Génie génétique de Dictyostelium discoideum basés sur la sélection et la croissance sur les bactéries
25 janvier 2019
Dictyostelium discoideum est un organisme modèle populaire à étudier les processus cellulaires complexes tels que la migration cellulaire, endocytose et le développement. L’utilité de l’organisme dépend de la possibilité de manipulation génétique. Nous présentons ici les méthodes pour transfecter Dictyostelium discoideum cellules qui surmontent les limites actuelles de culture de cellules dans un milieu liquide.
La valeur de ce protocole est qu’il permet à presque n’importe quelle souche de dictyostelium discoideum d’être manipulée par la génétique moléculaire, indépendamment du fait que cette souche se développera axenically dans le milieu liquide ou non. L’autre avantage de cette technique est qu’elle est rapide et simple. Transposer aux cellules transfect avec un plasmide exochromosomique avant de commencer à mélanger des dictyosteliums.
Les résultats peuvent déjà être validés deux jours après la transfection à l’aide de la microscopie. Il est inhabituel de travailler avec les cellules de dictyostelium et la suspension des bactéries. La visualisation aidera à donner aux expérimentateurs une idée de la façon dont les différentes étapes des protocoles sont effectuées.
Soudabeh Imanikia, postdoc de mon labo, fera la démonstration de la procédure avec moi. Pour commencer, préparez 1000 millilitres de solution de travail tampon sorensen avec chlorure de magnésium et chlorure de calcium selon le protocole du texte. Après cela, utilisez une seule colonie d’aérogènes K pour inoculer un litre de LB moyen.
Laissez les bactéries se développer toute la nuit à 37 degrés Celsius avec des secousses. Faites tourner les cellules dans deux tubes centrifugeuses de 500 millilitres pour récolter les cellules. Ensuite, lavez les bactéries une fois avec 500 millilitres de tampon.
Resuspendez la pastille en 20 millilitres de tampon. Utilisez un photomètre pour vérifier la densité optique de l’échantillon et diluer l’échantillon avec un tampon jusqu’à ce que la densité optique soit d’environ 100. Après cela, préparez le tampon d’électroporation H40 selon le protocole de texte.
Cultiver des aérogènes K pour confluent un milieu SM pendant la nuit à température ambiante. Ajouter 400 microlitres de suspension bactérienne à une plaque d’agar SM et l’étaler uniformément. Ensuite, prenez une boucle stérile et inoculez-la avec des cellules de dictyostelium et répandez les cellules à un bord de la plaque.
Incuber la plaque à 22 degrés Celsius pendant deux jours, pour s’assurer que les zones de croissance sont assez grandes pour la transfection. Ajouter 10 millilitres de suspension k aérogène à une boîte de Pétri traitée par culture tissulaire de 10 centimètres. Ensuite, utilisez une boucle d’inoculation jetable de 10 microlitres pour gratter les cellules des zones de croissance de la plaque de culture.
Transférer les cellules dans un tube de 1,5 millilitre contenant un tampon H40 glacé. Faites tourner les cellules pendant deux secondes à 10000 fois la gravité. Ensuite, jetez le supernatant et réutilisez les cellules dans le tampon H40.
Ensuite, ajoutez 100 microlitres des cellules à un tube contenant un à deux microgrammes d’ADN. Pipette de haut en bas pour mélanger et transférer le mélange d’ADN cellulaire dans une cuvette d’électroporation pré-refroidie. N’ajoutez pas plus de deux microgrammes d’ADN.
Une concentration d’ADN plus élevée est toxique pour les cellules et réduit l’efficacité. Après électroporation, transférer immédiatement les cellules dans une boîte de Pétri préparée de 10 centimètres et permettre aux cellules de récupérer pendant cinq heures. Pour sélectionner un transfectant pour un knock-out, knock-in, ou un acte cinq knock-in, détachez les cellules de la boîte de Petri en pipetting liquide sur la surface.
Ensuite, mettre en place trois dilutions de l’agent sélectif selon le protocole de texte. Enfin, distribuez 150 microlitres des dilutions préparées dans chaque puits de plaques de culture de tissus à fond plat de 96 puits. Dans ce protocole, un système plasmide extrachromosomal double reporter a été démontré.
32 heures après la transfection, la majorité des cellules ont exprimé les deux protéines fluorescentes de fusion étiquetées. Un acte cinq M cherry knock-in et un NC4 a également été tenté. Deux bandes ont été obtenues après avoir couru le digest sur un gel d’agarose.
La bande de paire de base 4127 contient la construction désirée. L’ADN purifié a été utilisé pour la transfection des cellules NC4. Deux clones de la transfection NC4 ont été analysés via PCR et les deux ont montré les modèles de bande prévus.
La tache sud a ensuite été utilisée pour valider les résultats du PCR. Le NC4 a grandi plus rapidement sur les pelouses bactériennes que les cellules Ax2. Après quatre heures, plus de cellules NC4 ont pu ramper sous l’agarose que les cellules Ax2.
Les cellules NC4 étaient plus rapides et ont montré une réponse chemotactique plus forte à l’acide folique que les cellules Ax2. Utilisez toujours des cellules à partir de plaques SM fraîchement mises en place. N’utilisez jamais de cellules de plus de quatre jours, sinon l’efficacité diminuera.
Des souches hap blanches fraîchement isolées, non extensiques sont couramment utilisées pour répondre aux questions concernant un ruching ou un comportement social des dictyosteliums. Notre permet d’appliquer la génétique moléculaire à travers ces isolats.
Aperçu
Cet article présente un protocole de transfection de cellules Dictyostelium discoideum, permettant une manipulation génétique indépendamment des conditions de croissance de la souche. La méthode est efficace et simple, ce qui permet une validation rapide des résultats.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Manipulation génétique
- Organismes modèles
Contexte
- Dictyostelium discoideum est un organisme modèle largement utilisé pour l'étude des processus cellulaires.
- La manipulation génétique est essentielle pour explorer diverses questions biologiques.
- Les méthodes existantes présentent des limitations liées aux conditions de croissance des différentes souches.
- Ce protocole vise à surmonter ces limitations.
Objectif de l'étude
- Fournir une méthode fiable pour transfecter diverses souches de Dictyostelium discoideum.
- Faciliter les applications de génétique moléculaire dans les souches qui ne se développent pas de manière axénique.
- Démontrer l'efficacité du processus de transfection.
Méthodes utilisées
- Préparation des solutions bactériennes et tampons pour la transfection.
- Électroporation des cellules de Dictyostelium discoideum avec de l'ADN plasmidique.
- Validation des résultats de transfection par microscopie et PCR.
- Évaluation du comportement et de la croissance cellulaires en réponse à la transfection.
Résultats principaux
- Transfection réussie de plusieurs souches de Dictyostelium discoideum.
- Expression de protéines fluorescentes observée 32 heures après la transfection.
- Les cellules NC4 ont montré une croissance plus rapide et une réponse chimiotactique plus rapide par rapport aux cellules Ax2.
- Validation des modifications génétiques par analyse PCR et par hybride de Southern.
Conclusions
- Le protocole permet une manipulation génétique efficace des souches de Dictyostelium discoideum.
- Il fournit un cadre pour les études futures sur le comportement cellulaire et la génétique.
- Les souches fraîchement isolées donnent les meilleurs résultats en termes d'efficacité de transfection.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet la manipulation génétique de souches sauvages de Dictyostelium capables de croître sur des bactéries, contournant ainsi les limites des souches adaptées à l'axénie dont la signalisation Ras est altérée. Il offre une méthode rapide et reproductible pour la validation de cibles dans un système modèle pertinent pour les maladies, facilitant la réduction des risques mécanistiques en phase initiale de découverte. Cette approche étend la génétique moléculaire aux souches isolées de l'environnement, renforçant la continuité translationnelle et la fiabilité prédictive des procédés de criblage phénotypique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques dans des voies de signalisation et de mobilité non altérées en utilisant des souches non axéniques dotées d'une signalisation Ras intacte.
- Valeur opérationnelle : Réduit les biais expérimentaux liés aux défauts de macropinocytose et aux altérations de migration observés dans les souches axéniques.
- Valeur prédictive : Facilite la validation fonctionnelle des cibles et la réduction des risques biologiques en permettant la mutagenèse dans des conditions de croissance physiologiquement pertinentes.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des cellules recombinantes exprimant deux marqueurs fluorescents en 32 heures, permettant des lectures d'essai rapides pour le criblage de composés.
- Valeur opérationnelle : Standardise le protocole de transfection à l'aide de pelotons bactériens et d'électroporation, améliorant la reproductibilité entre laboratoires.
- Extensibilité : Accélère le passage de la transfection à l'obtention de clones validés, en quelques jours plutôt qu'en plusieurs semaines, facilitant ainsi l'ingénierie de souches à haut débit.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite l'étude de la chimiotaxie et du comportement social chez des souches sauvages fraîchement isolées, améliorant ainsi la pertinence des modèles de maladie.
- Valeur opérationnelle : Permet l'application directe de la génétique moléculaire à des isolats environnementaux sans nécessiter d'adaptation axénique préalable.
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre la validation de cibles en phase de découverte et les phénotypes précliniques grâce à des paramètres mesurables tels que la chimiotaxie induite par le folate et les tests de pénétration dans l'agarose.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans les étapes de découverte précoce menant à l'identification de candidats, en fournissant des modèles génétiquement manipulables pour l'interrogation des voies biologiques et le criblage phénotypique.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses dans les domaines de la chimiotaxie, de la macropinocytose et de la signalisation du développement, en utilisant des souches sauvages intactes.
- Criblage : Fournit des mesures quantitatives de fluorescence et de croissance sur pelouse bactérienne pour une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Permet la validation par PCR, par Southern blot et par microscopie des modifications génétiques dans un délai de 32 à 48 heures après la transfection.
- Recherche translationnelle : Associe la manipulation génétique à des tests fonctionnels tels que la chimiotaxie et la croissance sous agarose, afin de guider une progression adaptée au niveau de risque.
- Réutilisation à grande échelle : Met en place une plateforme réutilisable pour l'ingénierie de n'importe quelle souche de Dictyostelium, indépendamment de sa source d'isolement ou de ses conditions de croissance.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en éliminant les artefacts liés à l'adaptation axénique et en restaurant les voies de signalisation natives.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité grâce à des préparations d' tampons standardisées, des paramètres d'électroporation et des protocoles de sélection.
- Valeur stratégique : Optimise l'efficacité du capital en réduisant les délais d'ingénierie des souches et en permettant des décisions rapides d'aller/arrêt lors de la validation des cibles.
- Impact sur le portefeuille : Favorise une priorisation ajustée au risque en générant des modèles débarrassés des risques mécanistiques et portant des modifications génétiques validées.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en microbiologie pour la préparation des cultures bactériennes et la manipulation de Dictyostelium sur des gazon bactériens.
- Dépend de l'accès à un équipement d'électroporation et à une infrastructure stérile de culture tissulaire pour les étapes de transfection et de récupération.
- Exige une standardisation de la densité de l'inoculum bactérien (OD ~100) et de la préparation du tampon H40 entre les utilisateurs.
- Implique des ajustements à prendre en compte lors de l'application du protocole à différents isolats sauvages ou souches environnementales.
- Limité aux souches capables de croître sur des gazons bactériens ; l'efficacité diminue avec des cellules âgées de plus de quatre jours après l'isolement.
