Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

Les stratégies actuelles pour un dépistage des drogues urinaires sont coûteuses à effectuer pour l’analyse systématique de groupes de plus en plus importants de drogues d’abus au besoin pour les tests sur le lieu de travail, ainsi que pour les applications thérapeutiques de surveillance des médicaments. En outre, les méthodes basées sur des analyses d’acides aminés sont sujettes à des biais et sont finalement limitées à l’analyse cible des panneaux de médicaments connus. Le principal avantage de notre méthode, appelée MSI-CE-MS, est qu’elle permet le dépistage rapide d’un panel de médicaments illimité et de leurs métabolites avec une grande précision et une accumulation minimale d’échantillons.

Il est urgent d’avoir une méthode de dépistage à haut débit et abordable pour améliorer les résultats pour les patients en confirmant l’observance et en optimisant les régimes de dosage des drogues, tout en révélant la consommation de drogues illicites. Cette plate-forme de séparation multiplexe peut être appliquée à une variété d’autres domaines de recherche liés au profilage ciblé ou non ciblé des métabolites dans des échantillons biologiques complexes. Commencez par décongeler des échantillons d’urine du matin désidentés prélevés auprès de patients ayant des antécédents connus de médicaments d’ordonnance pour un stockage de moins 80 degrés Celsius sur la glace et en vortexant les échantillons décongelés pendant 30 secondes.

Ensuite, sédimentez les échantillons par centrifugation et combinez trois aliquots de 10 microlitres de chaque échantillon avec 10 microlitres de normes internes deuté, cinq microlitres d’une solution 4-fluoro-L-phénylalanine et 3-chloro-L-tyrosine et 25 microlitres d’eau déionisée. Ensuite, centrifugez les mélanges pendant une minute et transférez 20 microlitres de chaque échantillon dans des flacons individuels de polypropylène. Pour définir les paramètres de conditionnement capillaires en silice fondue non encoated, coupez un diamètre intérieur de 135 centimètres de long, 50 micromètres et un capillaire de diamètre externe de 360 micromètres provenant d’une bobine.

Utilisez un fabricant de fenêtres capillaires pour enlever environ 7 millimètres de revêtement en polyamide des deux extrémités de chaque capillaire. Ensuite, installez les entrées capillaires dans l’électrophoresis capillaire, ou cartouche CE, en boucle chaque capillaire pendant deux virages à 360 degrés, en prenant soin de dépasser environ deux millimètres des prises capillaires de l’aiguille du pulvérisateur CE. Lorsque tous les capillaires ont été installés, chargez soigneusement la cartouche CE dans le système CE et rangez le pulvérisateur CE hors de la source irion.

Placez la chromatographie liquide, ou pulvérisateur LC, dans la source iréographique et sélectionnez la chasse d’eau dans le logiciel du système pour configurer le conditionnement capillaire. Réglez la durée du méthanol, d’un hydroxyde de sodium molaire, de l’eau déionisée et de la chasse d’eau d’électrolyte de fond à 30 minutes par chasse d’eau et placez la pompe isocratique en veille pendant la période de conditionnement capillaire. Après la dernière chasse d’eau, nettoyez le spectromètre de masse de l’électrophoresis capillaire, ou pulvérisateur CE-MS, et l’électrode CE avec des lingettes imbibées de méthanol.

Nettoyez l’interface CE-MS avec une solution d’eau isopropanole un à une pour éliminer les dépôts de sel résiduels. Remplacez le pulvérisateur LC par le pulvérisateur CE-MS nettoyé et un capillaire nouvellement conditionné dans l’interface liquide de gaine coaxiale. Ensuite, allumez la pompe isocratique et appliquez une tension de 30 kilovolts pendant 15 minutes pour vous assurer qu’un profil de courant CE stable est atteint avant l’analyse d’urine.

Dans le logiciel système, sélectionnez le préconditionnement, réglez la couleur à 600 secondes et spécifiez une position de fichier d’électrolyte de fond. Réglez l’injection pour injecter hydrodynamiquement les échantillons à 100 millibars pendant cinq secondes et injecter électrocinétiquement les espaceurs électrolytiques de fond à 30 kilovolts pendant 75 secondes. Réglez la tension appliquée à 30 kilovolts, la température de la cartouche à 25 degrés Celsius, et le temps de fonctionnement total à 40 minutes.

Ensuite, à l’aide de l’horaire, appliquer un gradient de pression de deux millibars par minute de zéro à 40 minutes pendant la séparation. Lorsque l’acquisition de l’échantillon est terminée, rincer le capillaire à 50 millibars de pression avec les électrolytes de fond pendant la nuit pendant que le capillaire est dans le pulvérisateur CE dans la source iration. Définissez la détection d’ions positifs TOF-MS pour couvrir un rapport masse-charge de 50 pour 1 700, avec un taux d’acquisition de données de 500 millisecondes par spectre, et confirmez que le profil et les données centroïdes sont stockés au format de fichier D.

Réglez les conditions d’ionisation de l’électrospray à des tensions capillaires et à la buse de 2000 volts chacune, le gaz nébuliseur à 10 livres par pouce carré, et la livraison de gaz de séchage à huit litres par minute à 300 degrés Celsius avec un flux de gaz de gaine de 3,5 litres par minute à 195 degrés Celsius lors de l’acquisition. Réglez ensuite les paramètres de tension MS du fragmenteur, de l’écumoire et de l’octapole d’une fréquence radio à 120, 65 et 750 volts, respectivement, et définissez les paramètres de contrôle des instruments et d’acquisition de données selon la conception de l’expérience. Pour l’analyse des données, ouvrez les données CE-MS multi-segments dans le logiciel système.

Sous chromatogrammes, définissez les données d’extraction et les formats de données chromatogrammes et spectrales de masse en mode profil. Sous lissage, sélectionnez savitzky-golay cubique quadratique et réglez la largeur de la fonction à 15 points. Cliquez ensuite sur Intégrer MS et réglez l’intégrateur à agile.

Sous les filtres de pointe, réglez le nombre maximum de pics à 11. En vue, cliquez sur la liste de pointe de l’intégration et sélectionnez le nombre de pointe, le temps de rétention, la zone de pointe, la hauteur de pointe et le rapport signal/bruit. Enregistrez ensuite les paramètres sous un nom de méthode unique et appliquez la méthode au processus d’interprétation de chaque ensemble de données.

Dans cette analyse représentative de divers médicaments isoméniques isobitaux d’abus et de leurs métabolites, 30 pics résolus de 10 échantillons indépendants d’un mélange de drogue ont été détectés sans report d’échantillon. Deux autres opioïdes isobariques pourraient être entièrement résolus comme 20 pics distincts avec l’acquisition complète de données d’analyse. De même, deux isomères positionnels d’amphétamine ont été entièrement résolus dans cette analyse multise segmentée de CE-MS, pour distinguer l’abus illicite de méthamphétamine de l’abus potentiel de phentermine, un stimulant prescrit qui est employé comme coupe-faim pour la perte de poids.

Dans cette analyse représentative du dépistage des médicaments, un résultat positif au test de dépistage de la méthadone a été déduit par la détection d’un pic de signal important co-migrant avec le pic de méthadone-d3 avec une erreur de faible masse. Aucun autre signal n’a été détecté dans d’autres échantillons d’urine au cours de la même course et la concentration détectée de méthadone a dépassé 13 fois la limite de coupure recommandée par rapport à son rapport de réponse ion mesurée dans l’échantillon et corrigée par un facteur de dilution de l’urine quatre fois, confirmant l’adhérence des patients à la thérapie d’entretien à la méthadone. Ici, une configuration d’injection en série dans le CE-MS multi-segment, comprenant cinq étalons différents de drogue, a été analysée en double dans un seul run avec l’urine synthétique vide.

Les métabolites de drogue ont été détectés comme leurs ions moléculaires potéifiés au-dessus de leurs limites de coupure de criblage. Après cette procédure, un grand nombre de métabolites polaires et ioniques dans l’urine peuvent également être analysés par MSI CMS à l’appui de la recherche métabolique basée sur la découverte. En outre, une surveillance complète d’un large éventail de médicaments exogènes et de leurs métabolites peut être réalisée, y compris les médicaments non prescrits et les drogues illicites sujettes à l’abus.

Cette méthode optimisée peut également être utilisée pour filtrer régulièrement d’autres drogues d’abus. Il peut s’agir de métabolites de cannabis ou d’alcool et notre méthode peut également différencier entre une matrice d’urine synthétique ou fausse et un échantillon d’urine naturel, réel, authentiquement donné ainsi. N’oubliez pas de toujours faire preuve de prudence lorsque vous travaillez avec des fluides biologiques.