) contenant 3 % de BSA et 0,05 % X-100 Triton. Pour préparer 10 mL de tampon de blocage, ajouter 1 mL de sérum normal âne dans 9 mL de solution de BSA préparée.</li>
		<li>Pour la solution d’anticorps primaire, ajouter 1 μL de anti-lapin phospho-histone H2A. X (Ser139) anticorps à 200 μl de tampon de blocage.</li>
		<li>Pour le dosage des anticorps secondaire, ajouter 1 μL de fluorochrome-conjuguées anti-lapin anticorps secondaire, DAPI et phalloïdine fluorochrome-conjuguées à 200 μl de tampon de blocage.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunomarquage
	<ol>
<li>Laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter 200 μl de paraformaldéhyde fraîchement préparés à 4 % (PFA) dans chaque puits. Fixer les cellules pendant 20 min à l’obscurité à température ambiante. Laver les cellules avec du PBS.</li>
		<li>Supprimez le PBS et 200 μL de tampon de blocage par puits et bloc pendant 30 min dans une chambre humide à température ambiante. Retirer le tampon bloquant et ajouter 200 μl de solution d’anticorps primaire. Incuber pendant 45 min dans une chambre sombre et humide à température ambiante. Ensuite, laver les puits trois fois avec du PBS.</li>
		<li>Retirer le PBS et ajouter 200 μL du mélange de l’anticorps secondaire. Incuber pendant 45 min dans une chambre sombre et humide à température ambiante. Ensuite, laver les puits trois fois avec du PBS. Laver avec DI H2O avant de les monter avec antifade. Placez une lamelle et stocker les lames dans l’obscurité à 4 ° C.</li>
		<li>À l’aide d’un microscope à épifluorescence, prendre trois à cinq images de champs aléatoires par échantillon, comme indiqué dans la Figure 4 aet procéder à l’analyse de l’image.</li>
	</ol></li>
	<li>Comptage des foyers DDR
	<ol>
<li>Téléchargez et installez CellProfiler24 (http://cellprofiler.org).</li>
		<li>
Remarque : Image processing dans cette étude a été réalisée à l’aide de CellProfiler version 2.1.1. Tutoriels pour CellProfiler qui ont été utilisés peut être trouvé ailleurs (https://www.youtube.com/watch?v=PvhRL9xpduk & list = PL7CC87670239B4D10). Si une nouvelle version de CellProfiler est utilisée, le pipeline peut nécessiter des adaptations mineures.</li>
		<li>Télécharger le pipeline punctae_gH2AX.cpipe. Sélectionnez fichier > importer > Pipeline à partir du fichier et choisissez punctae_gH2AX.cpipe.</li>
		<li>Glisser-déplacer le dossier contenant les images acquises des foyers γH2A.X à la fenêtre de liste de fichiers dans la section Input modules/Images pour analyse (Figure 5 a). Puis, suivez les instructions comme indiqué dans la Figure 5 a-L.</li>
		<li>Définissez les paramètres suivants pour les images :<ol>
<li>Glisser l’image souhaitée pour l’analyse dans la liste de fichiers. Sous modules de saisie, sélectionnez Images (voir Figure 5 a pour les paramètres de module). Dans les modules d’entrée, sélectionnez les métadonnées (voir Figure 5 b pour les paramètres de module). Dans les modules d’entrée, sélectionnez NamesAndTypes (voir Figure 5 paramètres de module).</li>
			<li>Pour les groupes, sélectionnez aucun. Dans les modules d’analyse, sélectionnez ColorToGray (voir Figure 5 paramètres de module).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dans les modules d’analyse, sélectionnez lisse (voir Figure 5E pour les paramètres de module). Remarque : Cette valeur peut doivent être optimisées, selon la résolution de l’image.</li>
		<li>Dans les modules d’analyse, sélectionnez IdentifyPrimaryObjects (voir Figure 5F pour les paramètres de module). Remarque : Optimiser ces valeurs pour s’assurer que le noyau entier est sélectionné. Après cette étape, l’ordinateur peut rester.</li>
		<li>Dans les modules d’analyse, sélectionnez lisse (voir Figure 5 paramètres de module). Remarque : Cette valeur peut doivent être optimisées, selon la résolution de l’image.</li>
		<li>Dans les modules d’analyse, sélectionnez EnhanceOrSuppressFeatures (voir la Figure 5 H pour les paramètres de module).</li>
		<li>Dans les modules d’analyse, sélectionnez IdentifyPrimaryObjects (voir Figure 5I pour les paramètres de module). Remarque : Optimiser ces valeurs pour s’assurer que le punctae sont sélectionnés. Après cette étape, l’ordinateur peut rester encore une fois.<ol>
<li>Dans les modules d’analyse, sélectionnez RelateObjects (voir Figure 5J pour les paramètres de module). Dans les modules d’analyse, sélectionnez ClassifyObjects (voir la Figure 5 K pour les paramètres de module). Dans les modules d’analyse, sélectionnez ExportToSpreadsheet (voir la Figure 5 L pour les paramètres de module).</li>
			<li>Cliquez sur Analyser les Images dans le panneau de gauche de fond à effectuer une analyse de l’image. À la fin de l’analyse, plusieurs images sont générés (Figure 6 a-F). Remarque : Les utilisateurs doivent enregistrer ces images pour un usage ultérieur.</li>
			<li>Noter le fichier .csv contenant les données quantitatives pour l’analyse approfondie qui est générée et enregistrée à l’emplacement approprié sur l’ordinateur. Dans la feuille de calcul appelée MyExpt_Image, les colonnes B et D auront le nombre de noyaux qui ont jusqu'à cinq et plus punctae, respectivement. Ajouter des colonnes B et D pour obtenir le nombre total de noyaux.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Répétez l’étape 2.3.3 - 2.3.8 pour toutes les images (changer le nom du fichier MyExpt_ avant chaque analyse). Emplacements sont possibles pour évaluer l’intégrité de l’ADN, comme le montre la Figure 4.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bolli, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+stem+cells+in+patients+with+ischaemic+cardiomyopathy+%28SCIPIO%29%3A+initial+results+of+a+randomised+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial.</a> The Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).</li>
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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cardiomyocytes+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Circulation Research. 104 (4), e30-e41 (2009).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Intégrité de l’ADN dépeint l’intégrité cellulaire. Cellules avec ADN endommagé sont souvent stress et finissent par perdent leur intégrité. L’intégrité des souches et de cellules de tige-cellule-dérivé étant propagés aux fins de transplantation est principale pour les cellules de remplir leur fonction désirée. La transplantation de cellules avec de l’ADN endommagé se traduirait par un taux de mauvaise prise de greffe et de la performance de la cellule8,20. Par co...

Les preuves expérimentales et cliniques montrent que les cellules hématopoïétiques peut améliorer modérément la performance contractile du ventricule gauche n’a pas de coeurs1,2,3,4,5 ,6,7,8,9. Les progrès récents ont ouvert davantage attrayant de possibilités pour la regénération cardiovasculaire ; citons l’expression forcée des facteurs de reprogrammation de cellules somatiques pour induire la pluripotence et différencier ces des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) en différentes lignées cardiaques, ce qui est important cardiomyocyte (CM)10, 11 , 12 , 13. le matériel héréditaire dans chaque cellule, y compris le CISP artificiellement généré et dérivés iPSC CM (iPS-CM), est l’ADN. Les instructions génétiques stockées dans ADN dicte la croissance, le développement et la fonction des cellules, tissus, organes et organismes. L’ADN n’est pas inerte ; métabolites, comme réactives de l’oxygène carbonyle et azotés, de cellules et des agents alkylants ADN cause endommager in vitro et in vivo14,15,16,17. Ce qui est important, les dommages à l’ADN se produisent intuitivement dans chaque cellule, avec une fréquence significative. Si ces dommages ne sont pas corrigées, il conduira à la mutation de l’ADN, la sénescence cellulaire, la perte d’intégrité de l’ADN et de cellules et éventuellement, des maladies, y compris les cancers mortels. Conserver l’intégrité de l’ADN est donc essentielle pour n’importe quelle cellule, en particulier la CISP, qui a un potentiel énorme dans la clinique.
Pour évaluer la quantité et l’intégrité de l’ADN génomique isolé, un matériel onéreux est disponible sur le marché. Cependant, il n’y a aucune méthode simple et économique pour évaluer l’intégrité de l’ADN dans les cellules sans isoler les cellules. En outre, dégradation de l’ADN induite par l’utilisateur lors de l’isolation de l’ADN est l’un des inconvénients majeurs dans l’utilisation de ces méthodes. Les unicellulaires gel électrophorèse (connu comme le test des comètes)18,19 et γH2A.X immunomarquage8 techniques sont des approches fondamentales dans les laboratoires de recherche pour évaluer les dommages à l’ADN. Ces deux méthodes ne nécessitent pas de matériel coûteux ou ADN génomique isolé pour analyser l’ADN intégrité8,20,21. Depuis, ces techniques ont été réalisées avec des cellules entières ; dégradation de l’ADN/ARN/protéines induite par l’utilisateur lors de la préparation de l’échantillon n’affectera pas ces protocoles. Ici, pour évaluer les dommages à l’ADN et la réponse aux dommages de l’ADN dans les souches et les cellules de tige-cellule-dérivé, nous fournissons des protocoles étape par étape pour effectuer les deux la comète dosage et γH2A.X immunomarquage. En outre, combinant ces deux approches, nous vous proposons une évaluation naïve qui peut être utilisée pour évaluer les qualités de la cellule à la transplantation.
Le test des comètes ou unicellulaires électrophorèse sur gel, mesure les cassures de l’ADN dans les cellules. Incorporé dans l’agarose à bas point de fusion des cellules sont lysées à nucléoïdes formulaire contenant de l’ADN surenroulé. Lors de l’électrophorèse, petits morceaux de fragments d’ADN et des brins d’ADN cassés migre à travers les pores du gel d’agarose, alors que l’ADN intact, en raison de leur taille énorme et leur conjugaison avec la protéine de la matrice, aura une migration restreinte. Le modèle de l’ADN tachée sous un microscope à fluorescence imite une comète. La tête de la comète contient l’ADN intact et la queue est composée de fragments et cassée brins d’ADN. La fraction des dommages à l’ADN peut être mesurée par l’intensité de la fluorescence de l’ADN endommagé (queue de comète) par rapport à l’intensité de (tête de la comète) ADN intacte. Le moment de queue de paramètre peut être calculé comme indiqué à la Figure 1.
Dommages à l’ADN induit la phosphorylation de l’histone H2A. X (γH2A.X) sur le Ser139 par les kinases ATM, ATR et ADN-PK. La phosphorylation et le recrutement de H2A. X à ruptures de brins d’ADN est appelée réponse aux dommages de l’ADN (DDR) et arrive rapidement après que l’ADN est endommagé. Suite à ce processus, l’arrestation d’induite par le point de contrôle de cycle de cellules et l’ADN, processus de réparation sont initiées. Après l’achèvement de la réparation de l’ADN, γH2A.X est déphosphorylée et inactivé par les phosphatases. Prolongée et plusieurs brins d’ADN conduisent à l’accumulation de foyers γH2A.X dans l’ADN. Cela indique l’incapacité de la cellule pour réparer les lésions de l’ADN et la perte d’intégrité de l’ADN. Ces foyers γH2A.X dans l’ADN peuvent être identifiés par et le nombre de foyers DDR peut être compté en utilisant le protocole à l’article 2.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsine</td><td>Corning</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Lame à 8 puits</td><td>Millicell</td><td>PEZGS0816</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td>Solution de détachement cellulaire</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG</td><td>Jackson Immuno Research Laboratories</td><td>711-545-152 (RRID : AB_2313584)</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson</td><td>Immuno Research Laboratories</td><td>711-165-152 (RRID :AB_2307443)</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9564</td><td></td></tr><tr><td>Gibco B-27 Supplement, Serum Free,Gibco</td><td></td> <td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel growth factor reduced</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Phalloïdine A488</td><td>Technologie de la vie</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-histone H2A. X (Ser139)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire d’anticorps</td><td>2577 (RRID : AB_2118010)</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>SYBR&nbsp ; Vert I colorant gel d’acide nucléique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9430</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher scientific</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Low melting point Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Antifade</td></tr></tbody></table>

Évaluer l’intégrité de l’adn de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Tige et cellules cellules souches dérivées ont un potentiel immense comme une thérapie régénératrice pour diverses maladies dégénératives. L’ADN est l’entrepôt de données génétiques dans toutes les cellules, y compris les cellules souches, et son intégrité est fondamentale pour sa capacité régénératrice. Cellules souches subissent une propagation rapide dans les laboratoires pour obtenir les numéros nécessaires à la transplantation. La croissance cellulaire accélérée conduit à la perte d’intégrité de l’ADN par des métabolites accumulés, comme réactives de l’oxygène, carbonyle et des agents alkylants. La transplantation de ces cellules se traduirait par la mauvaise prise de greffe et régénération de l’orgue de détérioration. Repiquage en outre, les cellules endommagées par ADN conduit à des mutations, l’instabilité de l’ADN, la sénescence cellulaire et éventuellement mortelles maladies comme le cancer. Par conséquent, il y a un besoin immédiat d’une méthode de contrôle de la qualité évaluer les qualités de la cellule à la transplantation. Ici, nous fournissons des protocoles étape par étape pour l’évaluation de l’intégrité de l’ADN des cellules souches avant la transplantation de cellules.

Cellules souches humaines pluripotentes induites ont été cultivés, et les dommages à l’ADN et le moment de la queue, qui ont été utilisés comme mesure d’intégrité de l’ADN, ont été analysées par le test des comètes. CSPI ont été intégrés dans l’agarose de la bas-fondre-point et placé sur une lame de verre. Les cellules ont, ensuite, traitées avec tampon de lyse, suivie par une solution alcaline, à obtenir l’ADN surenroulé. Nucléoïdes étaient grande et comètes ont été visualisées par le co...

Ici, nous fournir une description détaillée d’un montage expérimental pour une analyse de l’évaluation de l’intégrité de l’ADN dans les cellules avant la transplantation de cellules souches.

Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

Pour les maladies néonatales telles que la cardiomyopathie, la thérapie régénérative utilisant des cellules souches pluripotentes induites a un potentiel énorme. Cependant, la croissance accélérée in vitro de cellules mène aux dommages d’ADN par les métabolites accumulés tels que les espèces réactives d’oxygène. La transplantation de ces cellules endommagées par l’ADN entraînerait un mauvais engraftment et une régénération de l’organe.Avant la transplantation, la qualité des cellules doit être évaluée. Ici, nous fournissons deux protocoles étape par étape pour évaluer les dommages à l’ADN dans les cellules souches. Jessica Miller, chercheuse, Nikhil Mardhekar, chercheur, et Vasanthi Rajasekaran, technicienne de laboratoire, démontreront les procédures.Pour commencer, placez 500 milligrammes d’agarose à faible fonte dans 100 millilitres d’eau libre d’ADN-ARN. Chauffer la bouteille au four à micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve. Ensuite, placez la bouteille dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que nécessaire.Pour préparer des diapositives de comète pré-enduites, placez quelques gouttes de 0,5 % sur une glissière en verre. Étendre immédiatement l’agarose pour former une fine couche de revêtement agarose à l’aide d’un coverslip. Travaillant dans des conditions de faible lumière pour éviter les dommages cellulaires induits par la lumière ultraviolette, mélangez 10 microlitres de suspension cellulaire et 90 microlitres de solution d’agarose dans un tube.Placez le tube dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour empêcher l’agarose de se solidifier. Mélanger la solution sans introduire de bulles d’air, et pipette 70 microlitres par tache sur la glissière de comète pré-enduite. À l’aide d’une pointe de pipette, étendre le mélange d’agarose cellulaire pour former une fine couche.Placez la glissade à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans un récipient, submergez complètement la lame dans un tampon de lyse froide. Placez le récipient dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant une heure.Remplacez le tampon de lyse par une solution alcaline froide. Assurez-vous que les glissières sont complètement submergées. Après avoir laissé le récipient dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant encore 30 minutes, placez la lame dans un réservoir horizontal d’électrophoresis.Remplissez le réservoir d’électrophoresis alcalin froid jusqu’à ce que les glissières soient complètement submergées. Appliquer la tension à un volt par centimètre pendant 15 à 30 minutes. Dans un récipient, submerger complètement la lame dans de l’eau déionisée froide.Après deux minutes, retirer l’eau déionisée et ajouter l’eau déionisée fraîche, puis répéter cette étape une deuxième fois. Ensuite, remplacez l’eau déionisée par de l’éthanol froid à 70 %. Après cinq minutes, retirer délicatement la lame sans l’incliner et la laisser sécher à l’air libre.Une fois séché, ajouter 100 microlitres de colorant d’ADN dilué à chaque endroit, et attendre 15 minutes à température ambiante. À l’aide d’un filtre FITC au microscope à épifluorescence, prendre des images de 50 à 100 comètes au total par échantillon. Cardiomyocytes iPS-dérivés de culture tels que décrits dans le protocole de texte.Pour voir les cardiomyocytes dérivés de l’iPS dans les diapositives de chambre, jetez d’abord le milieu de culture des puits, et lavez les cellules trois fois avec PBS. Ajouter un millilitre de 0,25% trypsine par puits, et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Vérifiez la plaque au microscope pour le détachement cellulaire.Ajouter ensuite un millilitre de CMM pour arrêter la Trypsine. Placez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et 200 fois g. Jetez le milieu, ajoutez un millilitre de CMM et résépendez les cellules.Comptez les cellules et ajustez le nombre de cellules pour obtenir deux millions de cellules dans 1,6 millilitres de CMM. Maintenant, les graines 200 microlitres de suspension cellulaire par puits de la diapositive de chambre de huit puits. Appuyez doucement sur la glissière pour étendre les cellules autour du puits.Incuber les cellules à 37 degrés Celsius. Pour le traitement de doxorubicine de cardiomyocyte iPS-dérivé, jetez le milieu de culture des puits de cardiomyocyte iPS-dérivés, et lavez les cellules avec PBS. Traiter les cellules avec de la doxorubicine d’un micromolaire pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.Aspirer le milieu, et laver les cellules avec PBS. Pour effectuer l’immunolabeling, lavez les cellules trois fois avec PBS et ajoutez 200 microlitres de paraformaldéhyde fraîchement préparé à chaque puits. Fixer les cellules pendant 20 minutes dans l’obscurité à température ambiante.Après avoir lavé les cellules avec PBS, ajouter 200 microlitres de tampon de blocage par puits, et bloquer pendant 30 minutes dans une chambre humidifiée à température ambiante. Retirez le tampon de blocage et ajoutez 200 microlitres de solution d’anticorps primaire. Après avoir couvé pendant 45 minutes dans une chambre sombre humidifiée à température ambiante, lavez les puits trois fois avec du PBS.Retirer le PBS et ajouter 200 microlitres de mélange secondaire d’anticorps. Incuber pendant 45 minutes dans une chambre sombre humidifiée à température ambiante. Ensuite, lavez les puits trois fois avec PBS.Laver à l’eau déionisée avant de monter les toboggans à l’antifade. Placez un verre de couverture et rangez les glissières dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. À l’aide d’un microscope confocal, prenez trois à cinq images de champs aléatoires par échantillon et procédez à l’analyse d’images.Pour compter les foyers de réponse aux dommages à l’ADN, téléchargez et installez CellProfiler. Sélectionnez fichier, importation, pipeline à partir du fichier, et choisissez le fichier pipeline nommé perncti gamma-H2AX. Faites glisser et déposer le dossier contenant les images acquises des foyers gamma-H2AX à la fenêtre de liste de fichiers dans la section images des modules d’entrée pour analyse.Suivez ensuite les instructions indiquées dans le protocole texte. Pour définir les paramètres des images, faites glisser l’image désirée pour analyse sur la liste des fichiers. Sous modules d’entrée, sélectionnez des images.Également dans les modules d’entrée, sélectionnez les métadonnées, puis sélectionnez les noms et les types. Pour les groupes, sélectionnez non. En travaillant dans des modules d’analyse, sélectionnez couleur à gris.Sélectionnez ensuite lisse, sélectionnez identifier les objets primaires, et sélectionnez à nouveau lisse. Sélectionnez ensuite améliorer ou supprimer les fonctionnalités, puis sélectionnez identifier les objets primaires. Toujours en cours de travail dans les modules d’analyse, sélectionnez relier des objets, puis classer les objets, et enfin sélectionner l’exportation vers la feuille de calcul.Cliquez sur analyser les images en bas à gauche pour effectuer l’analyse d’image. À la fin de l’analyse, plusieurs images sont générées. Notez le fichier CSV qui est généré et enregistré à l’emplacement approprié sur l’ordinateur.Ce fichier contient les données quantitatives pour une analyse plus approfondie. Dans la feuille de calcul appelée mon image d’expérience, la colonne B aura le nombre de noyaux qui ont jusqu’à cinq ponctions, et la colonne D aura le nombre de noyaux qui ont plus de cinq ponctions. Ajouter les colonnes B et D pour obtenir le nombre total de noyaux.Répétez ces étapes pour toutes les images, en changeant le nom de fichier de mon expérience avant chaque analyse. Des micrographes représentatifs de comètes provenant de cellules iPS traitées au doxo et non traitées sont présentés ici. Une quantité basale de dommages d’ADN a été trouvée dans les cellules d’iPS, exprimées comme une fraction des dommages d’ADN et du moment de queue.Cependant, le traitement doxo a augmenté les dommages à l’ADN dans les cellules iPS comme prévu, ce qui indique que l’essai de comète peut être utilisé pour évaluer l’intégrité de l’ADN dans les cellules souches pluripotentes. Des micrographes représentatifs de l’immunolabeling gamma-H2AX sont montrés ici, au grossissement inférieur et au grossissement plus élevé. Dans les cardiomyocytes iPS-dérivés de contrôle, plus de 90% des cellules ont eu moins de cinq foyers de DDR par noyaux.Et un total de moins de 10% des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux. Pour les cardiomyocytes dérivés de l’iPS cultivés pendant six mois, moins de 90% des cellules avaient jusqu’à cinq foyers DDR par noyaux, et un total de plus de 13% des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux. Alors que dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPS traités par doxo, moins de 80% des cellules avaient jusqu’à cinq foyers DDR par noyaux.Et un total d’environ 24% des cellules avaient plus de six foyers DDR par noyaux. Ces données indiquent que la culture prolongée des cellules cardiomyocytes dérivées de l’iPS et le traitement doxo ont causé des dommages significatifs à l’ADN, les rendant inadaptés à la transplantation cellulaire. Il est très important d’éviter les variables tout en mélangeant la suspension cellulaire, car cela pourrait affecter l’électrophoresis.Après cette procédure, vous pouvez effectuer les analyses de comète et les procédures d’immunolabeling avec des cellules de différents types. Ces techniques permettront d’évaluer les cellules de toutes sortes pour les dommages causés par l’ADN avant d’être utilisées dans des études de transplantation cellulaire.

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Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

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Isolement de noyaux à partir de cellules progénitrices cardiaques de souris pour le profilage de l’épigénome et de l’expression génique à une résolution unicellulaire

Apprenez à évaluer l'intégrité de l'ADN dans les cellules souches iPS avant transplantation cardiaque. Ces protocoles détaillés utilisent le test des comètes et l'immunomarquage γ-H2AX pour garantir la qualité cellulaire.

Évaluer l’intégrité de l’ADN de cellules souches pour la thérapie cellulaire cardiaque

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