Caractérisation entièrement autonome et collecte de données auprès des cristaux des macromolécules biologiques
March 22nd, 2019
Nous décrivons ici comment utiliser le contrôle automatisé et les possibilités de collecte de données disponibles à certains faisceaux de rayonnement synchrotron. Scientifiques envoyer des échantillons de cryocooled le synchrotron et les propriétés de diffraction sont examinées, les ensembles de données sont collectées et traitées et, si possible, une solution de la structure est réalisée — tout cela sans intervention humaine.
La cristallographie aux rayons X est la technique dominante pour déterminer l’information structurale 3D à partir de protéines. Des lignes de faisceau de synchrotron sont nécessaires pour obtenir des données des petits cristaux faiblement diffracting que les protéines produisent. Massive est une ligne de faisceau unique parce qu’elle automatise entièrement le processus de collecte de données à partir de macromolécules biologiques.
À partir du montage d’échantillons, de l’emplacement et de la collecte finale de données. L’automatisation complète de ce type est très importante car elle permet aux chercheurs de passer leur temps en laboratoire, au lieu de recueillir des données sur la ligne de faisceau. La ligne de faisceau est également intelligente et, en moyenne, peut recueillir de meilleures données que lorsque la ligne de faisceau est actionnée par des humains.
Pour commencer ce protocole, effectuez le montage de cristal et demandez le temps de faisceau sur massive tel que décrit dans le protocole de texte. Accédez au système d’information pour les lignes de faisceau de cristallographie protéique, ou au site Web de l’ISPyB. Choisissez des expériences MX, connectez-vous avec le numéro d’expérience et le mot de passe.
Cliquez sur l’expédition, ajoutez de nouvelles informations et fournissez les informations nécessaires. Cliquez ensuite enregistrer. Cliquez sur ajouter le colis et remplissez les informations demandées.
Cliquez sur enregistrer, puis cliquez sur ajouter le conteneur. Donnez le code à barres de la rondelle comme nom, et choisissez la rondelle de la colonne vertébrale, cliquez à nouveau enregistrer. Cliquez sur le symbole du conteneur et modifiez, et remplissez les informations nécessaires concernant les échantillons tels que le nom de protéine, le flux de travail préféré, et la position cristalline, dans la rondelle.
Choisissez la protéine qui a été approuvée par le groupe de sécurité ESRF. Entrez un nom d’échantillon unique pour identifier chaque échantillon individuel. En option, numérisez le code à barres pin.
Le reste de l’information à inclure est également facultatif. Pour chaque échantillon individuel, entrez le type d’expérience. Cela définit quel flux de travail automatique sera utilisé pour traiter chaque cristal.
Étant donné que les cristaux GCSH sont des aiguilles, choisissez MX appuyez sur P.Next, entrez dans un groupe spatial. S’il est présent, il sera utilisé pour le calcul de la stratégie de collecte de données et par les lignes automatiques de traitement des données disponibles. Entrez la résolution désirée.
Cela définit la distance du cristal au détecteur par rapport aux balayages de maille initiaux, la caractérisation et la collecte de données par défaut. Maintenant, définissez la résolution de seuil souhaitée pour empêcher la collecte d’ensembles de données complets à partir de cristaux qui ne se diffractent pas à cette limite. Cela peut économiser de l’espace de stockage de données et analyse le temps.
Définissez l’exhaustivité requise. Réglez ensuite la multiplicité requise. Si plus d’un cristal est contenu sur le support de l’échantillon, définissez le nombre maximum de cristaux à analyser.
La valeur par défaut est d’un ou cinq pour la presse MX P.La taille appropriée du faisceau peut également être sélectionnée. Mettez dans le groupe spatial, s’il est connu, dans la colonne de groupe spatial de force. Réglez ensuite la sensibilité au rayonnement des cristaux.
Si vous le souhaitez, définissez l’angle de rotation total à collecter pour la collecte complète de l’ensemble de données. Une fois que toutes les informations ont été entrées dans le système, enregistrez les valeurs. Cliquez dessus, retournez aux envois et appuyez sur envoyer l’envoi à l’ESRF.
Imprimez l’étiquette d’expédition et envoyez les échantillons. Les utilisateurs doivent organiser un ramassage avec un courrier en utilisant les détails du compte ESRF. Le jour de l’expérience, les échantillons sont transférés à la rosée massive d’une grande capacité.
Les scientifiques de la ligne beam lancent ensuite la collecte de données, qui peut être suivie par les utilisateurs à distance. Pour chaque type d’échantillon différent, les utilisateurs reçoivent un e-mail les informant que la collecte de données a commencé. L’exécution de toutes les étapes de tous les flux de travail peut être suivie en ligne et en temps réel.
Ceci est accessible à l’utilisateur en se connectant à ISPyB. Les résultats peuvent également être consultés et téléchargés. Pour chaque échantillon analysé, examinez les résultats de l’expérience automatique sur ISPyB.
Cliquez sur la session expérimentale souhaitée à ID30A1. Sélectionnez le pipeline de traitement automatique préféré. Téléchargez les données écrites dans le groupe spatial correct avec la plus grande compléttivité et la résolution la plus élevée.
En cliquant sur les derniers résultats de collecte, puis télécharger. Le flux de travail MX press P a été utilisé par la ligne de faisceau ESRF Massive pour monter entièrement automatiquement, centrer dans le faisceau de rayons X, caractériser et collecter des ensembles de données de diffraction complète à partir d’une série de cristaux de GCSH humain. Les échantillons ont été montés et la boucle analysée pour une zone à numériser.
Après les analyses de diffraction, quatre points ont été sélectionnés dans le cristal pour la collecte de données. La détermination manuelle de la structure par remplacement moléculaire a donné une carte de densité électronique de haute qualité après un seul cycle automatisé de raffinement. Pour cet ensemble de données, le pipeline automatisé a coupé les données à un point trois deux résolution angstrom.
Toutefois, les utilisateurs peuvent décider de couper les données à une résolution inférieure. La densité continue d’électrons est visible pour toute la chaîne d’acides aminés en dehors de l’étiquette d’histidine éterminale. Sur les quatre substitutions qui distinguent le GCSH humain et bovin, trois sont facilement identifiables dans la densité des électrons.
C’est moins clair pour l’acide aspartique de lysine 125 substitution. Pour lequel la densité électronique de la chaîne latérale n’est que partiellement résolue en raison de la flexibilité. Le modèle actuellement obtenu a une valeur de travail R de 20 points quatre pour cent et une valeur R libre de 23 points huit pour cent et peut être encore optimisé par des cycles supplémentaires de construction et de raffinement de modèles automatisés et manuels.
Il est important d’adapter les exigences à votre système. Par exemple, le réglage de la résolution déjà observée à une valeur connue peut gagner du temps et assurer une meilleure collecte de données. La collecte de données entièrement automatique a démocratisé la cristallographie et maintenant même les petits laboratoires peuvent se lancer dans un projet célèbre alors que cela n’était possible auparavant qu’avec une énorme puissance de l’homme.
Aperçu
Cet article décrit le processus de dépistage automatisé et de collecte de données sur les lignes de faisceaux synchrotron pour la cristallographie des protéines. Le système entièrement automatisé permet aux chercheurs de collecter et de traiter efficacement les données à partir d'échantillons cryo-refroidis sans intervention humaine.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Cristallographie des protéines
- Diffraction des rayons X
- Automatisation de la collecte de données
Contexte
- La cristallographie aux rayons X est essentielle pour déterminer les structures des protéines.
- Les lignes de faisceaux synchrotron sont cruciales pour obtenir des données à partir de cristaux faiblement diffracteurs.
- L'automatisation améliore l'efficacité et la qualité de la collecte de données.
- Massive one offre une ligne de faisceau entièrement automatisée pour les macromolécules biologiques.
Objectif de l'étude
- Démontrer le processus de collecte de données automatisées sur les lignes de faisceaux synchrotron.
- Mettre en évidence les avantages de l'automatisation en cristallographie des protéines.
- Fournir un protocole détaillé pour les chercheurs à suivre.
Méthodes utilisées
- Montage de l'échantillon et expédition vers le synchrotron.
- Utilisation du système d'information ISPyB pour la gestion des expériences.
- Flux de travail automatisés de collecte et de traitement des données.
- Surveillance en temps réel de la collecte de données et analyse des résultats.
Résultats principaux
- Collecte réussie de données de diffraction de haute qualité à partir de cristaux de GCSH humains.
- Le traitement automatisé a produit une carte de densité électronique haute résolution.
- Identification de différences structurelles entre GCSH humain et bovin.
- Démonstration de l'efficacité des flux de travail automatisés en cristallographie.
Conclusions
- L'automatisation de la collecte de données démocratise l'accès à la cristallographie.
- Les petits laboratoires peuvent désormais entreprendre des projets complexes auparavant limités aux grandes installations.
- L'adaptation des paramètres expérimentaux peut améliorer l'efficacité de la collecte de données.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Fully automated synchrotron beamlines reduce manual intervention in macromolecular crystallography, enabling high-throughput screening and data collection from weakly diffracting crystals. This automation enhances data quality and throughput, allowing biopharma R&D teams to allocate scientific effort toward target validation and lead optimization rather than beamline operations. The technology democratizes access to structural biology, supporting early-stage de-risking of therapeutic targets through reliable 3D structural insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by providing high-resolution structural data on biological macromolecules.
- Operational Value: Supports functional target validation through automated characterization and data collection from crystallization trials.
- Predictive Value: Increases confidence in target models by delivering consistent, high-quality electron density maps for structure-guided design.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated crystal systems for downstream workflows by automating mounting, centering, and diffraction analysis.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility via predefined workflows and real-time monitoring through ISPyB.
- Scalability: Enables screening of large numbers of crystals and reuse of automated pipelines across projects.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage structural data to preclinical validation by providing reliable models for mechanistic studies.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by identifying structural differences between species variants, such as human and bovine GCSH.
- Mechanistic De-risking: Clarifies binding sites and flexibility, aiding in the interpretation of structure-activity relationships.
Pipeline & Workflow Integration
The automated beamline integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification, supporting data generation for downstream analytics and modeling.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by solving crystal structures of proteins and complexes.
- Screening: Delivers assay-ready systems with quantitative outputs such as resolution, completeness, and multiplicity for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides measurable readouts including R-work and R-free values, resolution cutoffs, and electron density maps to compare experimental conditions.
- Translational Research: Connects structural insights to preclinical continuity by enabling species-specific model refinement, as demonstrated with GCSH.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for structural screening across multiple targets, reducing dependency on site-specific expertise.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target models, reduction of mechanistic ambiguity, and support for structure-based drug design.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of data collection across samples and projects.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency through reduced beamline staffing, and lowered biological risk in lead selection.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on structural confidence and data quality metrics.
Implementation Considerations
- Expertise in protein crystallography and sample preparation is required for successful crystal mounting and characterization.
- Access to synchrotron facilities and instrumentation such as the Massive one beamline is essential for automated data collection.
- Standardization across teams requires consistent use of ISPyB for experiment tracking, workflow selection, and result retrieval.
- Adaptation across model systems involves adjusting parameters such as resolution thresholds, space group, and radiation sensitivity based on crystal properties.
- Practical limitations include the need for cryocooled samples and dependency on crystal quality, which affects automated workflow success rates.
