Name: Culture de cellules primaires de neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Apprenez à purifier et cultiver des neurones GABAergiques et glutamatergiques primaires par tri cellulaire activé par fluorescence. Cette méthode permet d'étudier la physiologie neuronale et le développement des réseaux synaptiques.

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Les auteurs remercient l’excellent support technique fourni par Jenny Kirsch et Ana Teichmüller au centre de cytométrie en flux, Deutsches Rhumma-Forschungszentrum, Berlin. Nous aimerions remercier Jie Song pour son aide à l’analyse de la survie. Nous aimerions également remercier Rita Loureiro pour son aide à capturer les images de souris fluorescentes et Christian Ebner pour la lecture critique du protocole. Les rats transgéniques VGAT-venus ont été générés par les Drs Y. Yanagawa, M. Hirabak et Y. Kawaguchi dans l’Institut national des sciences physiologiques, Okazaki, Japon, en utilisant pCS2-venus fourni par le Dr A. Miyawaki. Ce travail a été appuyé par le Conseil allemand de la recherche (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 à IV).

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Nous décrivons ici une méthode qui combine le tri et la culture des neurones primaires pour générer des cultures cellulaires neuronales purifiées. Cette méthode prend environ 1 h de plus qu’un protocole typique de culture neuronale dissociée primaire mais permet la génération de centaines de cultures répliquées contenant des types neuronaux spécifiques. Les neurones purifiés, qui peuvent être cultivés isolément pendant au moins 16 jours, étendent les axones et les dendrites et peuvent déclencher des trains répétitifs de potentiels d’action (figure 2 et figure 3). Il est important de noter que ces cellules se prêtent aux mêmes analyses expérimentales que les cultures neuronales dissociées primaires régulières, y compris les analyses électrophysiologiques, morphologiques et de survie. Un avantage majeur de travailler avec ces cultures purifiées est que le développement de types cellulaires spécifiques peut être étudié isolément. Pour soutenir le développement des cultures purifiées, nous présentons également un protocole pour la co-culturing des neurones purifiés avec des cellules gliales. Comme indiqué précédemment, la co-culture des neurones purifiés avec des cellules gliales améliore leur survie, leur croissance et peuvent favoriser la formation du réseau7 (figure 4). Ainsi, nous présentons ici une combinaison de méthodes qui devraient poursuivre l’étude des interactions de la Glia-Neuron et peuvent s’avérer utiles pour étudier le développement et l’interaction entre d’autres types de cellules d’intérêt.
Des études sur les cultures de neurones glutamatergiques purifiés ont révélé des informations fondamentales sur la façon dont les cellules gliales sécrètent des facteurs qui favorisent le développement de réseaux neuronaux et la formation de Synapse16,17,18 . En général, les méthodes de purification des types de neurones spécifiques ont été plus efficacement appliquées à l’étude du développement des neurones glutamatergiques plutôt que des neurones GABAergiques. Cela a entraîné une disparité dans notre compréhension de la façon dont ces deux types de cellules se développent. Étant donné que les neurones GABAergiques et glutamatergiques diffèrent significativement en termes d’anatomie, de physiologie et d’origine développementale, il est vital que nous étudions les neurones GABAergiques à part entière, pour mieux comprendre leur fonction et leur physiologie. En utilisant le protocole présenté ici, nous avons déjà identifié des différences importantes dans la façon dont les neurones GABAergiques et glutamatergiques dépendent des facteurs sécrétés par la Glia pour l’établissement de la transmission synaptique7. En publiant ce protocole, nous espérons que d’autres pourront approfondir les interactions importantes entre les neurones et les cellules gliales.
Dans ce protocole, nous décrivons une méthode de tri cellulaire basée sur la cytométrie en flux, que nous avons utilisée pour purifier les neurones GABAergiques ou glutamatergiques de différentes lignées de rongeurs transgéniques. Les neurones GABAergiques positifs venus ont été triés à partir des souris VGAT venus13 ou des rats8 et des neurones glutamatergiques positifs tdtomato ont été triés à partir de nexcre; Les souris Ai9 (produites à l’origine à partir des lignées de reporter NexCre9 et Ai96, voir Turko et coll., 20187). Ces dernières années, en raison des progrès technologiques, la génération d’animaux transgéniques est devenue beaucoup plus facile. En tant que tel, la disponibilité des animaux exprimant des molécules fluorescentes, dans de nombreux types de cellules différentes, a augmenté rapidement. Cela a, à son tour, accru l’utilisation et l’applicabilité du tri des cellules fluorescentes activées. Alors que d’autres méthodes d’isolement des cellules d’intérêt existent actuellement16,19,20, elles sont quelque peu entravées par leur dépendance à l’égard de la disponibilité d’anticorps appropriés pour les surfaces naturelles Antigènes. Cela limite leur polyvalence par rapport aux méthodes de tri cellulaire basées sur la fluorescence, qui peuvent déjà être utilisées pour trier les cellules des nombreux animaux de reporter transgéniques spécifiques à la cellule qui sont déjà disponibles. Néanmoins, lorsqu’il est optimisé, les méthodes de tri basées sur les anticorps peuvent être rapides et à rendement élevé, et peuvent même mieux préserver l’anatomie des cellules, en permettant la purification des cellules avec leurs axones et leurs dendrites intactes21. Les méthodes de tri des anticorps doivent donc encore être prises en compte lors de la décision d’une stratégie de tri. En fin de compte, le type de cellule d’intérêt, l’âge auquel les cellules doivent être triées, la disponibilité d’animaux transgéniques ou d’antigènes de surface et le nombre de cellules nécessaires seront les facteurs déterminants lors du choix de la stratégie de tri la plus appropriée.
Bien que le tri cellulaire à base de fluorescence soit une méthode simple et reproductible pour purifier les cellules, il faut prendre soin de certaines étapes du protocole pour préserver la qualité des cellules. Par exemple, après chaque étape de centrifugation, il est important de s’assurer que le culot de la cellule est re-suspendu aussi rapidement que possible et que les cellules ont été récupérées avec succès. Occasionnellement, le culot de la cellule peut être perturbé lors du retrait du surnageant. Il est donc conseillé, entre les étapes de centrifugation, de vérifier la présence de cellules sous le microscope pour exclure toute perte de cellules importante. Après le placage cellulaire, les cellules doivent être autorisées à adhérer pendant au moins 1 h avant l’alimentation. Si les cellules sont alimentées trop tôt, certaines cellules peuvent se déloger de la Coverslip, réduisant ainsi la densité de culture. Après 1 h en culture, il est prudent d’évaluer la santé des cellules. Si les cellules ne semblent pas saines (un exemple de cellules saines est montrée dans la figure 2a), ou il y a une mort significative de cellules, alors ceci peut être une indication d’un problème pendant la procédure de dissociation ou de tri. Une autre considération importante, lors de la culture de n’importe quel type de cellule, est de prendre soin lors de la gestion des milieux de cultures cellulaires. Le support NBA contient du rouge de phénol, qui agit comme un indicateur de pH22. Si le média devient trop jaune en couleur, cela indique que le pH est trop acide; Si le média devient trop rose, cela indique que la solution est trop alcaline. Les solutions de stock ouvertes pendant de longues périodes, en particulier les supports alicités dans les tubes coniques, tendent à devenir plus alcalines au fil du temps. Il est donc conseillé de faire des nouveaux médias complets de la NBA chaque semaine et des médias complets toutes les deux semaines (les tampons moyens dans des conditions atmosphériques et devraient donc être plus stables). En tenant compte de ces points, il devrait être possible d’établir des cultures cellulaires purifiées dans n’importe quel laboratoire ayant accès au tri cellulaire et à l’équipement de culture cellulaire.
Dans la majorité de nos expériences, nous avons produit des cultures purifiées à partir d’un seul animal. Cependant, lors de l’épuration des cellules pour les analyses biochimiques, il peut être nécessaire de regrouper plusieurs animaux pour le tri. Nous avons réussi à trier jusqu’à 8 souris embryonnaires (jour embryonnaire 13 animaux) en utilisant le protocole ci-dessus (données non affichées). Toutefois, si l’on veut Trier davantage d’animaux, il peut être nécessaire d’augmenter le volume des solutions de papaïne et de BSA (décrites aux étapes 2.1.1 – 2.1.4) pour tenir compte de l’augmentation de la quantité de tissu. En outre, si plus de cellules sont plaquées dans la culture, alors un calendrier d’alimentation plus fréquent peut être exigé. Comme point de départ, les cellules peuvent être alimentées tous les 7 jours en enlevant 100 μL de support conditionné et en ajoutant 200 μL de nouveaux médias complets de la NBA. Pour le bien de la viabilité du neurone, si l’on trie plus d’animaux, il faut penser à minimiser le temps de tri autant que possible. Cela nécessite souvent l’optimisation minutieuse des analyses en aval pour une utilisation efficace des cellules purifiées. Nous avons régulièrement trié les neurones de souris à des taux de 600 événements/s, jusqu’à 500000 – 800 000 cellules par animal (jour postnatal 0 – 2). Cependant, ce n’était pas une optimisation exhaustive des vitesses et des conditions de tri. Par conséquent, d’autres améliorations de la vitesse de tri et du rendement devraient être possibles.
Les neurones purifiés ont besoin de milieux conditionnés pour leur survie. Cela a été démontré précédemment en cultivant les neurones et les cellules gliales séparément, avant de traiter les neurones avec des médias conditionnés gliales10. Dans nos expériences, nous avons choisi de soutenir les neurones purifiés en cultivant des cellules gliales sur des inserts de culture cellulaire semi-perméables, qui sont placés à l’intérieur de la plaque de culture cellulaire. Cette méthode a été appliquée avec succès pour étudier les protéines de matrice extracellulaire dérivées de la Glia et leur interaction avec les neurones12. Le soutien sans contact, mais continu fourni par cette méthode a un certain nombre d’avantages par rapport à la culture distincte des cellules. Plus particulièrement, la co-culture des cellules gliales avec des neurones permet la régulation et le conditionnement continus des milieux de culture cellulaire, ce qui ressemble plus étroitement à la situation in vivo. En outre, la co-culture continue des cellules permet la signalisation potentielle de rétroaction entre les neurones et la Glia, ce qui n’est pas possible dans les cultures séparées. Dans notre protocole, si nécessaire, la méthode de co-culture continue peut être facilement omise et un traitement classique des neurones avec des médias conditionnés par la Glia peut être effectué.
En résumé, le protocole présenté ici vise à fournir au lecteur une base solide à partir de laquelle ils peuvent établir leurs propres expériences de culture cellulaire purifiée. Nous prévoyons que la disponibilité des animaux transgéniques et des constructions virales continuera d’augmenter dans un avenir prévisible. Par conséquent, les techniques de tri cellulaire basées sur la fluorescence sont susceptibles de devenir encore plus largement utilisées et précieuses.

Le tri cellulaire est un outil puissant pour l’isolement des cellules vivantes d’intérêt à partir d’un mélange hétérogène de cellules. Les cellules peuvent être triées en fonction des critères de taille et de forme, ainsi que l’expression des marqueurs fluorescents1,2. Souvent, les anticorps conjugués au fluorophore sont utilisés pour étiqueter des types de cellules distincts en ciblant les antigènes de surface spécifiques aux cellules3,4. Alternativement, les animaux transgéniques ou les systèmes d’administration virale ont été conçus pour exprimer des fluorophores sous des promoteurs spécifiques à la cellule5,6. Historiquement, le développement d’outils et d’animaux transgéniques était coûteux et chronophage. Plus récemment, la baisse des coûts et la diminution des difficultés techniques ont entraîné une augmentation spectaculaire du nombre de lignes de reporter disponibles. Comme la disponibilité des outils transgéniques et des animaux rapporteurs continue de croître, l’utilité et l’applicabilité des méthodes de tri des cellules basées sur la fluorescence devraient aussi être utiles.
Nous avons récemment démontré que le tri cellulaire des animaux transgéniques peut être systématiquement appliqué pour purifier les neurones primaires en préparation à la culture cellulaire7. En triant des cellules de rats ou de souris, nous avons pu isoler et culture des neurones fluorescents, qui expriment des protéines de reporter fluorescentes spécifiquement dans les neurones GABAergiques ou glutamatergiques6,8,9. En étudiant ces cultures neuronales purifiées, nous avons pu identifier une différence importante dans la façon dont les neurones GABAergiques et glutamatergiques dépendent des facteurs sécrétés par la Glia pour l’établissement de la transmission synaptique7. En outre, en co-culturant des cellules gliales avec des neurones purifiés, nous avons pu étendre sur les observations précédentes démontrant le rôle critique que les cellules gliales jouent dans la croissance et la survie des neurones10,11. Ainsi, grâce à une combinaison de tri cellulaire et de culture cellulaire, nous avons pu étudier non seulement le développement de types spécifiques de neurons isolés, mais nous avons pu étudier l’influence des cellules gliales sur leur fonction.
Nous présentons ici un protocole pour la purification et la culture des neurones GABAergiques et glutamatergiques du cortex et de l’hippocampe de souris transgéniques ou de rats. Nous présentons également une méthode pour la co-culture sans contact des neurones purifiés et des cellules gliales, adaptée de Geissler et coll.12. Afin de générer des cultures GABAergiques purifiées, nous avons trié les neurones fluorescents des rats VGAT-venus-A Wistar8 ou vgat-venus13, qui expriment sélectivement une variante de protéine fluorescente jaune améliorée (Vénus) dans > 95% des neurones GABAergiques corticaux. Pour générer des cultures glutamatergiques purifiées, nous avons trié les neurones fluorescents de NexCre; Ai9 souris6,9, qui expriment tdtomato dans les neurones corticaux glutamatergiques. L’ensemble de la procédure de tri et de culture peut être réalisée dans les 3-4 h et peut être utilisée pour générer des centaines de cultures répliquées adaptées à l’analyse électrophysiologique, morphologique et de survie cellulaire. La méthode est simple, reproductible et peut produire des cultures neuronales purifiées qui sont supérieures à 97% pur pour le type de cellule d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>Milieu basal A neural (NBA)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10888022</td><td>Tampon de culture cellulaire</td></tr><tr><td>B27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>Supplément de culture</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>35050-038</td><td>Supplément de culture</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotique</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>SIGMA</td><td>P1399</td><td>Revêtement de lamelle</td></tr><tr><td>Papaïne</td><td>SIGMA</td><td>P4762-1G</td><td>Enzyme</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>SIGMA</td><td>A3294-100G</td><td>Hibernation sérique</td></tr><tr><td>A Milieu à faible fluorescence</td><td>Brain Bits Ltd</td><td>HALF</td><td>Cell Milieu de transport</td></tr><tr><td>Dulbeccos Modified Eagles (DMEM)</td><td>Biochrom</td><td>F0435</td><td>Tampon de culture gliale</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Biochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>Sérum Trypsine/EDTA</td><td>Biochrom</td><td>L2163</td><td></td></tr><tr><td>Enzyme Pointe fine Pipette Pasteur</td><td>Neo Labs-Utilisé</td><td></td> <td>pour la trituration des cellules Plaques à</td></tr><tr><td>24 puits</td><td>BD</td><td>353047</td><td>Plaque de culture</td></tr><tr><td>50 mL Tubes Falcon</td><td>BD</td><td>352070-15</td><td></td></tr> <tr><td>mL Tubes Falcon</td><td>BD</td><td></td><td>352096-Lamelles</td></tr> <tr><td>en verre : 12 mm rond</td><td>Roth</td><td>P231.1-35</td><td></td></tr> <tr><td>mm Boîte de Pétri</td><td>Corning</td> <td>353001-100</td><td></td></tr> <tr><td>mm Boîte de Pétri</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>353003-30 &micro ; m CellTrics Cell Sieve</td><td>sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>Pour éliminer les amas cellulaires avant le tri cellulaire</td></tr><tr><td>Tubes en polystyrène à fond rond</td><td>BD</td><td>352054</td><td>Tube de transport pour cellules triées</td></tr><tr><td>Tubes en polypropylyne à fond rond</td><td>BD</td><td>352063</td><td>Tube de collecte pour cellules triées</td></tr><tr><td>Inserts de culture cellulaire &ndash ; 0,4 &micro ; m PET transparent</td><td>Falcon</td><td>353 095</td><td>Pour la co-culture de neurones et de cellules gliales</td></tr><tr><td>Ciseaux de Bonn extra fins</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14084-08</td><td>Pour enlever la peau et les os sus-jacents des souris</td></tr><tr><td>Ciseaux extra étroits</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14088-10</td><td>Pour enlever la peau et les os sus-jacents des rats</td></tr><tr><td>Pinces</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>11242-40</td><td>Pour maintenir la tête en place</td></tr><tr><td>Spatule (130 mm de long/5 mm de largeur de pointe)</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>3006.1</td><td>Pour enlever le cerveau au papier filtre</td></tr><tr><td>Lames de scalpel</td><td>Swan-Morton</td><td>#0308</td><td>Pour dissocier mécaniquement le tissu neural</td></tr><tr><td>Hémocytomètre (Neubauer Imroved)</td><td>Optik</td> <td>Labor-To</td> <td>cell count cellules dissociées</td></tr><tr><td>Fluorescent Miners Lunettes (lumière d’excitation)</td><td>Equipement de laboratoire biologique Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FHS/LS-1G</td><td>To excite TdTomato</td></tr><tr><td>Fluorescent Miners Goggles (filtre d’émission)</td><td>Equipement de laboratoire biologique Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FHS/EF-4R2</td><td>Td Tomato compatible Filtre d’émission</td></tr><tr><td>Fluorescent Miners Goggles (lumière d’excitation)</td><td>Equipement de laboratoire biologique Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FS/ULS-02B2</td><td>Pour exciter</td></tr><tr><td>Venus Fluorescent Miners Lunettes (filtre d’émission)</td><td>Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS)</td><td>FS/TEF-3GY1</td><td>Filtre d’émission compatible Venus</td></tr><tr><td>Souris-Anti-GFP Anticorps primaires</td><td>UC Davis</td><td>75-132</td><td>Pour améliorer le signal de Vénus après fixation</td></tr><tr><td>Souris-Anti-GFAP Anticorps primaires</td><td>SIGMA</td><td>G-3893</td><td>L’identification des astrocytes réactifs</td></tr><tr><td>Anticorps primaires Rabbit-Anti-CD11b</td><td>Southern Biotech</td><td>1561-15</td><td>L’identification des cellules microgliales</td></tr><tr><td>Anticorps primaires Rabbit-Anti-MBP</td><td>Millipore</td><td>AB980</td><td>L’identification des oligodendrocyes</td></tr></tbody></table>

culture de cellules primaires de neurones gabaergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence

Primary Cell Culture of Purified GABAergic or Glutamatergic Neurons Established through Fluorescence-activated Cell Sorting

L’objectif général de ce protocole est de générer des cultures neuronales purifiées dérivées de neurones GABAergiques ou glutamatergiques. Les neurones purifiés peuvent être cultivés dans des milieux définis pendant 16 jours in vitro et se prêtent à toutes les analyses généralement effectuées sur des cultures dissociées, y compris les analyses électrophysiologiques, morphologiques et de survie. Le principal avantage de ces cultures est que les types de cellules spécifiques peuvent être étudiés sélectivement en l’absence d’influences externes complexes, telles que celles provenant de cellules gliales ou d’autres types de neurone. Cependant, lors de la planification d’expériences avec des cellules purifiées, il est important de noter que les neurones dépendent fortement des milieux conditionnés par la Glia pour leur croissance et leur survie. En outre, les neurones glutamatergiques dépendent davantage des facteurs sécrétés par la Glia pour l’établissement de la transmission synaptique. Nous décrivons donc également une méthode de co-culturing des neurones et des cellules gliales dans un arrangement sans contact. En utilisant ces méthodes, nous avons identifié des différences majeures entre le développement des réseaux neuronaux GABAergiques et glutamatergiques. Ainsi, l’étude des cultures des neurones purifiés a un grand potentiel pour approfondir notre compréhension de la façon dont le système nerveux se développe et fonctionne. En outre, les cultures purifiées peuvent être utiles pour enquêter sur l’action directe des agents pharmacologiques, des facteurs de croissance ou pour explorer les conséquences des manipulations génétiques sur des types de cellules spécifiques. Comme de plus en plus d’animaux transgéniques deviennent disponibles, l’étiquetage des types de cellules spécifiques supplémentaires d’intérêt, nous nous attendons à ce que les protocoles décrits ici vont croître dans leur applicabilité et le potentiel.

La dissociation et le tri cellulaire des neurones fluorescents de la souris transgénique ou du tissu cortico-hippocampal de rat peuvent être effectués en approximativement 3 – 4 h. Le résultat est une population de neurones fluorescents très purs, qui peuvent être cultivés en culture pendant 16 jours.
Pour générer des cultures purifiées, les animaux transgéniques ont été identifiés pour la première fois à l’aide d’une lampe fluorescente avec des filtres appropriés (exemples de VGAT néonatales fluorescentes Vénus et NexCre; Les chiots de souris Ai9 sont montrés dans la figure 1a). Après l’identification des animaux transgéniques, les tissus disséqués ont été dissociés et les neurones les plus fortement fluorescents ont été triés pour produire une population cellulaire purifiée. Exemple de diagrammes de points d’intensité de fluorescence pour NexCre; Les neurones souris Ai9 et VGAT venus, obtenus pendant le FACS, sont montrés dans la figure 1b. Lorsqu’il est optimisé, il est possible de récolter entre 500 000 et 800 000 cellules du cortex et de l’hippocampe de l’individu P0-2 NexCre; Souris Ai9 ou VGAT Vénus. Les cellules peuvent être triées à une vitesse vers le haut de 600 événements/s. les estimations de la pureté des cellules ont été effectuées en utilisant le DAPI comme marqueur nucléaire (figure 1c). En triant des cellules fortement positives, une pureté de plus de 97% peut être obtenue systématiquement7.
Après un tri réussi, les neurones plaqués doivent apparaître en forme ronde, avoir une membrane lisse et doivent être vus pour pousser les neurites après environ 1 h in vitro (figure 2a, B). Par 7 jours in vitro, bien que certains décès cellulaires puissent être apparents, des cellules viables devraient être présentes dans toutes les conditions de culture (Figure 2c, D). À 12 – 16 jours in vitro, à l’aide d’enregistrements de pinces à cellules entières et de remplissage de biocytine15, il est possible d’étudier le développement morphologique et électrophysiologique des neurones purifiés (figure 3). L’analyse des cultures purifiées révèle que les neurones glutamatergiques et GABAergiques ont pu étendre les axones et les dendrites de leurs corps cellulaires (figure 3A, B) et conserver la capacité de générer des potentiels d’action en réponse à d’injections de courant dépolarisant supraliminaires (figure 3C, D). Toutefois, à la suite de la purification, seuls les neurones GABAergiques ont reçu des quantités significatives de transmission synaptique spontanée, et les neurones glutamatergiques reçoivent très peu de transmission synaptique en l’absence de cellules gliales (figure 3e , F) le 7.
Comme nous l’avons signalé précédemment, les cellules des cultures purifiées tendent à survivre plus mal que celles des cultures non triées et ont des dendrites et des axones significativement plus petits7. Pour surmonter ces déficits, nous avons adapté et appliqué des méthodes pour soutenir le développement de cultures purifiées avec des cellules gliales12,14. La composition cellulaire de nos cultures de soutien gliales (DIV7) est illustrée à la figure 4a. Ces cultures contenaient principalement des astrocytes positifs de protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), mais contenaient aussi une grappe de molécules de différenciation (CD11b) positives de microglies et de protéine de base de myéline (MBP), des oligodendrocytes positifs. Après div 7, ces cellules peuvent être repiquées à des inserts de culture de cellules pour fournir le soutien sans contact des neurones purifiés (figure 4b, C). L’analyse des co-cultures de la Glia-Neuron révèle qu’environ 40 000 cellules gliales étaient suffisantes pour améliorer la survie et la croissance à long terme des neurones glutamatergiques et GABAergiques purifiés (figure 4D, E)7. En outre, l’analyse électrophysiologique révèle que les neurones glutamatergiques, co-cultivés avec des cellules gliales, étaient très actifs et avaient fortement augmenté l’activité du réseau (pourcentage de neurones glutamatergiques soutenus par le gliales déclenchant des rafales d’action potentiels: 62%; n = 28; Figure 4F , G). Le soutien glial est donc important non seulement pour la promotion de la croissance et de la survie des neurones, mais aussi pour la promotion de la transmission synaptique et l’établissement d’une activité réseau dans les cultures glutamatergiques.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig1.jpg"> Figure 1: purification des neurones glutamatergiques et GABAergiques. (A) images montrant le signal fluorescent de l’expression transgénique de TdTomato dans NexCre; Souris Ai9 (en haut) et Vénus en souris VGAT Vénus (en bas). Barres d’échelle = 5 mm. (B) diagrammes de dispersion d’intensité de la fluorescence TdTomato et de Vénus des cellules dissociées cortico-hippocampes de NexCre; Souris Ai9 (en haut) et souris VGAT Vénus (en bas). Les neurones tdtomato ou venus fortement fluorescents ont été sélectionnés pour le tri (indiqué par les boîtes de blocage). (C, gauche) Images confocales des neurones positifs triés TdTomato (Top) et venus (Bottom). (C, à droite) Image fusionnée montrant les cellules co-colorées avec DAPI (en pseudocouleur bleue). La fluorescence TdTomato est endogène et reste forte malgré la fixation (en pseudo-couleur magenta). L’expression de Vénus est améliorée en utilisant une combinaison d’un anticorps primaire dirigé contre le GFP et l’anticorps secondaire conjugué d’Alexa Fluor-488 (en pseudocouleur verte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig2.jpg"> Figure 2: culture cellulaire des neurones glutamatergiques ou GABAergiques purifiés. (A) les images infrarouges combinées (champ lumineux) et les signaux fluorescents superposés de TdTomato (à gauche) et de Vénus (droite) des neurones positifs cultivés pendant 1 h in vitro. Les flèches blanches indiquent l’emplacement des neurites en croissance. (B) les images confocales des neurones positifs de TdTomato (à gauche) et de Vénus (à droite) cultivés pendant 1 h in vitro. (C, D) Champ lumineux (en haut) et champ lumineux combiné et images fluorescentes (en bas) de TdTomato (C) et de neurones positifs venus (D) cultivés pendant 7 jours in vitro (DIV). Les flèches blanches montrent l’emplacement des noyaux condensés des cellules mortes. Les flèches colorées identifient les neurones marqués fluorescemment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig3.jpg"> Figure 3: propriétés morphologiques, électrophysiologiques et synaptiques des neurones purifiés. (A, B) Images confocales de TdTomato (A) et de neurones positifs venus (B) à DIV 13 et DIV 14, respectivement. Les cellules sont présentées en noir à l’aide d’une table de recherche inversée pour faciliter la visualisation des neurites. Les insets montrent le signal fluorescent exprimé par les neurones identifiés. (C, D) La réponse de tension d’un TdTomato (C) et de Vénus positif neurone (D) à hyperpolarisant (200 à-20 pA, en 20 pA pas) et dépolarisant (200 pA) impulsions de courant, obtenues par des enregistrements de patch-clamp à cellules entières. Les insets montrent les neurones enregistrés correspondants. Le potentiel membranaire au repos de chaque cellule est indiqué à gauche de la trace d’enregistrement. (E, F) Enregistrements de tension-clamp représentatifs (10 s) obtenus à partir de TdTomato (E) et de neurones positifs venus (F). Des événements postsynaptiques excitateurs spontanés (EPSCs) ont été enregistrés à partir de neurones positifs de TdTomato, maintenus à un potentiel de rétention de 50 mV. Des événements post-synaptiques inhibiteurs spontanément survenus (IPSC) ont été enregistrés à partir de neurones positifs venus maintenus à un potentiel de rétention de 0 mV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58974/58974fig4.jpg"> Figure 4: soutenir le développement du neurone avec la co-culture gliale. Aimages confocales de cultures gliales immunomarqué pour la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP, à gauche), grappe de molécule de différenciation (CD11b, milieu) et protéine de base de la myéline (MBP, droite). Les cellules gliales ont été cultivées pour DIV 7. (B) images d’inserts de culture cellulaire utilisés pour co-culture des cellules gliales avec des neurones purifiés dans un arrangement sans contact. (C) un schéma de l’agencement spatial utilisé pour la co-culture des neurones et des gliales. (D, E) Les images confocales des neurones positifs de TdTomato (D) et de Vénus (E), cultivées pendant 14 jours, en absence (à gauche) ou en présence (à droite) du support gliales. (F, G) Enregistrements de la pince de courant (60 s) des neurones positifs de TdTomato (F) et de Vénus (G) cultivés pendant 14 jours en absence (en haut) ou en présence (en bas) du support gliales. Les neurones ont été enregistrés à leur potentiel membranaire au repos (présenté à gauche de chaque trace d’enregistrement). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58974/58974fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

Ce protocole décrit une méthode basée sur le tri cellulaire pour la purification et la culture des neurones GABAergiques fluorescents ou glutamatergiques du néocortex et de l’hippocampe de souris ou de rats postnatals.

Culture de cellules primaires de neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence

The overall goal of this protocol is to generate purified neuronal cultures derived from either GABAergic or glutamatergic neurons. Purified neurons can ...

Ce protocole décrit une méthode simple et reproductible pour purifier et culturer des types spécifiques de neurones primaires. Ces cultures conviennent à l’analyse électrophysiologique, morphologique et de survie. Les cultures de neurones purifiés peuvent être utilisées pour étudier les principes fondamentaux de la physiologie neuronale, la formation de synapses ainsi que la façon dont les réseaux neuronaux se développent.Tandis que nous nous concentrons sur les cellules principales glutamatergic corticales et les interneurones GABAergic, cette procédure peut être facilement modifiée pour étudier n’importe quelle lignée neuronale exprimant des protéines fluorescentes. Pour préparer des couvertures en verre, décongelez d’abord un aliquot de cinq millilitres de 200 microgrammes par solution millilitre de PLL. Diluer cette solution de stock à 20 microgrammes par millilitre en ajoutant 45 millilitres d’eau pure de qualité injection.Filtrez ensuite stérilisez la solution dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et étiquetez ce tube comme stérile PLL. Ensuite, placez 100 couvertures de verre stériles rondes de 12 millimètres dans la solution stérile PLL. Agiter le tube toutes les cinq à dix minutes pendant deux à trois minutes pour assurer un revêtement même.Après 40 minutes de revêtement PLL, prendre deux morceaux de papier de soie et les déposer à plat dans l’armoire d’écoulement. Stériliser le papier à l’aide de 70% d’éthanol puis aplatir pour enlever les plis et laisser sécher. Après avoir enduit les couvercles en verre pendant une heure avec PLL, retirer l’excès de solution PLL et ajouter de l’eau stérile de qualité injection.Agiter doucement les coverslips pendant deux à trois secondes pour enlever l’excès de PLL. Répétez cette étape de rinçage deux fois de plus. Retirer l’excès d’eau, puis transférer les coverslips sur le papier de soie stérile.Une fois secs, transférer les coverslips dans une plaque de culture de 24 puits. Pour préparer les solutions de culture cellulaire, mesurez 12 millilitres de tampon de culture cellulaire à un tube conique de 15 millilitres et étiquetez-les sous le nom de BSA. Mesurez cinq millilitres de tampon de culture cellulaire à un tube différent de 15 millilitres et étiquetez comme papain.Par la suite, incuber les deux tubes pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter 120 milligrammes de BSA au tube étiqueté BSA. Puis inverser le tube pour aider à dissoudre la solution.Ajouter ensuite sept milligrammes de papaïne au tube étiqueté papain. Remettre les deux tubes au bain d’eau pendant 15 minutes. Filtre stériliser la solution BSA dans un tube conique frais.Divisez la solution stérile BSA en trois tubes et étiquetez chaque tube comme stérile BSA et un, deux ou trois. Filtrez maintenant stérilisez le tube de papain et étiquetez le tube comme papain stérile. Remettre tous les tubes au bain d’eau et continuer à couver à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.Pour se préparer à la dissection tissulaire, mentez le scalpel, les ciseaux, les forceps et la spatule nécessaires à la dissection de l’hippocampe et du cortex. Placer deux boîtes de Pétri de 35 millimètres et une boîte petri de 100 millimètres contenant du papier filtre stérile dans l’armoire à écoulement. Recueillir le NexCre transgénique; Ai9 ou véhicule GABA transporteur Venus chiots souris qui doivent être disséqués à l’aide d’une lampe fluorescente avec excitation appropriée et filtres d’émission pour discriminer les chiots fluorescents de type sauvage compagnons litre.Immédiatement avant de disséquer les animaux, remplissez chaque boîte de Pétri d’un tampon de culture cellulaire stérile réfrigéré. Après la dissection, transférer soigneusement le cerveau du chiot transgénique dans un papier filtre stérile. Tout d’abord, disséquer le cervelet et séparer les deux hémisphères.Séparez ensuite soigneusement l’hippocampe et le cortex de chaque hémisphère. Transférer le tissu disséqué dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant un tampon de culture cellulaire réfrigérée. Ensuite, transférez l’hippocampe disséqué et le cortex au couvercle d’une autre boîte de Pétri de 35 millimètres.À l’aide du bord plat d’une lame de scalpel, hacher délicatement le tissu en mouvement sillonné jusqu’à ce qu’il ne reste que de petits morceaux. Ensuite, transférez le tissu haché avec une petite quantité de solution de papain du couvercle de la boîte de Petri au tube stérile de papain. Incuber le tissu à 37 degrés Celsius pendant 25 minutes.Après l’incubation de la papaine, transférer le tube stérile de papain et les tubes stériles de BSA à l’armoire d’écoulement. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur d’un millilitre pour transférer uniquement le tissu corticohippocampal du tube de papain dans le tube BSA. Afin de briser toutes les grandes touffes de tissu, triturer le tissu à plusieurs reprises à l’aide d’une pipette Pasteur d’un millilitre.Par la suite, triturer le tissu sept fois à l’aide d’une pipette pasteur fine pointe. Après 30 secondes, transférer un millilitre de la solution inférieure et du tissu du tube BSA un au tube BSA deux. Triturer le tissu dans le tube BSA deux fois à l’aide d’une pipette pasteur fine pointe.Après trituration, transférer un millilitre du tissu inférieur et la solution du tube BSA un au tube BSA trois. Triturer le tissu dans le tube BSA trois fois. Après trituration, transférer toute la solution et le tissu des tubes deux et trois dans le tube BSA un.Triturer deux à trois fois de plus et centrifugeuse à 3000 fois g pendant trois minutes. Après centrifugation, retirez soigneusement le supernatant du tissu granulé et resuspendez les cellules à l’aide d’une pipette P1000 en deux millilitres d’hibernation complète Un milieu de faible fluorescence. Puis triturer le tissu 20 fois pour assurer une résuspension complète de la solution tissulaire.Par la suite, déposez la suspension cellulaire à travers un tamis cellulaire de 30 micromètres dans un tube d’échantillon de polystyrène. Préparer les tubes de collecte de tri cellulaire en pipetant 300 microlitres de supports complets en hibernation A au nombre requis de tubes en polypropylène. Pour que chaque type de cellule fluorescente soit trié, choisissez les filtres d’excitation et d’émission appropriés.Excitez la protéine Venus à l’aide de la longueur d’onde d’excitation de 488 nanomètres et détectez la lumière émise à l’aide d’un ensemble de filtres à émissions de 530/40. Excitez la protéine TdTomato à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 531 nanomètres et détectez la lumière émise à l’aide d’un ensemble de filtres à émission 575/30. Pour une grande pureté, trier les cellules fluorescentes brillamment étiquetées.Après le tri cellulaire, transférer les cellules collectées dans deux tubes de centrifugeuse arrondis au fond millilitres. Puis centrifuger les cellules à 3000 fois g pendant trois minutes pour former une pastille cellulaire. Resuspendez la pastille cellulaire dans la quantité requise de milieu NBA complet préchauffé pour atteindre une densité cellulaire de 1000 cellules par microlitre.Pour confirmer la présence de cellules dissociées, vérifiez la solution cellulaire au microscope à l’aide d’un 4X ou d’une lentille objective 10X. Avant de placage des cellules, vortex à une vitesse moyenne pendant deux à trois secondes pour assurer une suspension cellulaire même. Après vortex, pipette rapidement 10 microlitres de la suspension cellulaire au centre de chaque coverslip.Après une heure, nourrir les cellules avec 500 microlitres de milieu NBA complet préchauffé et retourner à l’incubateur à 37 degrés Celsius. Pour co-culturener les neurones purifiés et les cellules gliales, passer les cellules gliales au nombre requis d’inserts de culture cellulaire. Cela se fait en placage de 40 000 cellules gliales dans une gouttelette de 500 microlitres de milieu NBA complet.Après une heure, transférer des inserts de culture cellulaire glianaire vers des neurones purifiés. Retirez l’excès de médias des inserts de culture et retournez les plaques à l’incubateur pour la culture. Après un tri réussi, les neurones plaqués doivent apparaître de forme ronde avec une membrane lisse et devraient être vus pour épargner les neuroïdes après environ une heure in vitro.Par sept jours in vitro, bien qu’une certaine mort cellulaire puisse être apparente, les cellules viables devraient être présentes dans toutes les conditions de culture. L’analyse des cultures purifiées révèle que les neurones glutamatergiques et gabaergiques ont pu étendre les axones et les dendrites de leur corps cellulaire et conserver la capacité de générer des potentiels d’action en réponse aux injections actuelles super seuil dépolarisant. Notamment après purification, seuls les neurones GABAergic ont reçu une quantité significative de transmission synaptique spontanée et les neurones glutamatergiques ont reçu très peu de transmission synaptique en l’absence de cellules gliales.Fait important, la culture de neurones purifiés avec des cellules gliales améliore la croissance et la survie des neurones ainsi que la promotion de la transmission synaptique dans les cultures glutamatergiques. Un revêtement polarisant suffisant des couvre-couvertures et le maintien du pH physiologique des médias culturels tout au long de la procédure sont essentiels pour assurer des cultures cellulaires de bonne qualité. Suivant ce protocole, il devrait être possible d’effectuer le séquençage de l’ARN et la spectroscopie de masse protéique sur les cultures purifiées permettant d’étudier les processus translationnels et transcriptionnels dans des types neuronaux spécifiques.

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Culture de cellules primaires de neurones GABAergiques ou glutamatergiques purifiés établis par tri cellulaire activé par fluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

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