Name: Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Découvrez une méthode d'ATP et de coloration Live/Dead pour évaluer la sensibilité aux antibiotiques de Neisseria gonorrhoeae en agrégats. Cette technique quantifie la survie bactérienne après traitement par ceftriaxone.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par une subvention du National Institute of Health D.E.C. et W.S. AI123340. L.-C.W., J.W., A.C., et E.N. appuyés en partie/participer au programme « La première année l’Innovation & recherche expérience » financé par l’Université du Maryland. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans l’étude de conception, collecte de données et l’analyse, de décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Nous reconnaissons l’UMD CBMG Imaging Core pour toutes les expériences de microscopie.

1. entretien général des souches de GC
<ol><li>Les souches de N. gonorrhoeae -ensemencer sur une gélose GCK avec 1 % Kellogg complète18 (tableau 1, tableau 2) provenant des stocks du congélateur et incuber à 37 ° C, avec 5 % CO2 pendant 16 à 18 h. utilisation MS11 exprimant phase variable Opa (MS11Opa +), aucune Opa (MS11ΔOpa), ou a LOS tronqué (MS11ΔLgtE).</li>
	<li>Prélever soigneusement des pili négatif (colonie sans bordure sombre) ou colonies positives (colonie avec bordure sombre) de chaque souche issu de morphologie de colonie19 en utilisant un microscope à lumière dissection et ensemencer sur une nouvelle plaque GCK.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 16-18 h avant utilisation.</li>
</ol>2. dosage viabilité des agrégations de GC
<ol><li>Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Écouvillon GC de la plaque et remettre en suspension les GC dans le bouillon préchauffé (GCP, tableau 3) additionné de 4,2 % NaHCO3 et 1 % Kellogg solutions18. Utiliser la spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm (une OD de650 1 = ~ 1 x 109 UFC/mL) afin de déterminer la concentration de bactéries en suspension.</li>
	<li>Ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 108 UFC/mL.</li>
	<li>Ajouter 99 µL de suspension GC ajustée dans des puits d’une plaque à 96 puits.</li>
	<li>Incuber la plaque pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour permettre les bactéries à s’agréger.</li>
	<li>Ajouter 1 µL de série ceftriaxone dilué (1000, 100, 50, 25, 12,5, 6.2, 3.1, 1.5, 0,8, 0,4, 0,2 µg/mL) dans chaque puits. Laisser certains puits non traités pour servir en tant que contrôles.</li>
	<li>Incuber les plaques pendant 24 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Laisser agir la suspension 3 fois dans chaque puits de 5 s à 144 W et 20 kHz.</li>
	<li>Ajouter 100 µL de réactif de lueur d’utilisation ATP disponible commercialement dans chaque puits, pipette haut-bas pour 3 fois et incuber à 37 ° C, avec 5 % de CO2pendant 15 minutes.</li>
	<li>Soigneusement transférer 150 µL du mélange de chaque puits dans un nouveau puits dans une microplaque 96 puits noir et éviter d’introduire des bulles.</li>
	<li>Mesurer l’absorbance de chaque puits à 560 nm en utilisant le lecteur de plaque.</li>
	<li>Calculer le taux de survie par le rapport entre la lecture obtenue après traitement série ceftriaxone à la lecture des puits non traitées.</li>
</ol>3. analyse microscopique fluorescence du Live/Dead des agrégats de GC
<ol><li>Recueillir des GC à l’aide d’un applicateur stérile. Kellogg suppléments écouvillon GC de la plaque et GC resuspendre dans pré chauffé de GCP media plus de 1 %.</li>
	<li>Déterminer le nombre de bactéries par spectrophotométrie à une longueur d’onde de 650 nm et ajuster la concentration du GC à ~ 1 x 107 UFC/mL.</li>
	<li>Ajouter 198 µL de suspension de la GC dans des chambres de 8 puits lamelle-bas.</li>
	<li>Incuber la chambre pendant 6 h à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pour permettre la formation de l’agrégation.</li>
	<li>Ajouter 2 µL de ceftriaxone (100 µg/mL ou diverses dilutions) dans chaque puits au sein de chaque état d’agrégation. Incuber pendant le temps désiré à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Ajouter 0,6 µL du mélange de solution coloration live/morts dans chaque puits et incuber pendant 20 min à 37 ° C, avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Acquisition d’images de série Z à l’aide d’un microscope confocal (un microscope équivalent peut être utilisé).</li>
	<li>Analyser les images à l’aide de logiciels ImageJ pour la mesure de la taille des agrégats de GC et le ratio d’intensité de fluorescence (FIR) de vivre-à-mort de coloration dans chaque agrégat.</li>
</ol>4. analyse de l’image
<ol><li>Estimation de la taille des agrégats bactériens.<ol>
<li>Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.</li>
		<li>Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation dans l’image.</li>
		<li>Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.</li>
		<li>Obtenir le nombre dans une nouvelle fenêtre sous la colonne de la zone .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantification du ratio de vivre-à-mort d’agrégations<ol>
<li>Ouvrez ImageJ et d’ouvrir l’image en faisant glisser un fichier image raw à la barre de menus de ImageJ.</li>
		<li>Cliquez analyser | Mesures de la valeur dans la barre de menus de ImageJ.</li>
		<li>Vérifier la densité intégrée dans le menu contextuel, puis cliquez sur OK.</li>
		<li>Cliquez sur l’Image de | Couleur | Outil de canaux dans la barre de menus et sélectionnez couleurs.</li>
		<li>Enregistrer canal 1 comme la fluorescence pour les bactéries vivantes de coloration.</li>
		<li>Cliquez sur Lignes à main levée dans la barre de menus de ImageJ et encercler la zone de chaque agrégation.</li>
		<li>Cliquez analyser | Mesure dans la barre de menus de ImageJ.</li>
		<li>Obtenir le numéro de colonne IntDen .</li>
		<li>Contrôle canal 2 comme la fluorescence pour la coloration mort bactérienne. Répétez les étapes 4.2.6-4.2.8.</li>
		<li>Obtenir le rapport de vivre-à-mort en divisant le nombre de l’étape 4.2.8 par nombre de l’étape 4.2.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse statistique<ol>
<li>Ouvrez GraphPad Prism et entrer les chiffres obtenus à partir de ImageJ la colonne souhaitée.</li>
		<li>Cliquez sur analyser , puis sélectionnez tests t sous les analyses de colonne.</li>
		<li>Cochez la colonne souhaitée pour la comparaison et cliquez sur OK.</li>
		<li>Obtenir la P-Value au titre de la fenêtre d’analyse .</li>
		<li>Sélectionnez la Régression linéaire selon analyses XY de l’étape 4.3.3</li>
		<li>Obtenir le R-carré et la P-valeur sous la fenêtre d’analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>CDC STD Facts. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm">http://www.cdc.gov/std/gonnorrhea/STDFact-gonorrhea-detailed.htm</a> (2017).</li>
<li>den Heijer, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+overview+of+urogenital%2C+anorectal+and+oropharyngeal+Neisseria+gonorrhoeae+testing+and+diagnoses+among+different+STI+care+providers%3A+a+cross-sectional+study%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">A comprehensive overview of urogenital, anorectal and oropharyngeal Neisseria gonorrhoeae testing and diagnoses among different STI care providers: a cross-sectional study.</a> BMC Infectious Diseases. 17 (1), (2017).</li>
<li>Hein, K., Marks, A., Cohen, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptomatic+gonorrhea%3A+prevalence+in+a+population+of+urban+adolescents%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Pediatrics%22%5BJournal%5D)">Asymptomatic gonorrhea: prevalence in a population of urban adolescents.</a> The Journal of Pediatrics. 90 (4), 634-635 (1977).</li>
<li>Hananta, I. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gonorrhea+in+Indonesia%3A+High+Prevalence+of+Asymptomatic+Urogenital+Gonorrhea+but+No+Circulating+Extended+Spectrum+Cephalosporins-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strains+in+Jakarta%2C+Yogyakarta%2C+and+Denpasar%2C+Indonesia%5BTitle%5D)+AND+%22Sexually+Transmitted+Diseases%22%5BJournal%5D)">Gonorrhea in Indonesia: High Prevalence of Asymptomatic Urogenital Gonorrhea but No Circulating Extended Spectrum Cephalosporins-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strains in Jakarta, Yogyakarta, and Denpasar, Indonesia.</a> Sexually Transmitted Diseases. 43 (10), 608-616 (2016).</li>
<li>Chlamydia, W. H. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlamydia+trachomatis%2C+Neisseria+gonorrhoeae%2C+syphilis+and+Trichomonas+vaginalis.+Methods+and+results+used+by+WHO+to+generate+2005+estimates.+World+Health+Organisation%2C+2011.+Prevalence+and+incidence+of+selected+sexually+transmitted+infections%5BTitle%5D)+AND+%22World+Health+Organisation%22%5BJournal%5D)">Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, syphilis and Trichomonas vaginalis. Methods and results used by WHO to generate 2005 estimates. World Health Organisation, 2011. Prevalence and incidence of selected sexually transmitted infections.</a> World Health Organisation. , accessed Oct 5 (2011).</li>
<li>Mayor, M. T., Roett, M. A., Uduhiri, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+gonococcal+infections%5BTitle%5D)+AND+%22American+Family+Physician%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of gonococcal infections.</a> American Family Physician. 86 (10), 931-938 (2012).</li>
<li>Alirol, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug-resistant+gonorrhea%3A+A+research+and+development+roadmap+to+discover+new+medicines%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Multidrug-resistant gonorrhea: A research and development roadmap to discover new medicines.</a> PLOS Medicine. 14 (7), (2017).</li>
<li>Workowski, K. A., Bolan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sexually+transmitted+diseases+treatment+guidelines%2C+2015%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recommendations+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Sexually transmitted diseases treatment guidelines, 2015.</a> MMWR Recommendations and Reports. 64, 1-137 (2015).</li>
<li>Lahra, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+Recognition+of+Internationally+Disseminated+Ceftriaxone-Resistant+Neisseria+gonorrhoeae+Strain%5BTitle%5D)+AND+%22Emerging+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Cooperative Recognition of Internationally Disseminated Ceftriaxone-Resistant Neisseria gonorrhoeae Strain.</a> Emerging Infectious Diseases. 24 (4), (2018).</li>
<li>Wi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+resistance+in+Neisseria+gonorrhoeae%3A+Global+surveillance+and+a+call+for+international+collaborative+action%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial resistance in Neisseria gonorrhoeae: Global surveillance and a call for international collaborative action.</a> PLOS Medicine. 14 (7), 1002344(2017).</li>
<li>Singh, S., Singh, S. K., Chowdhury, I., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mechanism+of+Bacterial+Biofilms+Resistance+to+Antimicrobial+Agents%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Microbiology+Journal%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mechanism of Bacterial Biofilms Resistance to Antimicrobial Agents.</a> Open Microbiology Journal. 11, 53-62 (2017).</li>
<li>Greiner, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+Formation+by+Neisseria+gonorrhoeae%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Biofilm Formation by Neisseria gonorrhoeae.</a> Infection and Immunity. 73 (4), 1964-1970 (2005).</li>
<li>Zollner, R., Oldewurtel, E. R., Kouzel, N., Maier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+and+antigenic+variation+govern+competition+dynamics+through+positioning+in+bacterial+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Phase and antigenic variation govern competition dynamics through positioning in bacterial colonies.</a> Scientific Reports. 7 (1), (2017).</li>
<li>Stein, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Opacity+Proteins+Interferes+with+the+Transmigration+of+Neisseria+gonorrhoeae.+across+Polarized+Epithelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Expression of Opacity Proteins Interferes with the Transmigration of Neisseria gonorrhoeae. across Polarized Epithelial Cells.</a> PLoS One. 10 (8), 0134342(2015).</li>
<li>LeVan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+a+derivative+of+Neisseria+gonorrhoeae+strain+MS11+devoid+of+all+opa+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of a derivative of Neisseria gonorrhoeae strain MS11 devoid of all opa genes.</a> Journal of Bacteriology. 194 (23), 6468-6478 (2012).</li>
<li>Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+analyzing+static+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Growing and analyzing static biofilms.</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1., Unit 1B.1 (2005).</li>
<li>Peeters, E., Nelis, H. J., Coenye, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+multiple+methods+for+quantification+of+microbial+biofilms+grown+in+microtiter+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of multiple methods for quantification of microbial biofilms grown in microtiter plates.</a> Journal of Microbiological Methods. 72 (2), 157-165 (2008).</li>
<li>White, L. A., Kellogg, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+Gonorrhoeae+Identification+in+Direct+Smears+by+a+Fluorescent+Antibody-Counterstain+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Neisseria Gonorrhoeae Identification in Direct Smears by a Fluorescent Antibody-Counterstain Method.</a> Journal of Applied Microbiology. 13, 171-174 (1965).</li>
<li>Swanson, J., Kraus, S. J., Gotschlich, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+gonococcus+infection.+I.+Pili+and+zones+of+adhesion%3A+their+relation+to+gonococcal+growth+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Studies on gonococcus infection. I. Pili and zones of adhesion: their relation to gonococcal growth patterns.</a> Journal of Experimental Medicine. 134 (4), 886-906 (1971).</li>
<li>Herten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+in+Vitro+Quantification+of+S.+aureus+Biofilms+on+Vascular+Graft+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Rapid in Vitro Quantification of S. aureus Biofilms on Vascular Graft Surfaces.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 2333(2017).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+Staphylococcus+aureus+biofilms+using+slime-producing+variants+and+ATP-bioluminescence+for+automated+bacterial+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Luminescence%22%5BJournal%5D)">In vitro development of Staphylococcus aureus biofilms using slime-producing variants and ATP-bioluminescence for automated bacterial quantification.</a> Luminescence. 14 (1), 23-31 (1999).</li>
<li>Webb, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+in+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Cell death in Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Journal of Bacteriology. 185 (15), 4585-4592 (2003).</li>
<li>Jurcisek, J. A., Dickson, A. C., Bruggeman, M. E., Bakaletz, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biofilm+formation+in+an+8-well+chamber+slide%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">In vitro biofilm formation in an 8-well chamber slide.</a> Journal of visualized experiments. (47), (2011).</li>
<li>Wang, L. C., Litwin, M., Sahiholnasab, Z., Song, W., Stein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neisseria+gonorrhoeae+Aggregation+Reduces+Its+Ceftriaxone+Susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Neisseria gonorrhoeae Aggregation Reduces Its Ceftriaxone Susceptibility.</a> Antibiotics (Basel). 7 (2), (2018).</li>
<li>Lebeaux, D., Ghigo, J. M., Beloin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm-related+infections%3A+bridging+the+gap+between+clinical+management+and+fundamental+aspects+of+recalcitrance+toward+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biofilm-related infections: bridging the gap between clinical management and fundamental aspects of recalcitrance toward antibiotics.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 510-543 (2014).</li>
<li>Hall-Stoodley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+diagnostic+guidelines+for+biofilm-associated+infections%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Towards diagnostic guidelines for biofilm-associated infections.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 65 (2), 127-145 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les bactéries peuvent former des biofilms au cours de l’infection du corps humain. Traditionnel MIC test peut-être ne pas refléter la concentration nécessaire pour éradiquer les biofilms bactériens. Pour tester les effets antimicrobiens sur un biofilm, méthodes basées sur la biomasse biofilm ainsi qu’UFC de placage peuvent être erronées en raison de l’impact de la structure des biofilms. Par exemple, la méthode de placage ne fonctionne que si le biofilm peut être perturbé. Par conséquent, l’UFC a obtenu peut être inférie...

La gonorrhée est qu'une commune transmises sexuellement (MTS)1. Neisseria gonorrhoeae (GC), une bactérie Gram-négative de diplococcal, est l’agent causal de cette maladie. Symptômes de l’infection génitale peuvent entraîner des douleurs pendant la miction, douleurs génitales généralisée et urétral. L’infection est souvent asymptomatique2,3,4,5, et cela permet à la longue colonisation. Ces infections non traitées sont un sujet de préoccupation majeur pour la santé, car ils sont susceptibles de faciliter la transmission de l’organisme et cela peut conduire à des complications telles que la maladie inflammatoire pelvienne (MIP) et diffusé l’infection gonococcique (DGI)6. La gonorrhée résistante aux antibiotiques est une crise de santé publique majeur et une augmentation de fardeau socio-économique7. Traitement régime changement d’un seul antibiotique à la bithérapie, qui combine l’azithromycine ou la doxycycline avec ceftriaxone8a entraîné une sensibilité réduite aux céphalosporines. L’échec accru de ceftriaxone et l’azithromycine9,10, en combinaison avec des infections asymptomatiques, met en évidence la nécessité de comprendre les échecs de traitement de la gonorrhée.
L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI), y compris les tests de diffusion de dilution et disque agar, a été utilisé comme le test médical standard pour l’identification de la résistance à un antibiotique. Néanmoins, il est difficile de savoir si le critère de la MIC exprime l’antibiorésistance bactérienne in vivo. La formation de biofilms bactériens contribue à la survie de bactéries en présence de concentrations bactéricides d’antibiotique : l’essai de MIC est incapable de détecter cet effet11. Parce que le GC peut former des biofilms sur les surfaces muqueuses12, nous émettons l’hypothèse de cet antibiotique susceptibilité au sein des agrégats serait différente de celle observée dans les GC. En outre, des études ont montré que trois phase protéine associée à l’opacité de molécules de surface variable, Pili, (Opa) et lipooligosaccharides (LOS), qui régissent les interactions entre bactérie, conduire à différents agrégats de taille13, 14 , 15. la contribution de ces composants à la résistance aux antibiotique n’a pas été examinée faute de méthodes appropriées.
Actuellement, il y a plusieurs méthodes pour mesurer l’élimination du biofilm. La méthode quantitative plus largement utilisée est en mesurant les changements dans la biomasse à l’aide de violet de gentiane16de coloration. Toutefois, la méthode requiert la manipulation expérimentale importante, qui peut potentiellement générer des erreurs dans l’expérience répétitions17. La méthode de coloration de vivre/morts utilisée ici permet la visualisation des bactéries vivantes et mortes et leur distribution dans le biofilm. Cependant, la structure des biofilms peut poser comme une barrière physique qui réduit la pénétration de la teinture. Par conséquent, afin de quantifier les bactéries vivent/morts au sein d’un groupe, la coloration est limitée à petits biofilms ou son précurseur-microcolonies ou agrégations. Autres méthodes, y compris les essais de diffusion gélose dilution et disque, ne sont pas en mesure de mesurer les effets d’agrégation. Afin d’examiner la sensibilité GC au sein de l’agrégation après exposition aux antibiotique, une méthode idéale aurait besoin d’avoir les deux un test quantitatif qui permet de mesurer vivent des bactéries et visualiser leur distribution.
La procédure décrite ici combine une mesure de l’utilisation d’ATP et une coloration live/morts de dosage à quantitativement et examiner visuellement la susceptibilité de GC au sein des agrégats en présence d’antibiotiques.

<table><tbody><tr><td>100x supplément</td><td></td><td></td><td></td>Kellogg’s</tr><tr><td>Agar</td><td>United States Biological</td><td>A0930</td><td></td></tr><tr><td>BacTiter Assay&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>G8232</td><td></td></tr><tr><td>Ceftriaxone</td><td>TCI</td><td>C2226</td><td></td></tr><tr><td>Difco GC base moyenne&nbsp ;</td><td>BD</td><td>228950</td><td></td></tr><tr><td>Nitrate ferrique, non hydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>254223-10G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP350-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine Poudre cristalline</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP379-100</td><td></td></tr><tr><td>BacLight colorant vivant/mort</td><td>Invitrogen</td><td>L7012</td><td></td></tr><tr><td>MS11 souche</td><td></td><td></td> de Neisseria gonorrhoeae <td>aimablement fournie par le Dr Herman Schneider, Walter Reed Army Institute for Recherche</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique (K2HPO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Pepton-protéose&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>211693</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-10</td><td></td></tr><tr><td>Amidon soluble</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9765</td><td></td></tr><tr><td>Pyrophosphate de thiamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8754-5G</td><td></td></tr><tr><td>Équipement</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td></td></tr><tr><td>8 puits lamelle-chambre de fond&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>plaques de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Corning, Falcon</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>Biosafety Cabinet (NU-425-600 Classe II, A2 Hotte à flux laminaire)</td><td>Nuaire</td><td>32776</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubateur</td><td>Fisher Scientific</td><td>&nbsp ; Modèle 3530</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal équipé d’une chambre d’imagerie en direct</td><td>Leica</td><td>SP5X</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Microplaque en polystyrène noir 96 puits&nbsp ;</td><td>Corning</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>Illuminateur Glomax&nbsp ;</td><td>Promega</td><td>E6521</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (0,1-10 & micro ; L)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>02-717-133</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (1000 &micro ; L)</td><td>VWR</td><td>83007-382</td><td></td></tr><tr><td>Pointes de pipette (200 &micro ; L)</td><td>VWR</td><td>53509-007</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre Ultrospec 2000 UV</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>80-2106-00</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques stériles 15 ml</td><td>VWR</td><td>21008-216</td><td></td></tr><tr><td>Tubes microcentrifuges stériles (1.7 mL)</td><td>Sorenson BioScience</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs stériles à embout polyester</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-122</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur</td><td>Kontes</td><td>Equivelent à 9110001</td><td></td></tr></tbody></table>

examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de neisseria gonorrhoeae utilisation d’atp à l’aide de granulats et de live/dead coloration

Quantitative Examination of Antibiotic Susceptibility of Neisseria gonorrhoeae Aggregates Using ATP-utilization Commercial Assays and Live/Dead Staining

L’émergence de résistants aux antibiotiques Neisseria gonorrhoeae (GC) est une menace pour la santé dans le monde entier et souligne la nécessité d’identifier les personnes qui ne respectent pas de traitement. Cette bactérie Gram-négative provoque la gonorrhée exclusivement chez l’homme. Au cours de l’infection, il est apte à former des agrégats ou des biofilms. L’essai de la concentration minimale inhibitrice (CMI) est utilisé pour déterminer la susceptibilité aux antibiotiques et de définir un traitement approprié. Toutefois, le mécanisme de l’éradication in vivo et sa relation avec les résultats de laboratoire ne sont pas connus. A développé une méthode qui examine comment l’agrégation GC affecte la sensibilité aux antibiotique et montre la relation entre la taille des granulats et sensibilité aux antibiotique. Lors de l’agrégat de GC, ils sont plus résistants aux antibiotiques mise à mort, avec des bactéries dans le centre survivant ceftriaxone traitement mieux que ceux de la périphérie. Les données indiquent que l’agrégation de N. gonorrhoeae peut réduire sa sensibilité à la ceftriaxone, qui se traduit pas en utilisant les méthodes MIC standard agar axée sur la plaque. La méthode utilisée dans cette étude permettra aux chercheurs de tester la sensibilité bactérienne conditions cliniquement pertinentes.

Deux méthodes ont été employées : un essai d’utilisation ATP et un test de coloration de vivre/morts. Les résultats peuvent être combinés ou utilisés individuellement pour examiner la survie bactérienne au sein des agrégats après un traitement antibiotique. Le test d’utilisation ATP a été démontré pour mesurer des bactéries viables avec précision dans le S. aureus biofilms20,21. Ici, MS11Opa + Lip + souche a permis d’exam...

Un simple test ATP-instruments de mesure et vivre/morts méthode de coloration ont été utilisés pour quantifier et visualiser les Neisseria gonorrhoeae survie après traitement par ceftriaxone. Ce protocole peut être étendu pour examiner les effets antimicrobiens de n’importe quel antibiotique et peut être utilisé pour définir la concentration minimale inhibitrice d’antibiotiques dans les biofilms bactériens.

Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration

The emergence of antibiotic resistant Neisseria gonorrhoeae (GC) is a worldwide health threat and highlights the need to identify individuals who fail ...

Cette technique nous permet de mesurer la susceptibilité aux antibiotiques dans des conditions plus cliniquement pertinentes. La technique nous permet également de déterminer la véritable concentration d’antibiotiques qui peut tuer les bactéries dans les agrégats. Cette technique peut être appliquée pour déterminer la concentration nécessaire à l’élimination des agrégats GC.La méthode peut également être appliquée à la mesure de la susceptibilité antimicrobienne de toutes les bactéries capables de former des agrégats. Portez une attention particulière aux étapes de la lyse pour vous assurer que la lyse est terminée. Sinon, l’analyse de mesure ATP sous-estimera le nombre de bactéries viables.La visualisation de cette méthode permettra à d’autres chercheurs de suivre et de reproduire cette expérience avec cohérence. Commencez par stries Neisseria gonorrhoeae, ou souches GC, sur gck agar complété avec 1%Kellogg pour une incubation de 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain matin, utilisez un microscope léger pour sélectionner soigneusement les colonies pili-négatives sans bords foncés ou colonies pili-positives avec des bords foncés de chaque plaque, et stries les colonies cueillies sur de nouvelles plaques GCK pour une culture de 16 à 18 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le lendemain matin, utilisez un applicateur stérile pour recueillir les colonies de GC de chaque assiette et résuspendez chaque écouvillon dans du bouillon chaud complété par 4,2 % de bicarbonate de sodium et 1 % de solution Kellogg. Mesurer la densité optique à 650 nanomètres, ou OD650, pour déterminer la concentration des bactéries en suspension et ajuster la concentration de GC à environ une fois 10 à huit unités de formation de colonie par millilitre. Ensuite, ajouter 99 microlitres de la suspension GC dans les puits individuels d’une plaque de 96 puits et permettre aux bactéries de s’agréger à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant six heures.À la fin de l’incubation, ajouter un microlitre de ceftriaxone dilué en série à chaque puits en laissant certains puits non traités pour servir de commandes et remettre la plaque à l’incubateur pendant encore 24 heures. Le lendemain, soniquer la suspension dans chaque puits trois fois à 144 watts et 20 kilohertz pendant cinq secondes par sonication et ajouter 100 microlitres de réavenant d’utilisation ATP disponible dans le commerce à chaque puits. Transférez soigneusement 150 microlitres de mélange de chaque puits dans les puits individuels d’une nouvelle microplaque noire de 96 puits et mesurez l’absorption de chaque puits à 560 nanomètres sur un lecteur de plaque.Ensuite, calculer le taux de survie par le rapport de la lecture obtenue après le traitement antibiotique en série à la lecture des puits non traités. Pour la visualisation des agrégats gc vivants/morts, utilisez un applicateur stérile pour recueillir GC à partir des plaques de culture de nuit et réutiliser le GC dans le milieu GCP préchauffé complété par 1% Kellogg. Mesurez l’OD650 par spectrophotométrie et ajustez la concentration à environ une fois 10 pour les sept unités de formation de colonies par millilitre.Ensuite, ajoutez 198 microlitres de suspension GC dans des chambres à fond de couverture de huit puits et incubez les chambres à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant six heures. À la fin de l’incubation, traiter les bactéries avec deux microlitres de ceftriaxone par condition d’agrégation et retourner les chambres à l’incubateur pour la période d’incubation expérimentale appropriée. À la fin de l’incubation, ajouter 0,6 microlitres de solution de coloration vivante/morte dans chaque puits et remettre les chambres à l’incubateur pendant 20 minutes supplémentaires.Ensuite, utilisez un microscope confocal pour obtenir des images de la série Z. Pour mesurer la taille des agrégats GC, ouvrez la première image dans ImageJ et sélectionnez des lignes à main levée pour entourer la zone de chaque agrégation dans l’image. Cliquez sur analyser et mesurer.La taille des agrégats sera indiquée sous la colonne de zone. Pour quantifier le rapport d’intensité de fluorescence de la coloration vivante à morte dans chaque agrégat, cliquez sur analyser et définir les mesures et vérifiez la densité intégrée dans la fenêtre popup. Cliquez sur OK et cliquez sur l’image, la couleur et l’outil canaux.Sélectionnez la couleur et canal nt un comme fluorescence pour la coloration des bactéries mortes. Sélectionnez des lignes à main levée pour encercler la zone de chaque agrégation et cliquez sur analyser et mesurer pour obtenir le rapport d’intensité de fluorescence pour chaque agrégat dans la colonne de densité intégrée. Sélectionnez le canal deux pour la fluorescence pour la coloration bactérienne vivante et mesurez l’intensité de fluorescence dans chaque agrégat comme nous venons de le démontrer.Divisez ensuite les données d’intensité de fluorescence vivante par les données d’intensité de fluorescence morte pour obtenir le rapport d’intensité de fluorescence vivant à mort. Dans cette expérience représentative, les bactéries positives non ventilées de pili positives, agrégées ou agrégées et perturbées de pili positives ont été traitées avec des dilutions périodiques de ceftriaxone avant la mesure de leurs niveaux d’ATP. Le GC préagré a démontré une survie significativement plus élevée que le GC non agrégé ou agrémenté lorsqu’il est traité avec des concentrations égales de ceftriaxone ou plus.Les souches pili-positives qui forment de plus gros agrégats présentaient les niveaux d’ATP les plus élevés après le traitement à la ceftriaxone par rapport aux souches mutantes. Indépendamment de la souche testée, les taches vivantes/mortes avant le traitement antibiotique ont révélé des bactéries mortes en grande partie situées aux couches externes de la culture, tandis que les GC vivants ont été identifiés principalement dans le noyau des agrégats traités à la ceftriaxone. Comme prévu, les bactéries pili-positives formaient les plus gros agrégats, tandis que les cultures pili-négatives formaient les plus petites.Notamment, les agrégats pili-positifs étaient encore vivants dans leurs couches fondamentales après traitement antibiotique, tandis que le GC dans les petits agrégats mutants lâches étaient morts. Basé sur la taille et la survie du GC, un graphique de corrélation peut être tracé pour examiner la relation entre la taille d’agrégation et la survie antibiotique des bactéries. La sonication est importante pour s’assurer que l’ATP de chaque bactérie individuelle est libéré dans les agrégats étroitement liés.Dans le cas contraire, les mesures ne seront pas cohérentes. Il est important de plaquer les bactéries après qu’elles se sont agrégées et sont traitées avec des antibiotiques pour mesurer à la fois la bactérie viable et la bactérie capable de réplication. La technique mesure l’influence de l’agrégation des bactéries sur la susceptibilité aux antibiotiques permettant aux chercheurs de développer de meilleurs médicaments pour le traitement des maladies.

quantitative-examination-antibiotic-susceptibility-neisseria

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : Cayron, J., et Lesterlin, C. Analyse multi-échelle de la croissance bactérienne sous traitements de stress. J. Vis. Exp. (2019)Cette vidéo montre la procédure d’évaluation de la filamentation d’E. coli et de la réplication de l’ADN dans le cadre d’un traitement antibiotique inhibiteur de la division cellulaire à l’aide d’un placage pour mesurer la viabilité et d’une cytométrie en flux pour analyser la taille des cellules et le contenu en ADN.

Évaluation de la filamentation induite par les antibiotiques chez E. coli à l’aide du dosage du placage et de la cytométrie en flux

Source : Maurakis, S., et Cornelissen, C. N. Croissance limitée aux métaux de Neisseria gonorrhoeae pour la caractérisation des gènes sensibles aux métaux et l’acquisition de métaux à partir de ligands hôtes. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre la procédure de détection des transporteurs de métaux de surface chez Neisseria gonorrhoeae cultivée dans des conditions limitées en métaux à l’aide d’un test par transfert de points, impliquant la liaison de ligands, la détection d’anticorps et la...

Détection des transporteurs de métaux de surface chez Neisseria gonorrhoeae à l’aide de Dot Blot

Cette vidéo présente une technique in vitro pour étudier l’impact du traitement antimicrobien sur les agrégats de Pseudomonas aeruginosa (Pa). Les cellules Pa marquées par fluorescence sont cultivées sous forme d’agrégats, imitant le modèle de croissance pendant l’infection. Après avoir testé les agrégats avec une concentration sublétale de colistine, l’évaluation en temps réel de l’interaction bactérie-antibiotique est effectuée par microscopie à fluorescence.

Une technique in vitro pour étudier les traitements antimicrobiens sur des agrégats bactériens

Cette vidéo décrit le test simple de mesure de l’ATP à l’aide d’un réactif de lueur de luciférase. Ce test est utilisé pour quantifier la survie à Neisseria gonorrhoeae après un traitement par ceftriaxone.

Un test d’utilisation de l’ATP pour déterminer la survie bactérienne sous traitement antibiotique

Au centre du champ de la pathogenèse bactérienne est la possibilité de définir si et comment les microbes survivent après une exposition à des cellules eucaryotes. Cet article décrit les protocoles pour l'utilisation de colorants fluorescents qui révèlent la viabilité des bactéries individuelles à l'intérieur et associés à des cellules hôtes.

Fluorescence méthodes de microscopie pour déterminer la viabilité des bactéries en association avec des cellules de mammifères

Ici, nous présentons des protocoles pour cribler et caractériser rapidement l’activité antimicrobienne des enzymes. Le test de diffusion sur microlames et le test de libération de colorant utilisent des substrats bactériens cibles pour l’évaluation qualitative et quantitative de l’activité enzymatique.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Le protocole présente l' Escherichia coli-basée d’incorporation de la pression sélective des acides aminés non canoniques (ANAC) dans la nisine de peptide antimicrobien lactocoques. Ses propriétés peuvent être modifiées au cours de l’expression recombinants par substitution avec désiré ANAC dans les milieux de culture définis. Les changements qui en résultent dans la bioactivité sont mappés par tests d’inhibition de la croissance et la microscopie de fluorescence.

Peptides antimicrobiens produites par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques

Les antibiotiques étiquetés fluorescents sont des outils puissants qui peuvent être utilisés pour étudier de multiples aspects de la résistance aux antimicrobiens. Cet article décrit la préparation des antibiotiques fluorescents marqués et leur application à l’étude de la résistance aux antibiotiques chez les bactéries. Les sondes peuvent être utilisées pour étudier les mécanismes de résistance bactérienne (p. ex., efflux) par spectrophotométrie, cytométrie du débit et microscopie.

Visualisation de la résistance bactérienne à l’aide de sondes antibiotiques fluorescentes

Les expectorations synthétiques de la fibrose kystique (SCFM2) peuvent être utilisées en combinaison avec la microscopie confocale à balayage laser et le tri cellulaire activé par fluorescence pour observer les agrégats bactériens à haute résolution. Cet article détaille les méthodes permettant d’évaluer les populations agrégées pendant le traitement antimicrobien en tant que plate-forme pour de futures études.

Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa

La résistance aux antibiotiques chez les souches invasives d’Escherichia coli adhérente pose des défis pour évaluer l’invasion bactérienne à l’aide du test traditionnel de protection contre la gentamicine. Une méthode améliorée pour évaluer quantitativement l’invasion bactérienne en énumérant les unités formant des colonies et qualitativement par visualisation des cellules infectées par microscopie confocale à immunofluorescence est décrite.

Test de protection de l’amikacine pour la quantification et la visualisation de l’invasion des cellules d’Escherichia coli

Découvrez une méthode d'ATP et de coloration Live/Dead pour évaluer la sensibilité aux antibiotiques de Neisseria gonorrhoeae en agrégats. Cette technique quantifie la survie bactérienne après traitement par ceftriaxone.

Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration (Vidéo) | JoVE Journal

Examen quantitatif de la sensibilité aux antibiotiques d’essais commerciaux de Neisseria gonorrhoeae utilisation d’ATP à l’aide de granulats et de Live/Dead coloration

Explorer plus de vidéos