Longitudinale morphologiques et physiologiques surveillance des sphéroïdes de tumeur en trois dimensions à l’aide de la tomographie à cohérence optique

Les sphéroïdes tumoraux tridimensionnels peuvent imiter les propriétés spécifiques aux tissus des tumeurs in vivo, fournissant des données plus cliniquement pertinentes pour la découverte de médicaments anticancéreux que la simple culture cellulaire 2D. Notre technique d’imagerie, la tomographie par cohérence optique, permet de visualiser facilement la structure 3D d’un seul nerf tumoral, d’une taille de plusieurs centaines de microns, et de fournir une caractérisation plus précise de sa morphologie et de son infestation de travail, souvent en quelques secondes. En utilisant le modèle sphérique 3D, nous pouvons potentiellement raccourcir le calendrier de découverte de médicaments, réduire les coûts et apporter de nouveaux médicaments aux patients plus efficacement.

Former la forme sphérique du cluster tumoral est une étape critique de notre expérience. Il est important de choisir la bonne plaque d’attachement ultra-basse avec le fond rond, et la vitesse de centrifugation appropriée après l’ensemencement cellulaire. Commencez cette expérience en cultivant des cellules intéressantes dans un flacon de culture tel que décrit dans le manuscrit.

Maintenir les cellules dans un incubateur dans des conditions standard, et surveiller leur état de santé tous les jours. Rafraîchissez les médias au besoin. Pour effectuer la culture cellulaire 3D dans des plaques multi-puits, retirez d’abord le milieu du flacon de culture cellulaire et lavez les cellules avec du PBS stérilisé à 33 degrés Celsius préchauffé.

Ajouter ensuite un millilitre de Trypsin-EDTA pour résusquer les cellules et incuber pendant trois minutes à 37 degrés Celsius. Ajouter trois millilitres de milieu de culture pour diluer la trypsine. Transférer cette suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 15 millilitres et une centrifugeuse à 500 G et à température ambiante pendant cinq minutes.

Retirez ensuite le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire avec quatre millilitres de milieu de culture préchauffé. Pour déterminer la concentration cellulaire, hypérifiez une goutte d’échantillon sur un hémocytomètre et comptez les cellules. Diluer à la concentration désirée d’ensemencement.

Ensemencer 200 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque multi-puits à fond rond ultra-faible, à une concentration de 3000 cellules par millilitre, pour atteindre environ 600 cellules par puits. Immédiatement après l’ensemencement, centrifugez toute la plaque à la vitesse la plus basse disponible, à température ambiante, pendant sept minutes. Placez la plaque dans l’incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de Co2, en vous assurant de rafraîchir le milieu tous les trois jours.

Tout d’abord, construire le bras de référence et le bras d’échantillon du système OCT, en suivant les schémas de ce manuscrit. Ensuite, construisez le spectromètre, y compris un kilomètre, un classement, une lentille F-Theta et une caméra de balayage en ligne. Utilisez un adaptateur de plaque pour maintenir la plaque multi-puits dans une position fixe.

Avant l’imagerie, corrigez l’inclinaison et la rotation de la plaque multi-puits à l’aide d’une étape d’inclinaison 2D, et d’une étape de rotation montée sur l’étape de transition afin de minimiser la variation du plan focal à partir de différents puits. Ajustez ensuite la rotation pour vous assurer que les bords de la plaque sont parallèles à la direction du mouvement de la scène, de sorte que les puits restent aux mêmes positions horizontales dans les images OCT. Ajustez ensuite le stade d’inclinaison pour vous assurer que la plaque est parallèle à la table optique, de sorte que les puits restent aux mêmes endroits verticaux pour l’imagerie.

Le jour de l’imagerie des sphéroïdes tumoraux, retirez la plaque multi-puits de l’incubateur. Transférez-le sous le système d’imagerie OCT et placez-le sur l’adaptateur de plaque. Pour ajuster la hauteur de la plaque, déplacez-la le long de la direction Z de l’étape de traduction.

Dans le logiciel d’imagerie personnalisé, définissez une plage de balayage oct souhaitée pour couvrir l’ensemble du sphéroïde tumoral, en fonction de ses stades de développement, et cliquez sur enregistrer les paramètres pour enregistrer le paramètre. Montrez ensuite les aperçus optimisés XZ et YZ OCT des sphéroïdes tumoraux. Acquérir des images OCT 3D de sphéroïdes tumoraux un par un pour tous les puits de la plaque contenant des sphéroïdes.

Pour afficher l’image de prévisualisation, cliquez sur le bouton aperçu. Et pour acquérir l’image OCT, cliquez sur le bouton acquérir. Enregistrez le processus global de déplacement de l’étape de l’acquisition de données oct.

Pour assurer la qualité d’image optimale pour tous les sphéroïdes tumoraux, l’adaptateur de plaque doit être réglé avec précision et le volume médian doit être le même. Utilisez un code c+processing personnalisé pour traiter des ensembles de données OCT 3D de sphéroïdes tumoraux pour générer des images structurelles oct. Utilisez des images OCT 2D dans trois plans transcoupés, XY, XZ et YZ à travers le centroïde du sphéroïde pour générer le collage d’images sphéroïdes.

Pour obtenir le rendu 3D du sphéroïde à l’aide d’un logiciel désiré, chargez d’abord les données SD OCT dans le logiciel. Cliquez sur le panneau surpass, puis ajoutez un nouveau volume, et choisissez le mode de mélange à utiliser pour le rendu 3D. Pour ajuster l’angle de vision, utilisez le pointeur de la souris pour faire glisser l’image et procéder à la quantification décrite dans le manuscrit.

Un collage d’images oct non fazed des sphéroïdes de ligne cellulaire HCT116 a été généré à partir des données traitées, avec des résultats comparables aux images d’autres systèmes d’imagerie à haut débit 2D. En outre, le collage des images sphéroïdes transversales 2D de 96 puits a été généré pour surveiller des hauteurs sphéroïdes, et visualiser l’inhomogeneity sphéroïde dans la direction verticale. Un collage d’images sphéroïdes rendues 3D peut être généré à partir de n’importe quel angle prédéfinisé pour visualiser la forme 3D globale et évaluer la rondeur du sphéroïde.

Après le post-traitement général d’OCT, des images structurales 3D d’OCT d’un sphéroïde de tumeur ont été obtenues. À partir des données oct, un poteau de surface 3D et des tranches orthogonales XZ, YZ et XY ont été générés pour visualiser la structure du sphéroïde de tumeur dans n’importe quelle direction. La surveillance longitudinale d’un sphéroïde simple de tumeur a été exécutée pour caractériser son diamètre, taille, et volume voxel-basé, générant les courbes de croissance dans la taille et le volume pendant le développement de 21 jours.

Ici, le sphéroïde a été perturbé le jour 11, et s’est complètement effondré le jour 21. Le suivi longitudinal a montré l’augmentation des secteurs de cellules mortes dans le sphéroïde de tumeur. Les images 3D-rendues du sphéroïde de tumeur ont montré l’aspect et la croissance des régions de cellules mortes du jour sept au jour 14, comme montré par l’augmentation des secteurs nécrotiques mis en évidence rouges.

Comme le pourcentage des secteurs nécrotiques a augmenté, le sphéroïde de tumeur ne pouvait pas maintenir sa forme parfaite, et s’est donc effondré. Avec cette plate-forme d’imagerie, nous pouvons explorer d’autres modèles complexes de sphère de tumeur, tels que le modèle d’imagerie 3D, le modèle vaste de créature et les modèles de co-culture pour mieux simuler des tumeurs in vivo. Notre système d’imagerie OCT à haut débit peut fournir une approche alterative pour le dépistage des médicaments dans la découverte de médicaments contre le cancer.

C’est quelque chose qui caractérise également les échantillons biofabriqués 3D pour diverses applications biomédicales.