Name: Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 4 s
Description: Apprenez la mutagenèse dirigée par PCR en deux ou trois étapes pour étudier les interactions ARN-ARN et ARN-protéine chez Escherichia coli. Cette méthode permet d'introduire des mutations spécifiques dans l'ADN.

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Les auteurs aimeraient remercier les subventions de la politique de libre accès University of Southern Denmark.

1. sélection de vector
<ol><li>Choisir un vecteur pour effectuer des expériences en aval avec. Tout vecteur est applicable pour cette méthode PCR-étapes 2 et 3.</li>
	<li>Basé sur le choix du vecteur, choisissez des enzymes de restriction appropriées pour le clonage.</li>
</ol>2. amorces pour site de mutagénèse dirigée
<ol><li>Choisir entre la stratégie PCR étape 2 ou 3 étapes (2-step est seulement pour les mutations < 200 bp des deux extrémités de l’ADN d’intérêt). Pour l’ACP 2-étape, passez à l’étape 2.2 et pour le PCR de 3 étapes, passez à l’étape 2.3.</li>
	<li>Conception amorces pour la PCR 2-step.<ol>
<li>Plan d’apprêt 1 et 3 pour amplifier l’ADN d’intérêt et avec un 5' surplombent qui comporte 4 nucléotides (p. ex., ATAT ou AGTC) suivis par le site de reconnaissance de restriction pertinente nécessaire pour cloner dans le vecteur choisi.</li>
		<li>Conception de primer 2 pour introduire mutation(s) dans l’ou les lieux désiré et flanquent la mutation avec 10-15 nucléotides complémentaires des deux côtés. Rendre l’amorce inverse si la mutation est introduite à l’extrémité 5' ou avant si la mutation est introduite à l’extrémité 3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Conception amorces pour la PCR de 3 étapes.<ol>
<li>Plan d’apprêt 1 et 4 pour amplifier l’ADN d’intérêt et avec un 5' surplombent qui comporte 4 nucléotides (p. ex., ATAT ou AGTC) suivis par le site de reconnaissance de restriction pertinente nécessaire pour cloner dans le vecteur choisi.</li>
		<li>Concevoir l’apprêt 2 et 3 d’introduire mutation(s) aux installations désirées et la mutation de flanc de 10-15 nucléotides complémentaires des deux côtés. Apprêt 2 et 3 sont inverser complémentaires.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. amplification de type sauvage ADN pour le clonage par PCR
Remarque : Pour plus de détails sur la PCR, voir6.
<ol><li>Effectuer PCR6 en utilisant des amorces 1 + 2 (2-step PCR) ou 1 + 4 (3 étapes PCR) et ADN de type sauvage en tant que modèle pour obtenir PCR produit I. utilisation du programme PCR dans le tableau 1.</li>
	<li>Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose.<ol>
<li>Faire un gel d’agarose gel solution (2 %) en ajoutant 2 g d’agarose par 100 mL de 1 x Tris-acétate-tétraacétique acide (EDTA) (TAE) tampon. Dissoudre l’agarose en les faisant bouillir dans un four à micro-ondes. Ajouter le bromure d’éthidium coloration à l’ADN (à une concentration finale de ~ 0,5 µg/mL) solution pour la visualisation de gel de l’agarose.</li>
		<li>Monter le gel d’agarose, placez celle-ci dans un appareil d’électrophorèse et charger des échantillons PCR (mélangés avec de la teinture de chargement de l’ADN) et une échelle d’ADN de taille connue. Exécuter les échantillons à 75 W pendant 45 min ou jusqu'à ce que les bandes sont séparées de façon adéquate et visualiser les bandes au tableau des ultraviolets (UV) ou avec un gel, système d’imagerie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purifier le produit PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).</li>
	<li>Stocker l’ADN purifié à-20 ° C (dans un tampon Tris-EDTA (TE) – stockage de longue durée) ou à 4 ° C (en dH2O – stockage à court terme) jusqu'à l’étape utilisé dans 5.</li>
</ol>4. la PCR d’introduire dirigée des mutations de l’ADN
<ol><li>PCR PCR 2-step (voir l’étape 4.2 pour PCR 3 étapes)<ol>
<li>Effectuer des PCR6 en utilisant des amorces 1 + 2 si les mutations sont à l’extrémité 5' ou 2 + 3 si les mutations sont dans les 3' mettre fin et utiliser l’ADN de type sauvage comme modèle pour obtenir le produit de PCR II (voir tableau 1 pour programme PCR).</li>
		<li>Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.</li>
		<li>Purifier le produit PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).</li>
		<li>Magasin purifiée ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à l’étape utilisé dans 5.</li>
		<li>Effectuer des PCR6 à l’aide de produit de PCR II comme l’amorce avec apprêt 3 si les mutations sont à l’extrémité 5' ou d’apprêt 1 si les mutations sont à l’extrémité 3' et utilisent l’ADN de type sauvage en tant que modèle pour obtenir le produit de PCR III (voir tableau 1 pour programme PCR).</li>
		<li>Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.</li>
		<li>Purifier le produit de PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).</li>
		<li>Magasin purifiée à l’ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à l’étape 5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PCR PCR 3 étapes<ol>
<li>Effectuer PCR6 en utilisant des amorces 1 + 2 et 3 + 4 dans les réactions distinctes et ADN de type sauvage en tant que modèle pour obtenir le produit PCR II et III (voir le tableau 1 pour programme PCR).</li>
		<li>Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.</li>
		<li>Purifier les produits PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).</li>
		<li>Magasin purifiée à l’ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O).</li>
		<li>Effectuer des PCR6 en utilisant des amorces 1 + 4 et 2-5 ng de ces deux produits PCR, II et III comme le modèle (dans la même réaction) pour obtenir IV de produit PCR (voir le tableau 1 pour programme PCR).</li>
		<li>Valider les PCR par électrophorèse sur gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2. Remarque : Il n’est pas rare d’obtenir plusieurs bandes incorrectes (peut parfois être réduite en utilisant moins de modèle). Toutefois, les produits PCR incorrectes peuvent être ignorées si la bande taille correctement est excisée et extraites à l’aide de gel.</li>
		<li>Si elle est correcte, purifier le produit de PCR avec un kit d’extraction de gel (Table des matières) et mesurer la concentration d’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières).</li>
		<li>Magasin purifiée à l’ADN à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à l’étape 5.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. recombinaison de type sauvage et versions mutantes d’ADN dans le vecteur choisi
Remarque : Pour plus de détails sur la suite des étapes, voir7.
<ol><li>Digest purifié des produits PCR I et III (à partir de 2 étapes PCR) ou IV (à partir de 3 étapes PCR) en utilisant les enzymes de restriction pertinentes.<ol>
<li>Dans 20 µL de 1 x tampon de digestion avec 1 µL de chaque enzyme de restriction, digest 200 ng du produit PCR à 37 ° C pendant 30-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Purifier le produit de PCR digéré par gel-extraction en utilisant un gel extraction kit (Table des matières), mesurer la concentration d’ADN de l’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières) et stocker à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2 O) jusqu'à ce qu’utilisé pour point 5.6.</li>
	<li>Digérer purifiée vector avec les enzymes de restriction et traiter à la phosphatase alcaline pour diminuer les événements re-ligature vecteur. Ne pas traiter les produits PCR à la phosphatase alcaline.<ol>
<li>Dans 30 µL de 1 x tampon de digestion avec 1 µL de chaque enzyme de restriction et de 1 µL de la phosphatase alcaline, digest 1 000 ng du vecteur à 37 ° C pendant 30-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Séparé vecteur digérée de l’ADN des déchets (p. ex., vecteur non circonci et découpe ADN) à l’aide de gel d’agarose comme au point 3.2.1 et 3.2.2.</li>
	<li>Purifier le vecteur digérée par gel-extraction en utilisant un gel extraction kit (Table des matières), mesurer la concentration d’ADN de l’ADN purifié avec un spectrophotomètre (Table des matières) et stocker à-20 ° C (dans un tampon TE) ou à 4 ° C (en dH2O) jusqu'à pour point 5.6.</li>
	<li>Ligaturer les produits de PCR digérés dans vecteur digérée avec les réactions indiquées au tableau 2.</li>
	<li>Incuber à température ambiante pendant 2 h ou toute une nuit à 16 ° C.</li>
	<li>Transformer une souche réceptrice (p. ex. e. coli K12) avec des réactions de ligature.<ol>
<li>Cultiver la souche à OD600= 0,3-0,5 et transfert 1 mL d’une culture aux tubes de 1,5 mL autant comme des réactions de la ligase.</li>
		<li>Tournant à 3 500 g pendant 5 min et jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 200 μl de tampon de transformation (10 mL de bouillon de lysogénie (LB) avec 0,1 g/mL polyéthylène glycol 3350, 5 % diméthyle sulfate et 20 mM MgCl2).</li>
		<li>Ajoutez la réaction de ligature et placer les tubes sur la glace pendant 30 min.</li>
		<li>Choc thermique pendant 2 min à 42 ° C.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de la LB dans les tubes de 1,5 mL et permettre l’expression du phénotype de résistance aux antibiotique pendant au moins 45 min à 37 ° C.</li>
		<li>Faire tourner les cellules à 3 500 g pendant 5 min, jeter 1 mL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans le surnageant restant.</li>
		<li>Plaque des cellules sur des plaques avec des antibiotiques appropriés et incuber une nuit à 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Identifier les transformants hébergeant des vecteurs avec l’intégration réussie de l’insert d’ADN (par exemple, par PCR avec des amorces spécifiques à vecteur et insert).</li>
	<li>Valider la séquence d’ADN par sanger séquençage. Attention : Ne pas utiliser les mêmes amorces pour le séquençage comme pour l’étape 5,9.</li>
</ol>6. à l’aide de vecteurs construits pour des expériences in vitro ou in vivo
<ol><li>Expérience in vivo NOTE : Ceci est un exemple d’utilisation d’un vecteur d’exprimer le type sauvage/muté ARN pour caractériser post-transcriptionnelle. Pour plus de détails sur éponger occidental, voir8.<ol>
<li>Cultiver des souches d’e. coli K12 avec vecteurs construits dans un milieu approprié et induire l’expression si nécessaire. Récolter des échantillons par centrifugation.</li>
		<li>Préparer les échantillons d’électrophorèse sodium dodecyl sulfate polyacrylamide (SDS-PAGE) en dissolvant les granules cellulaires dans 1 x tampon échantillon SDS (pH de 62,5 mM Tris-HCl 6,8, 2,5 % SDS, bleu de bromophénol 0,002 %, 5 % de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol) et faire bouillir à 95 ° C pendant 5 min. Remarque : Il est possible de monter un gel ou d’utiliser un gel préfabriqué disponible dans le commerce. Ce dernier a été utilisé dans les résultats présentés dans la Figure 3 (Table des matières).</li>
		<li>Charge 107 cellules de chaque échantillon dans les puits séparés (inclure une échelle de protéine) et exécutez le gel à 200 V jusqu'à ce que les protéines sont séparées (environ 45 min).</li>
		<li>Épongez les protéines sur une membrane de cellulose par transfert semi-sec à 80 mA pendant 1 h.</li>
		<li>Bloquer la membrane avec un mélange de protéines (par exemple, 5 % lait en poudre dissout dans 1 x Tween 20-Tris-buffered saline (TTBS) tampon).</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps primaire (dissoute dans 1 x TTBS tampon) qui ciblent la protéine d’intérêt (p. ex., GFP, drapeau ou protéine HIS-tag) et incuber pendant 1 heure avec agitation douce.</li>
		<li>Laver membrane dans 1 x TTBS pendant 10 min pour éliminer les anticorps non fixés. Répéter deux fois plus.</li>
		<li>Ajoutez l’anticorps secondaire (dissoute dans 1 x TTBS tampon) qui cible les anticorps primaires et permettre une détection (p. ex., la peroxydase de raifort (HRP)-conjugués anticorps secondaires. Incuber pendant 1 heure avec agitation douce.</li>
		<li>Laver la membrane dans 1 x TTBS pendant 10 min pour éliminer les anticorps non fixés. Répéter deux fois plus.</li>
		<li>Visualiser la membrane avec une technique compatible avec l’anticorps secondaires (par exemple l’imagerie après incubation avec une dérivé de luminol chimiluminescence, si un anticorps secondaire conjugué HRP a été utilisé).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Expérience in vitro NOTE : Ceci est un exemple d’utilisation le vecteur comme modèle pour la transcription in vitro de l’ARN pour caractériser les interactions ARN-protéine. Pour plus de détails sur l’AESM, voir9.<ol>
<li>Faire la transcription in vitro utilisant un T7 dans le kit de transcription in vitro (Table des matières) et les vecteurs de l’étape 5 en tant que modèles.</li>
		<li>Séparer des ARN transcrits de PAGE sur une 7 M 4,5 % d’urée dénaturation gel et extrayez RNA directement depuis le gel par élution electro avec tubes de dialyse (Table des matières).</li>
		<li>Étiqueter les RNA (p. ex. radiomarquage avec γ -32P-ATP à l’aide de T4-polynucléotide kinase (Table des matières) et purifier à nouveau avec des colonnes (Table des matières). Attention : Avant de travailler avec des matières radioactives, consulter le responsable de la radioprotection local.</li>
		<li>Mélanger ARN marqué avec augmentation des concentrations de protéines dans les réactions distinctes en un 1 x tampon de liaison (20 mM Tris, pH 8, 100 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM le dithiothréitol (DTT)). Remarque : dans les résultats présentés (Figure 4), 2 nM de radiomarquées Cdgs ARNm a été mélangé avec une pente de protéine de Hfq 0 à 2 µM (concentration de monomère).</li>
		<li>Aux protéines et ARN pour hybrider avant de charger l’hybridation mix sur un gel de polyacrylamide non dénaturant et exécutez le gel pendant 1,5 h à 200 V.</li>
		<li>Visualiser le gel avec une technique compatible avec le marquage de l’étape 6.1.3. (par exemple phosphoimaging si radiomarquage a été appliqué).</li>
		<li>Quantifier l’intensité relative des bandes décalées avec un programme de traitement de l’imagerie et ajuster une courbe (sigmoïde) aux données à l’aide d’un graphique et le logiciel d’analyse de données (Table des matières). D’après la courbe ajustée, dissociation constante (Kd) valeurs peuvent être déterminées automatiquement avec le logiciel.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Bouvier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+binding+to+5%27+mRNA+coding+region+inhibits+translational+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Small RNA binding to 5' mRNA coding region inhibits translational initiation.</a> Molecular Cell. 32 (6), 827-837 (2008).</li>
<li>Jorgensen, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+regulatory+RNAs+control+the+multi-cellular+adhesive+lifestyle+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">Small regulatory RNAs control the multi-cellular adhesive lifestyle of Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Antal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+bacterial+RNA+regulates+a+putative+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter.</a> The Journal of Biological Chemistry. 280 (9), 7901-7908 (2005).</li>
<li>Andreassen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((sRNA-dependent+control+of+curli+biosynthesis+in+Escherichia+coli%3A+McaS+directs+endonucleolytic+cleavage+of+csgD+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">sRNA-dependent control of curli biosynthesis in Escherichia coli: McaS directs endonucleolytic cleavage of csgD mRNA.</a> Nucleic Acids Research. , (2018).</li>
<li>Thomason, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+small+RNA+that+regulates+motility+and+biofilm+formation+in+response+to+changes+in+nutrient+availability+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbioly%22%5BJournal%5D)">A small RNA that regulates motility and biofilm formation in response to changes in nutrient availability in Escherichia coli.</a> Molecular Microbioly. 84 (1), 36-50 (2012).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+Molecular+Cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Science+Education+Database.+Biochemistry.+Electrophoretic+Mobility+Shift+Assay+%28EMSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Science Education Database. Biochemistry. Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA).</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2018).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Laible, M., Boonrod, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homemade+site+directed+mutagenesis+of+whole+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids.</a> Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).</li>
<li>Wells, J. A., Vasser, M., Powers, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cassette+mutagenesis%3A+an+efficient+method+for+generation+of+multiple+mutations+at+defined+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Cassette mutagenesis: an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites.</a> Gene. 34 (2-3), 315-323 (1985).</li>
<li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR%2FCas+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li>
<li>Mali, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-guided+human+genome+engineering+via+Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA-guided human genome engineering via Cas9.</a> Science. 339 (6121), 823-826 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêts opposés.

Mutagenèse dirigée a un large éventail d’applications différentes, et ici, les résultats représentatifs d’un in-vivo et une expérience in vitro ont été inclus comme exemples de la façon de tirer des conclusions biologiques à l’aide de la technique. Mutagenèse dirigée a longtemps été la méthode de référence pour les études d’interactions RNA. La force de la technique réside dans la combinaison de l’introduction de mutations pertinentes avec des dosages en aval et expériences (p. ex., la tache occidentale ou EMSA) pour tir...

ADN est souvent appelée le plan d’action d’une cellule vivante puisque toutes les structures de la cellule sont encodés dans la séquence de son ADN. La réplication exacte et les mécanismes de réparation de l’ADN s’assurer que seules de très faibles taux de mutations se produisent, qui est essentiel pour maintenir les fonctions correctes des gènes codés. Modifications de la séquence d’ADN peuvent affecter les fonctions successives à différents niveaux de départ avec l’ADN (reconnaissance de facteurs de transcription et les enzymes de restriction), puis RNA (complémentarité des paires de bases et des altérations de la structure secondaire) ou autres protéines (amino substitutions de l’acides, destructions, additions ou cadre-déplacements). Nombreuses mutations n’affectent pas la fonction du gène considérablement, certaines mutations dans l’ADN peuvent avoir des conséquences considérables. Ainsi, la mutagenèse dirigée est un outil précieux pour l’étude de l’importance des sites spécifiques de l’ADN à tous les niveaux.
Ce protocole décrit une approche de mutagenèse ciblée utilisée pour introduire des mutations spécifiques. Le protocole s’appuie sur deux stratégies différentes de PCR : un 2-step ou un PCR de 3 étapes. La PCR 2 étapes s’applique si la mutation souhaitée se trouve à proximité de l’extrémité 5' ou de l’extrémité 3' de l’ADN d’intérêt (< 200 paires de bases (bp) de la fin) et la PCR 3 étapes s’applique dans tous les cas.
Dans l’approche PCR étapes 2, 3 amorces sont conçus, dans lequel une série d’amorces est conçue pour amplifier l’ADN d’intérêt (amorces 1 et 3, avance et retour, respectivement), et une amorce unique est conçue pour incorporer la mutation. La mutation introduction d’apprêt (primer 2) devrait avoir une orientation inverse, si la mutation se trouve à proximité de l’extrémité 5' et une orientation vers l’avant si la mutation se trouve à proximité de l’extrémité 3'. Dans la première étape de la PCR, primer 1 + 2 ou 2 + 3 amplifie un petit fragment à proximité de l’extrémité 5' ou 3' fin, respectivement. Le produit PCR qui en résulte sert ensuite comme une amorce dans la deuxième étape avec l’apprêt 1 ou 3, résultant ainsi en un produit PCR avec une mutation de l’ADN d’intérêt (Figure 1 a).
Pour l’ACP de 3 marches, 4 amorces sont conçus, dont une série d’amorces est conçue pour amplifier l’ADN d’intérêt (amorces 1 et 4, avant et arrière, respectivement) et une série d’amorces est conçue pour incorporer des mutations spécifiques qui se chevauchent de complémentarité (amorces 2 et 3, marche arrière et avant, respectivement). À l’étape un et deux, amorces 1 + 2 et 3 + 4 amplifient l’extrémité 5' et 3'. Dans la troisième étape, les produits PCR obtenus de l’étape 1 et deux sont utilisés comme modèles et amplifié avec des amorces 1 + 4. Ainsi, le produit PCR qui en résulte est l’ADN d’intérêt avec la mutation désirée (Figure 1 b).
Alors que l’ADN muté peut être utilisé pour n’importe quelle application en aval, ce protocole décrit comment re-combiner l’ADN dans un vecteur de clonage. L’utilisation de vecteurs de clonage présente plusieurs avantages comme la facilité du clonage et des applications expérimentales spécifiques selon les caractéristiques du vecteur. Cette fonctionnalité est souvent utilisée pour les études d’interactions RNA. Une autre technique pour les études d’interactions RNA est sonder structurelle de l’ARN en complexe avec un autre ARN1,2 ou protéine3,4. Cependant, sondant structurelle est uniquement effectuée in vitro tandis que mutagénèse dirigée et le clonage à des fins ultérieures permettent pour les études d’interactions in vivo.
Mutagenèse dirigée a été largement utilisé pour les études d’interactions RNA tel que présenté ici. Toutefois, la principale méthode PCR sur 2 ou 3 pas s’applique à n’importe quel fragment d’ADN et donc pas seulement limité à études d’interaction de l’ARN.
Pour illustrer la technique et ses utilisations possibles, caractérisation des régions importantes pour la régulation post-transcriptionnelle de l’ARNm, Cdgs, d' Escherichia coli (e. coli) est utilisée. Dans e. coli, Cdgs sont ciblés par le petits ARN non codants, McaS, en coopération avec une protéine, la Hfq, de réprimer l’expression de la protéine de Cdgs2,4,5. La technique est utilisée pour introduire des mutations dans la région d’appariement entre Cdgs et McaS et sur le site de liaison de Hfq de csgD. L’ADN obtenu est ensuite cloné dans un vecteur approprié pour les expériences ultérieures. Applications en aval de la technique comprennent des expériences in vivo et in vitro. À titre d’illustration, exemple 1 est caractérisée in vivo utilisant une analyse par transfert western et exemple 2 se caractérise in vitro en utilisant une analyse de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA). Dans les deux cas, il est illustré de mutagénèse comment dirigée peut être utilisé en combinaison avec d’autres techniques de tirer des conclusions biologiques sur un gène d’intérêt.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-GroEL produit chez le lapin</td><td>Merck</td><td>G6532</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Azure c200</td><td>Azure</td><td>NA</td><td>Station d’imagerie gel</td></tr><tr><td>Oligo d’ADN personnalisé</td><td>Merck</td><td>VC00021</td><td></td></tr><tr><td>DeNovix DS-11</td><td>DeNovix</td><td>NA</td><td>Spectrophotomètre pour les mesures d’acides nucléiques</td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel d’ADN (6X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>Solution de bromure d’éthidium 1 %</td><td>Carl Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>GeneJET Gel Extraction Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0691</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler DNA Ladder Mix</td><td>Fermentas</td><td>SM0333</td><td></td></tr><tr><td>Gerard GeBAflex-tube Midi</td><td>Gerard Biotech</td><td>TO12</td><td>Tubes de dialyse pour électro-élution</td></tr><tr><td>MEGAscript T7 Kit de transcription</td><td>Invitrogen</td><td>AM1334</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT</td><td>Cell Bio-Rad</td><td>1704406</td><td>Système d’électrophorèse horizontale</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal ANTI-FLAG M2 produit chez la souris</td><td>Merck</td><td>F3165</td><td>Anticorps primaire</td></tr><tr><td>Immunoglobulines de souris</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0447</td><td>HRP Anticorps secondaire conjuqué</td></tr><tr><td>NucleoSpin miARN</td><td>Macherey Nagel</td><td>740971</td><td>Purification de l’ARN</td></tr><tr><td>NuPAGE 4-12 % Bis-Tris Protein Gels</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0323BOX</td><td>Bis-Tris pour la séparation des protéines</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix avec tampon HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>DNA polymérase</td></tr><tr><td>PowerPac HC Alimentation à courant élevé</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit Immunoglobulines</td><td>Dako Cytomation</td><td>P0448</td><td>HRP conjuqué anticorps secondaire</td></tr><tr><td>SeaKem LE Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software Inc</td><td>NA</td><td>Outil logiciel d’analyse de graphes et de données</td></tr><tr><td>T100 Thermocycler</td><td>Bio-Rad</td><td>1861096</td><td>PCR T4</td></tr><tr><td>ADN ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td>Ligase</td></tr><tr><td>T4 Polynucléotide kinase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TAE (Tris-acétate-EDTA) (50X)</td><td>Thermo Scientific</td><td>B49</td><td></td></tr></tbody></table>

mutagenèse dirigée pour in vitro et in vivo des expériences illustrées avec interactions arn chez escherichia coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’ADN d’étudier l’interaction entre les petites molécules d’acide ribonucléique (sRNA) non codantes et cibles ARN de messager (ARNm). En outre, mutagénèse dirigée est utilisé pour mapper des sites de liaison protéine spécifique à l’ARN. Une introduction de PCR basé étapes 2 et 3 étapes de mutations est décrite. L’approche est pertinente aux études sur les interactions ARN-ARN et protéine-ARN. En bref, la technique s’appuie sur la conception des amorces avec le mutation(s) désiré et 2 ou 3 étapes de la PCR synthétiser un produit PCR avec la mutation. Le produit PCR est ensuite utilisé pour le clonage. Nous décrivons ici comment effectuer la mutagenèse dirigée, avec les deux celle de 2 et 3 pas à introduire des mutations la sRNA, AMC et l’ARNm, Cdgs, d’enquêter sur les ARN-ARN et interactions ARN-protéine. Nous appliquons cette technique pour étudier les interactions de RNA ; Cependant, cette technique est applicable à toutes les études de mutagenèse (interactions ADN-protéines, acides aminés remplacement/suppression/ajout). Il est possible d’introduire n’importe quel genre de mutation à l’exception des bases non naturelle, mais la technique n’est applicable que si un produit PCR peut être utilisé pour une application en aval (par exemple, le clonage et le modèle pour plus de PCR).

Pour étudier les interactions de RNA concernant la régulation post-transcriptionnelle des Cdgs, une configuration de double vecteur a été choisie : d’exprimer la Cdgs ARNm et l’autre pour exprimer le petits ARN non codants, McaS. Cdgs a été clonée dans pBAD33, qui est un plasmide de milieu-copie inductible arabinose avec résistance de chloramphénicol et McaS a été clonée dans mini R1 pNDM220, qui est un plasmide inductible de faibles copies d’isopropyl β-D-1-thi...

Mutagenèse dirigée est une technique utilisée pour introduire des mutations spécifiques dans l’acide désoxyribonucléique (ADN). Ce protocole décrit comment faire mutagénèse dirigée avec un 2-step et approche, qui s’applique à n’importe quel fragment d’ADN d’intérêt basée sur les 3 étapes amplification génique (PCR).

Mutagenèse dirigée pour In Vitro et In Vivo des expériences illustrées avec Interactions ARN chez Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

La mutagenèse dirigée par le site est utile pour étudier les interactions moléculaires, telles que l’ARN-ARN et les interactions arn-protéine. Ce protocole décrit comment effectuer la mutagenèse dirigée par le site avec une approche PCR en deux ou trois étapes. Les principaux avantages de la méthode sont la diversité des différentes mutations qui peuvent être incorporées, ainsi qu’une facilité relative et le coût pour le faire.Pour commencer, utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce deux, une et deux, trois, spécifiques pour les paires de deux étapes, ou d’amorce trois, une et trois, quatre, spécifiques pour pcr en trois étapes pour obtenir le produit PCR un. Pour valider les produits PCR par électrophoresis gel agarose, faire un gel agarose de 2% en dissolvant deux grammes d’agarose en 100 millilitres de tampon 1X TAE, à l’aide d’un four à micro-ondes. Ajouter le bromure d’éthidium à une concentration finale de 0,5 microgramme par millilitre.Puis jetez le gel agarose. Une fois solidifié, placez-le dans une unité d’électrophorèse. Chargez une échelle d’ADN de taille connue, et les échantillons de PCR mélangés avec du colorant de chargement d’ADN dans les puits.Faire fonctionner les échantillons à 75 volts pendant 45 minutes. Et visualisez les bandes sur un transilluminateur UV ou avec un système d’imagerie par gel. Ensuite, purifier le produit PCR avec un kit d’extraction de gel selon le protocole des fabricants et mesurer la concentration de l’ADN purifié avec un spectrophotomètre.Ensuite, stockez l’ADN purifié à moins 20 degrés Celsius dans le tampon TE. Pour commencer la mutagenèse dirigée par le site avec un PCR en deux étapes, utilisez d’abord le modèle d’ADN de type sauvage, puis l’amorce paires deux, un et deux, deux, pour cinq mutations d’amorce, ou paires d’amorce deux, deux, et deux, trois pour trois mutations d’amorce pour obtenir le produit PCR deux. Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment.Ensuite, utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et le produit PCR deux comme amorce, avec l’amorce deux, trois pour cinq mutations d’amorce, ou l’amorce deux, un pour trois mutation d’amorce, pour obtenir le produit PCR trois. Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment. Ensuite, stockez l’ADN purifié à moins 20 degrés Celsius dans le tampon TE.Pour commencer la mutagenèse directe du site avec un PCR en trois étapes, utilisez d’abord le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce trois, un et trois, deux pour obtenir le produit PCR deux. Utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce trois, trois et trois, quatre, pour obtenir le produit PCR trois. Utilisez le modèle d’ADN de type sauvage et les paires d’amorce trois, trois et trois, quatre, pour obtenir le produit PCR trois.Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment. Enfin utiliser deux à cinq nanogrammes de produits PCR deux et trois comme modèle avec des paires d’amorce trois, un et trois, quatre, pour obtenir le produit PCR quatre. Valider le produit PCR par électrophorèse gel, purifier le produit PCR, et mesurer sa concentration comme décrit précédemment.Conservez l’ADN purifié à moins 20 degrés Celsius dans le tampon TE. Dans cette étude, la mutagenèse de site en 2 étapes et en 3 étapes a été employée pour étudier des interactions d’ARN concernant la régulation post transcriptionnelle de CsgD. Le CsgD sauvage-type a été PCR amplifié pour produire le produit de PCR IA, et le mcaS sauvage-type a été PCR amplifié pour produire le produit de PCR IB. À l’aide d’une stratégie PCR en trois étapes, les produits PCR IIA et IIIA ont été synthétisés dans les deux premières étapes, et l’IVA dans la troisième étape pour introduire des mutations dans csgd.De même, des mutations complémentaires dirigées par le site ont été introduites dans mcaS pour produire des produits PCR IIB, IIIB, dans les deux premières étapes, et IVB dans la troisième étape. L’analyse occidentale de tache a prouvé que tandis que l’expression du mcaS sauvage-type empêche la traduction du CsgD sauvage-type, les mutations dans mcaS ou CsgD soulage la répression observée. Cependant, les mutations dans csgd et mcaS empêchent la traduction de CsgD.À l’aide d’une stratégie PCR en deux étapes, les produits PCR IIC, IID, IIE, IIF et IIG ont été synthétisés dans la première étape, et les produits PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF et IIIG, dans la deuxième étape pour introduire des mutations à l’ensemble de l’ADN csgd. Les résultats de l’EMSA de la liaison HFQ aux ARN sauvages et mutants transcrits in vitro csgd, synthétisés à l’aide des produits PCR IIIC, IIID, IIIE, IIIF et IIIG, ont montré l’augmentation des valeurs KD des allèles mutants. Cela a prouvé que HFQ pouvait se lier moins efficacement aux mutants.En outre HFQ a plusieurs sites contraignants sur csgd, qui est montré par les trois décalages observés pour l’ARN de type sauvage. Cependant, seulement deux sites contraignants sont observés pour différents ARN mutants. Ainsi, l’approche mutationnelle dirigée par le site identifie les structures primaires et secondaires de l’ARNm CsgD qui sont importantes pour la liaison complète de HFQ.La méthode de mutagenèse dirigée par le site décrite ici repose sur pcr. De bonnes pratiques pcr sont donc cruciales pour la méthode et pourraient nécessiter une optimisation réussie. La mutagenèse dirigée par le site n’est puissante qu’avec les trois méthodes telles que l’EMSA et le Blotting occidental.D’autres méthodes, par exemple, incluent divers analyses structurelles et quelques analyses d’activité, et des études de modification post-traduction.

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