Name: Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Apprenez l'immobilisation de Caenorhabditis elegans vivants à l'aide d'une puce microfluidique ultra-mince en polydiméthylsiloxane avec rétention d'eau. Cette méthode permet l'irradiation ciblée et l'imagerie à long terme.

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Les auteurs remercient Dr Atsushi Higashitani pour aimables conseils concernant le traitement de c. elegans et DRS Yuya Hattori, Yuichiro Yokota et Yasuhiko Kobayashi pour discussions précieuses. Les auteurs tiennent à remercier le centre phytogénétique Caenorhabditis pour la fourniture de souches de c. elegans et e. coli. Nous remercions l’équipe du cyclotron de TIARA à Takasaki-TVQ pour leur aimable collaboration avec les expériences d’irradiation. Nous remercions le Dr Susan Furness pour l’édition d’un projet de ce manuscrit. Cette étude a été financée en partie par KAKENHI (Grant numéros JP15K11921 et JP18K18839) de la JSPS à M.S.

<ol><li>Funayama, T., Hamada, N., Sakashita, T., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-Ion+microbeams-development+and+applications+in+biological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Plasma+Science%22%5BJournal%5D)">Heavy-Ion microbeams-development and applications in biological studies.</a> IEEE Transactions on Plasma Science. 36 (4), 1432-1440 (2008).</li>
<li>Tanaka, A., Shikazono, N., Hase, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+biological+effects+of+ion+beams+on+lethality%2C+molecular+nature+of+mutation%2C+mutation+rate%2C+and+spectrum+of+mutation+phenotype+for+mutation+breeding+in+higher+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Studies on biological effects of ion beams on lethality, molecular nature of mutation, mutation rate, and spectrum of mutation phenotype for mutation breeding in higher plants.</a> Journal of Radiation Research. 51 (3), 223-233 (2010).</li>
<li>Ghita, M., Fernandez-Palomo, C., Fukunaga, H., Fredericia, P. M., Schettino, G., Bräuer-Krisch, E., Butterworth, K. T., McMahon, S. J., Prise, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbeam+evolution%3A+from+single+cell+irradiation+to+pre-clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Microbeam evolution: from single cell irradiation to pre-clinical studies.</a> International Journal of Radiation Biology. 94 (8), 708-718 (2018).</li>
<li>Suzuki, M., Hattori, Y., Sakashita, T., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+irradiation+system+with+heavy-ion+microbeam+for+active+individuals+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Region-specific irradiation system with heavy-ion microbeam for active individuals of Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Radiation Research. 58 (6), 881-886 (2017).</li>
<li>Funayama, T., Wada, S., Yokota, Y., Fukamoto, K., Sakashita, T., Taguchi, M., Kakizaki, T., Hamada, N., Suzuki, M., Furusawa, Y., Watanabe, H., Kiguchi, K., Kobayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heavy-ion+microbeam+system+at+JAEA-Takasaki+for+microbeam+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Heavy-ion microbeam system at JAEA-Takasaki for microbeam biology.</a> Journal of Radiation Research. 49 (1), 71-82 (2008).</li>
<li>Sugimoto, T., Dazai, K., Sakashita, T., Funayama, T., Wada, S., Hamada, N., Kakizaki, T., Kobayashi, Y., Higashitani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+arrest+and+apoptosis+in+Caenorhabditis+elegans+germline+cells+following+heavy-ion+microbeam+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell cycle arrest and apoptosis in Caenorhabditis elegans germline cells following heavy-ion microbeam irradiation.</a> International Journal of Radiation Biology. 82 (1), 31-38 (2006).</li>
<li>Fukamoto, K., Shirai, K., Sakata, T., Sakashita, T., Funayama, T., Hamada, N., Wada, S., Kakizaki, T., Shimura, S., Kobayashi, Y., Kiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+irradiation+method+for+the+first+instar+silkworm+larvae+using+locally+targeted+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Radiation+Research%22%5BJournal%5D)">Development of the irradiation method for the first instar silkworm larvae using locally targeted heavy-ion microbeam.</a> Journal of Radiation Research. 48 (3), 247-253 (2007).</li>
<li>Yasuda, T., Kamahori, M., Nagata, K., Watanabe-Asaka, T., Suzuki, M., Funayama, T., Mitani, H., Oda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abscopal+activation+of+microglia+in+embryonic+fish+brain+following+targeted+irradiation+with+heavy-ion+microbeam%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abscopal activation of microglia in embryonic fish brain following targeted irradiation with heavy-ion microbeam.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (7), 1-15 (2017).</li>
<li>Suzuki, M., Sakashita, T., Hattori, Y., Yokota, Y., Kobayashi, Y., Funayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+ultra-thin+chips+for+immobilization+of+Caenorhabditis+elegans+in+microfluidic+channels+during+irradiation+and+selection+of+buffer+solution+to+prevent+dehydration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of ultra-thin chips for immobilization of Caenorhabditis elegans in microfluidic channels during irradiation and selection of buffer solution to prevent dehydration.</a> Journal of Neuroscience Methods. 306, Aug 1 32-37 (2018).</li>
<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Schwarz, J., Spies, J. P., Bringmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+muscle+contraction+and+a+relaxed+posture+during+sleep-like+Lethargus%5BTitle%5D)+AND+%22Worm%22%5BJournal%5D)">Reduced muscle contraction and a relaxed posture during sleep-like Lethargus.</a> Worm. 1 (1), 12-14 (2012).</li>
<li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Experimental Biology. 204, Pt 10 1757-1764 (2001).</li>
<li>Sawin, E. R., Ranganathan, R., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+locomotory+rate+is+modulated+by+the+environment+through+a+dopaminergic+pathway+and+by+experience+through+a+serotonergic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">C. elegans locomotory rate is modulated by the environment through a dopaminergic pathway and by experience through a serotonergic pathway.</a> Neuron. 26 (3), 619-631 (2000).</li>
<li>Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+calcium+leakage+causes+mitochondrial+damage+in+Caenorhabditis+elegans+body-wall+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Heat-induced calcium leakage causes mitochondrial damage in Caenorhabditis elegans body-wall muscles.</a> Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).</li>
<li>Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+activity+of+neurons+and+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Imaging the activity of neurons and muscles.</a> WormBook. 2, 1-13 (2006).</li>
<li>Aubry, G., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+optical+developments+in+microfluidic+platforms+for+Caenorhabditis+elegans+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A perspective on optical developments in microfluidic platforms for Caenorhabditis elegans research.</a> Biomicrofluidics. 8, 011301(2014).</li>
<li>Lumirror Catalog. TORAY. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf">https://www.toray.jp/films/en/products/pdf/lumirror.pdf</a> (2018).</li>
<li>Otobe, K., Itou, K., Mizukubo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-moulded+substrates+for+the+analysis+of+structure-dependent+behaviour+of+nematodes%5BTitle%5D)+AND+%22Nematology%22%5BJournal%5D)">Micro-moulded substrates for the analysis of structure-dependent behaviour of nematodes.</a> Nematology. 6 (1), 73-77 (2004).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfabricated+array+of+clamps+for+immobilizing+and+imaging+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfabricated array of clamps for immobilizing and imaging C. elegans.</a> Lab on a Chip. 7 (11), 1515-1523 (2007).</li>
<li>Lockery, S. R., Lawton, K. J., Doll, J. C., Faumont, S., Coulthard, S. M., Thiele, T. R., Chronis, N., McCormick, K. E., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+dirt%3A+Microfluidic+substrates+for+nematode+neurobiology+and+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Artificial dirt: Microfluidic substrates for nematode neurobiology and behavior.</a> Journal of Neurophysiology. 99 (6), 3136-3143 (2008).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nature Protocols. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Fehlauer, H., Nekimken, A. L., Kim, A. A., Pruitt, B. L., Goodman, M. B., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+a+microfluidics+device+for+mechanical+stimulation+and+high+resolution+imaging+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using a microfluidics device for mechanical stimulation and high resolution imaging of C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56530(2018).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Immobilisation sur puce de c. elegans dans des conditions live à l’aide d’une puce de microfluidique PDMS mouillable permet l’irradiation microfaisceaux ciblée efficace de plusieurs animaux. La facilité de manutention et de fonctionnalités pour éviter le dessèchement font de ce système pour des applications non seulement dans l’irradiation des microfaisceaux, mais aussi dans plusieurs essais comportements. Ces feuilles de ver ont déjà été commercialisés et peuvent être facilement obtenus. Puces microfluidique cl...

Rayonnement, y compris les rayons x, rayons gamma et faisceau d’ions lourds, est employé couramment pour des applications biologiques telles que dans le diagnostic du cancer et le traitement et à la reproduction de faisceau d’ions. Nombreuses études et développements techniques se concentrent actuellement sur les effets des radiations1,2,3. Irradiation par Microfaisceaux est un moyen efficace d’identifier les sites sensible dans la vie des organismes4. Takasaki Advanced rayonnement recherche Institut des instituts nationaux pour Quantum et radiologiques Science et technologie (TVQ-Takasaki) a mis au point une technologie pour irradier les cellules individuelles sous observation microscopique à l’aide d’ions lourds micromadriers5et a établi des méthodes pour permettre l’irradiation microfaisceaux ciblé de plusieurs animaux de modèle, tels que le nématode Caenorhabditis elegans4,6, vers à soie7et Oryzias latipes (Japanese medaka)8. Irradiation de microfaisceaux ciblée du nématode c. elegans permet la précipitation efficace des régions spécifiques, tels que l’anneau nerveux dans la région céphalique, contribuant ainsi à identifier les rôles de ces systèmes dans des processus comme la locomotion.
Une méthode pour l’immobilisation sur puce de c. elegans individus sans la nécessité d’une anesthésie a été développée pour permettre à microfaisceaux irradiation4. En outre, pour améliorer les puces microfluidiques utilisés dans la précédente étude4, nous avons développé récemment mouillable, ion-pénétrable, polydiméthylsiloxane (PDMS) puces microfluidiques, appelées feuilles de ver (voir Table des matières), pour immobilisation de c. elegans personnes9. Il s’agit de feuilles souples ultra minces (épaisseur = 300 µm ; largeur = 15 mm ; longueur = 15 mm) avec plusieurs des canaux microfluidiques droites (20 ou 25) (profondeur = 70 µm ; largeur = 60 µm ou 50 µm ; longueur = 8 mm) à la surface (Figure 1A-D). Les canaux microfluidiques sont ouvertes et que plusieurs animaux puissent être enfermés en eux simultanément (Figure 1E). Les feuilles sont résilients pour permettre les canaux microfluidiques être augmenté (de ~ 10 %, Figure 1F), et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n'est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux.
Les canaux ne pas blesser les vers quand ils sont être enfermés ou lorsqu’ils sont recueillis. En outre, les feuilles sont fabriqués à partir de PDMS, qui est essentiellement hydrophobe, mais la rétention d’eau peut être réalisée en conférant une hydrophilicité à la matière. La rétention d’eau et l’épaisseur sont des caractéristiques favorables des feuilles de ver. La capacité de rétention d’eau, empêche la déshydratation des animaux après immobilisation prolongée et permet des observations à long terme à réaliser.
En outre, comme décrit plus haut9, les feuilles sont seulement 300 µm d’épaisseur, permettant de traverser la feuille contenant les animaux des ions lourds tels que les ions de carbone (avec une fourchette d’environ 1 mm dans l’eau). Ceci permet les particules d’ions pour être détectée et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. En outre, les feuilles de ver peuvent être réutilisés et sont donc économiques. Avec la méthode d’injection classiques, les animaux inclus sont parfois morts et ils ne peuvent être pris hors de la manche ; leurs œufs peuvent aussi obstruer les canaux. Cela rend la puce inutilisable. Puces sont donc fondamentalement jetables et la rentabilité ratio est pauvre.
Dans le présent document, nous décrivons en détail une série de méthodes pour l’immobilisation sur puce de direct c. elegans particuliers en utilisant des feuilles de ver. Par le biais de tests de locomotion des animaux 3 h après l’immobilisation sur puce, nous avons évalué le film de protection adapté. En outre, nous avons montré les exemples d’immobilisation sur puce pour les observations d’imagerie et irradiation microfaisceaux.

<table><tbody><tr><td>C. elegans souche de type sauvage</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis</td><td>N2</td><td>de type sauvage C. elegans souche généralement utilisée dans cette étude</td></tr> <tr><td>C. elegans unc-119(e2498) III mutante souche</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis</td><td>CB4845</td><td><souche em>C. elegans utilisée uniquement comme exemple de mutants avec une forme corporelle anormale&nbsp ;</td></tr><tr><td><souche transgénique em>C. elegans HBR4</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis</td><td>HBR4</td><td>Le génotype de cette souche transgénique C. elegans est HBR4 :goeIs3[pmyo-3 ::GCamP3.35 :: unc-54&ndash ; 3' utr, unc-119(+)]V. Cette souche n’a été utilisée que pour l’observation par imagerie.</td></tr><tr><td>E. coli strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC) , Minnesota, États-Unis</td><td>OP50</td><td>E. coli souche utilisée comme aliment pour C. elegans</td></tr><tr><td>Worm Sheet IR (50/60)</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japon</td><td>BCM17-0001</td><td>Puce microfluidique avec 25 50/60-&micro droites ; m canaux de largeur utilisés dans toutes les expériences et observations de cet article&nbsp ;</td></tr><tr><td>Worm Sheet 60</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japon</td><td>BCM18-0001</td><td>Puce microfluidique avec 20 60 droites &micro ; Canaux de largeur M. Ceci est sitable pour les adultes 3 à 5 jours après l’éclosion à 20 °C.</td></tr><tr><td>Worm Sheet 50</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japon</td><td>BCM18-0002</td><td>Puce microfluidique avec 20 50 &micro droits ; Canaux de largeur M. Ceci est sitable pour les jeunes adultes ~3 jours après l’éclosion à 20&deg ;C.&nbsp ;</td></tr><tr><td>VERRE MICRO COVER</td><td>MATSUNAMI GLASS IND. LTD.</td><td>C030401</td><td>Verre de couverture (épaisseur : 130-170 & micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3</td></tr><tr><td>Polystyrene Film</td><td>Biocosm, Inc., Hyogo, Japon</td><td>BCM18-0001/ BCM18-0002</td><td>Articles groupés de feuilles de vers. PS filim (épaisseur : ~130 & micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3.</td></tr><tr><td>Film polyester Lumirror TORAY</td><td>INDUSTRIES, INC., Tokyo, Japon</td><td>Lumirror T60 (t 125 & micro ; m)</td> <td>PET filim (épaisseur : 125 &micro ; m) utilisé dans les essais de locomotion dans le protocole 3</td></tr><tr><td>IWAKI 60 mm/parabole non traitée</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japon).</td><td>1010-060</td><td>Antenne non traitée utilisée pour l’induction de C. elegans dans le Protocole 1</td></tr><tr><td>IWAKI 35 mm/antenne non traitée</td><td>AGC Techno Glass Co., Ltd., Shizuoka, Japon).</td><td>1010-035</td><td>Antenne non traitée utilisée dans les essais de locomotion dans le protocole 3</td></tr><tr><td>Milli-Q</td><td>Merck, France</td><td></td><td>Eau ultrapure</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>Nippon Paper Crecia Co., Ltd., Tokyo, Japon</td><td>62020</td><td>120 mm x 215 mm ; 200 feuilles/ boîte</td></tr><tr><td>WormStuff Worm Pick</td><td>Genesee Scientific Corporation, CA, USA)</td><td>59-AWP</td><td>Platina picker spécialisé pour la prise C. elegans</td></tr><tr><td>Système de stéréomicroscope de recherche</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon</td><td>Micriscope SZX16</td><td>utilisé dans toutes les expériences et observations dans cet article</td></tr><tr><td>Support de mise au point motorisé pour SZX16</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon</td><td>SZX2-ILLB</td><td>Il a été utilisé pour l’observation en fond clair dans le protocole 3-8.</td></tr><tr><td>Objectif Lentille (& fois ; 1)</td> <td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon</td><td>SDFPLAPO1&times ; PF</td><td>NA : 0,15 ; L.D. : 60 mm. Ce prêt a été utilisé pour l’observation en fond clair dans le Protocole 3-8.</td></tr><tr><td>Objectif Lentille (& fois ; 2)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon</td><td>SDFPLAPO2XPFC</td><td>NA : 0,3 ; L.D. : 20 mm. Ce&nbsp ; Lends a été utilisé pour l’imagerie des observations.</td></tr><tr><td>Source lumineuse au mercure</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon</td><td>U-LH100HG</td><td>Le large spectre d’émission permet de mener une gamme d’expériences d’imagerie de fluorescence en utilisant tous les fluorophores courants.</td></tr><tr><td>Unité de filtre fluorescent SZX16 (haute performance pour YFP)</td><td>OLYMPUS CORPORATION, Tokyo, Japon</td><td>SZX2-FYFPHQ</td><td>Ex : 490-500 nm ; Em : 510 à 560. Cela a été utilisé pour l’observation par imagerie de la souche HBR4.</td></tr><tr><td>Appareil photo numérique haute vitesse EXILIM</td><td>CASIO COMPUTER Co., Ltd, Tokyo, Japon</td><td></td><td>EX-F1 Les figures 1B, 1E, 1F, Figure 2A-C et la vidéo 1 ont été obtenues à l’aide de cet appareil photo numérique.</td></tr><tr><td>Office 2013</td><td>Microsoft Co. Ltd, Redmond, WA, États-Unis Logiciel</td><td></td><td>Excel utilisé pour les analyses statistiques</td></tr></tbody></table>

immobilisation des individus vivants caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Rayonnement est employé couramment pour des applications biologiques et pour l’élevage de faisceau d’ions, et parmi ces méthodes, l’irradiation microfaisceaux représente un puissant moyen d’identifier les sites sensible dans les organismes vivants. Cet article décrit une série de méthodes d’immobilisation sur puce développées pour l’irradiation de microfaisceaux ciblé des individus vivants de Caenorhabditis elegans. Notamment, le traitement des puces microfluidiques polydiméthylsiloxane (PDMS) que nous avons développés précédemment pour immobiliser c. elegans individus sans avoir besoin d’anesthésie est expliquée en détail. Cette puce, dénommée une feuille de ver, est résiliente pour permettre les canaux microfluidiques à décompresser, et l’élasticité permet aux animaux d’être enveloppés doucement. En outre, en raison de la capacité d’adsorption indépendant du PDMS, animaux peut être scellé dans les canaux en couvrant la surface de la feuille de ver avec un film mince couverture, dans lequel les animaux n'est pas poussé dans les canaux pour enceinte. En tournant le couvercle du film plus, nous pouvons facilement recueillir les animaux. En outre, la feuille de ver montre la rétention d’eau et permet aux individus de c. elegans de faire l’objet d’une observation microscopique pendant de longues périodes dans des conditions live. En outre, la feuille est seulement 300 µm d’épaisseur, ce qui permet des ions lourds tels que les ions de carbone pour passer à travers la feuille renfermant les animaux, permettant ainsi à détecter les particules d’ion et la dose de rayonnement appliquée à mesurer avec précision. Parce que les films de couverture utilisé pour enfermant les animaux est très importante pour l’immobilisation à long terme avec succès, nous avons procédé la sélection des films adaptés de la couverture et a montré un recommandée chez certains films. Comme un exemple d’application de la puce, nous avons introduit l’observation d’imagerie des activités musculaires des animaux entourant le canal microfluidique de la feuille de ver, ainsi que l’irradiation de microfaisceaux. Ces exemples indiquent que les feuilles de ver ont considérablement élargi les possibilités d’expériences biologiques.

Active c. elegans individus pourraient être immobilisés avec succès en utilisant un PDMS ultra-mince, mouillable, puce microfluidique (feuille de ver). Nous avons étudié la pertinence des films de couverture différente pour l’étanchéité de la feuille de ver, comme décrit dans le protocole 3 de l’article. Pour évaluer les effets d’étanchéité des films de la couverture, nous avons déterminé la motilité des animaux 3 h après immobilisation sur puce en utilisant le couvercle en verre...

Une série de méthodes d’immobilisation a été créée pour permettre l’irradiation ciblée des vivants Caenorhabditis elegans individus utilisant un microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-thin récemment développés puce avec rétention d’eau. Cette nouvelle immobilisation sur puce est aussi convenable pour l’imagerie des observations. Le traitement détaillé et exemples d’application de la puce sont expliqués.

Immobilisation des individus vivants Caenorhabditis elegans en utilisant une puce de microfluidique de polydiméthylsiloxane ultra-mince avec rétention d’eau

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Un avantage de ce protocole est que la feuille de ver est facile à manipuler. La feuille a des caractéristiques qui empêchent le séchage, ce qui nous permet d’effectuer l’irradiation des microbes aux animaux vivants, effectuer plusieurs analyses comportementales, et l’observation à long terme. Les canaux microfluidiques de cette feuille de ver sont ouverts, ce qui facilite la collecte des animaux.Ces feuilles de ver peuvent également être utilisées à plusieurs reprises, ce qui les rend plus économiques. Lorsque nous avons développé cette technique, nous voulions irradier seulement une partie des animaux avec un microbeam sous un microscope. Nous avions donc besoin de copeaux clairs et très fins capables de tenir les animaux.Pour commencer, placez une feuille mince et transparente sur la scène pour l’utiliser comme film de couverture inférieure. Placez délicatement une feuille de ver sur le film de couverture inférieure avec des pinces plates. Placez au moins trois gouttelettes de solution tampon à la surface d’une boîte de Pétri non traitée de 6 centimètres.Ensuite, choisissez plusieurs C.elegans adultes avec un cueilleur de platina dans une assiette de culture. Transférer les animaux dans une gouttelette avec le cueilleur de platina et permettre aux animaux de nager dans le tampon pour éliminer les bactéries. Lavez les animaux dans deux gouttelettes séparées et rincez les animaux dans une autre gouttelette.Ensuite, placez une gouttelette de solution tampon sur la surface de la feuille de ver. Retirez les animaux lavés de la gouttelette tampon et transférez-les sur une gouttelette sur la feuille de ver. Utilisez des pinces plates pour placer un film de couverture PS sur la feuille de ver, et appuyez doucement sur les canaux d’une extrémité de la feuille à l’autre.Ou tout simplement déposer les animaux dans la gouttelette et sceller doucement avec le film de couverture afin gouttelette s’étend entre le couvercle et les feuilles de ver avec les animaux dans le canal. Confirmez que les animaux sont vivants en vérifiant le mouvement avec un microscope à 1-2x grossissement. Enregistrez les positions des animaux et notez spécifiquement le numéro du canal dans lequel chaque animal est enfermé, et la position de chaque animal dans le canal.Pour recueillir les animaux immobilisants, utilisez des pinces plates pour enlever le film de couverture de la feuille de ver, puis déposez 10-15 microlitres de solution tampon sur l’un des canaux microfluidiques enfermant les animaux. Sous le stéréomicroscope, observez les animaux lorsqu’ils commencent à tourner. Ensuite, utilisez le ramasseur de platina pour ramasser les animaux de natation et les transférer dans une plaque d’analyse.Après avoir enfermé les animaux comme démontré précédemment, observez les taches fluorescentes sur les animaux avec un microscope flourescence. Puis image calcium ion wave propagation en utilisant l’acquisition vidéo pour observer les activités dynamiques. Placez la feuille de ver usée sur une boîte de Pétri de six centimètres et placez environ 100 microlitres d’eau ultra-pure stérilisée sur la feuille.Utilisez des doigts gantés pour étendre l’eau à la surface de la feuille et laver les contaminants. Ensuite, utilisez des lingettes jetables pour éliminer l’humidité de la feuille de ver. Distribuez cinq millilitres d’éthanol à 70 % dans la boîte de Pétri et utilisez des doigts gantés pour étendre l’éthanol sur la feuille de ver.Enfin, une fois la feuille sèche, déposer la feuille sur une boîte de Pétri stérile et couvrir. En utilisant ce protocole, l’adéquation des différents films de couverture a été étudiée. Il n’y avait aucune différence significative dans la motilité entre les animaux de contrôle et les animaux enfermés dans des canaux microfluidiques avec le film de PS.En revanche, la motilité a été sensiblement réduite chez les animaux enfermés sous un verre de couverture. La motilité des animaux enfermés dans un film pour animaux de compagnie a également été considérablement diminuée. Il est important de sélectionner soigneusement les films de couverture pour l’étanchéité des canaux microfluidiques.En utilisant ce protocole, nous avons évalué l’adéquation des différents films de couverture à travers des analyses de locomotion des animaux trois heures après l’immobilisation sur puce. En utilisant cette technique, nous avions l’intention de développer une puce humide ultra-mince uniquement pour l’irradiation des microbes. Cependant, ces feuilles de ver ont déjà été utilisées pour l’imagerie et les analyses comportementales au-delà de leurs applications originales.

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