Mesurer le remodelage et la recréation du microenvironnement tumoral-os à l’aide de la co-culture Calvaria et de l’histomorphométrie

Le but de cette procédure est d’avoir un modèle ex vivo pour évaluer le remodelage d’os et recréer le microenvironnement tumeur-os utilisant la culture de calvaria ou la co-culture avec des cellules cancéreuses. La plupart de la technique de calvaria est un système de culture d’organe utilisant des os de calvaria des souris néonatales pour évaluer le remodelage d’os. Vous pouvez tester le potentiel thérapeutique de diverses molécules, ou même recréer le microenvironnement os-tumeur lorsque vous utilisez des co-cultures avec des cellules cancéreuses.

Tout cela dans un essai simple et facile en peu de temps et un faible coût. Le but de cette technique est d’avoir un outil pour évaluer la régénération osseuse dans le microenvironnement des os du cancer, en utilisant un modèle ex vivo de la culture des organes calvariaux de souris. Tout d’abord, sélectionnez un chiot de souris et placez-le sous le capot.

Nous utilisons des calvaria de chiots souris de cinq à sept jours. Prenez la tête avec la seringue, couper la peau, et effacer la zone du cuir chevelu assez pour disséquer la calvaria. Identifier les sutures du crâne, du sagittal, du coronal et des lambdoids.

Faire une coupe droite le long des sutures lambdoid, à peu près le niveau de l’œil. Couper de chaque côté, des sutures lambdoid vers la suture coronale. À 45 angle, faire une autre coupe pour connecter l’extrémité de la coupe faite avec la coupe de la fontanel antérieure.

Il est extrêmement important de définir les sutures du crâne, sagittales, frontales, coronal, lambdoid, pour garantir l’inclusion correcte des tissus et l’analyse histologique. Avec des pointes fines forceps, retirer la calvaria, et le mettre sur un couvercle de boîte de Pétri. À l’aide d’un scalpel, faire une coupe droite à partir du fontanel postérieur le long de la suture sagittale à travers la suture coronale.

Deux hemicalvarias sont obtenus. Choisissez chaque calvaria avec les forceps, et placez-les dans une nouvelle boîte de Pétri avec PBS. Pour la culture, placez l’hemicalvaria dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits, contenant un millilitre de médias, et incubez pendant 24 heures à 37 degrés.

Nous pouvons également employer les cultures calvariales primaires pour reproduire le microenvironnement tumeur-os pour la résorption d’os. Pour ce faire, nous co-culture calvarias avec les cellules cancéreuses, ou avec des médias conditionnés à partir de cellules cancéreuses. 24 heures plus tard, retirez le média et remplacez-le par des supports contenant le traitement que vous souhaitez tester.

Si vous souhaitez évaluer les cellules cancéreuses et les interactions osseuses, ou recréer le microenvironnement tumeur-os, passez la calvaria à une plaque d’attachement cellulaire basse, afin d’éviter l’attachement des cellules cancéreuses à la plaque. Essayez de trypsiniser les cellules cancéreuses, de les compter et de les placer soigneusement au sommet de l’hemicalvaria. Vous pouvez également utiliser des supports conditionnels à partir de cellules cancéreuses, et l’utiliser pour incuber l’hemicalvaria.

Incuber pendant six à sept jours à 37 degrés, avec cinq pour cent de CO2. Le troisième jour, changez les médias et continuez à couver. Le nombre de cellules utilisant dans la co-culture dépend de la lignée cellulaire du cancer.

Vous devez, tout d’abord, optimiser le nombre de cellules dont il est nécessaire pour induire une réponse dans l’un. Après la culture, la calvaria passe par un processus de fixation, de décalcification et d’encastrement paraffine. En outre, les tissus sont sectionnés dans un microtome, taché, et l’analyse histomorphométrique est effectuée.

L’inclusion de la calvaria peut être délicate. Pour vous assurer que le tissu est protégé pendant l’inclusion, vous pouvez mettre le tissu entre les éponges ou utiliser un papier de soie ou tout autre papier absorbant avant de le mettre dans la cassette. Pour le traitement des tissus, envelopper l’hemicalvaria dans du papier de soie.

Ensuite, placez-le dans une cassette d’intégration, et fixez-le en tampon neutre en formaline, pendant 24 heures à quatre degrés. Pour décalcifier la calvaria, placez la cassette dans un 10%EDTA pendant 48 heures à quatre degrés. Traiter les cassettes tissulaires avec l’hemicalvaria dans un processeur de tissu automatique.

Suivez un cycle de rotation régulier d’une journée, puis, inclure dans la paraffine. Pour le sectionnement, couper quatre sections microtiques à l’aide d’une microtome, monter les sections sur des toboggans au microscope en verre et tacher avec de l’hématoxyline, de l’éosine. L’analyse d’histologie a été employée pour effectuer l’analyse quantitative de la surface d’os et des secteurs de remodelage d’os.

Les images de la calvaria sur les sept jours ont été analysées à l’aide du logiciel d’imagerie. Pour l’évaluation quantitative, tout d’abord, définissez le domaine pour l’analyse. Regardez dans les sections sur la télopa où quatre X pour identifier l’orientation et les sutures.

Définissez la suture coronale, et identifiez la longue surface osseuse d’un côté, puis la surface courte de l’autre. Dans le cadre du grossissement 40X, identifiez la suture coronale et éloignez deux ou trois champs optiques de la suture, le long de la longue surface. Capturez l’image de cette zone pour analyse.

Vous pouvez utiliser un logiciel d’images pour analyser l’intégrité structurelle de l’os. L’analyse histomorphométrique quantitative pour l’épaisseur et la zone osseuse de l’hemicalvaria peut être faite. L’analyse correcte de calvaria dépend d’une bonne intégration et d’une orientation appropriée pour des résultats histologiques cohérents.

Assurez-vous d’utiliser au moins trois calvaria par condition expérimentale. Ici, nous pouvons voir la structure de l’os. En orange, l’os est observé.

Nous pouvons également voir la présence du périoste, de l’ostocyte, de l’endostée, et d’autres parties de l’os. Dans notre cas, nous utilisons l’insuline pour augmenter le remodelage osseux. Par rapport à un contrôle, nous pouvons voir une augmentation significative de la zone osseuse.

Ici, nous pouvons voir l’effet de la ligne cellulaire MDA-MB-231 sur le modèle calvaria. Nous pouvons voir, par rapport au contrôle, que la présence de cellules cancéreuses induit des facteurs ostéolytiques qui stimulent la destruction osseuse. Nous avons utilisé le modèle calvaria pour mesurer la régénération osseuse et les interactions cellules-os cancéreuses par des co-cultures avec les cellules cancéreuses et l’histologie.

Nous validons également nos données par PCR quantitative en temps réel. Ce modèle ex vivo ont de nombreux avantages, comme l’organisation tridimensionnelle et la diversité cellulaire de l’os sont préservés, et les conditions expérimentales peuvent être contrôlées. En outre, le modèle est simple, vous pouvez voir les résultats dans un court laps de temps, et il est à faible coût.

Et il peut être combiné avec d’autres techniques, comme la PCR quantitative en temps réel, la microscopie et la micro-CT.