Caractérisation entièrement autonome et collecte de données auprès des cristaux des macromolécules biologiques
22 mars 2019
Nous décrivons ici comment utiliser le contrôle automatisé et les possibilités de collecte de données disponibles à certains faisceaux de rayonnement synchrotron. Scientifiques envoyer des échantillons de cryocooled le synchrotron et les propriétés de diffraction sont examinées, les ensembles de données sont collectées et traitées et, si possible, une solution de la structure est réalisée — tout cela sans intervention humaine.
La cristallographie aux rayons X est la technique dominante pour déterminer l’information structurale 3D à partir de protéines. Des lignes de faisceau de synchrotron sont nécessaires pour obtenir des données des petits cristaux faiblement diffracting que les protéines produisent. Massive est une ligne de faisceau unique parce qu’elle automatise entièrement le processus de collecte de données à partir de macromolécules biologiques.
À partir du montage d’échantillons, de l’emplacement et de la collecte finale de données. L’automatisation complète de ce type est très importante car elle permet aux chercheurs de passer leur temps en laboratoire, au lieu de recueillir des données sur la ligne de faisceau. La ligne de faisceau est également intelligente et, en moyenne, peut recueillir de meilleures données que lorsque la ligne de faisceau est actionnée par des humains.
Pour commencer ce protocole, effectuez le montage de cristal et demandez le temps de faisceau sur massive tel que décrit dans le protocole de texte. Accédez au système d’information pour les lignes de faisceau de cristallographie protéique, ou au site Web de l’ISPyB. Choisissez des expériences MX, connectez-vous avec le numéro d’expérience et le mot de passe.
Cliquez sur l’expédition, ajoutez de nouvelles informations et fournissez les informations nécessaires. Cliquez ensuite enregistrer. Cliquez sur ajouter le colis et remplissez les informations demandées.
Cliquez sur enregistrer, puis cliquez sur ajouter le conteneur. Donnez le code à barres de la rondelle comme nom, et choisissez la rondelle de la colonne vertébrale, cliquez à nouveau enregistrer. Cliquez sur le symbole du conteneur et modifiez, et remplissez les informations nécessaires concernant les échantillons tels que le nom de protéine, le flux de travail préféré, et la position cristalline, dans la rondelle.
Choisissez la protéine qui a été approuvée par le groupe de sécurité ESRF. Entrez un nom d’échantillon unique pour identifier chaque échantillon individuel. En option, numérisez le code à barres pin.
Le reste de l’information à inclure est également facultatif. Pour chaque échantillon individuel, entrez le type d’expérience. Cela définit quel flux de travail automatique sera utilisé pour traiter chaque cristal.
Étant donné que les cristaux GCSH sont des aiguilles, choisissez MX appuyez sur P.Next, entrez dans un groupe spatial. S’il est présent, il sera utilisé pour le calcul de la stratégie de collecte de données et par les lignes automatiques de traitement des données disponibles. Entrez la résolution désirée.
Cela définit la distance du cristal au détecteur par rapport aux balayages de maille initiaux, la caractérisation et la collecte de données par défaut. Maintenant, définissez la résolution de seuil souhaitée pour empêcher la collecte d’ensembles de données complets à partir de cristaux qui ne se diffractent pas à cette limite. Cela peut économiser de l’espace de stockage de données et analyse le temps.
Définissez l’exhaustivité requise. Réglez ensuite la multiplicité requise. Si plus d’un cristal est contenu sur le support de l’échantillon, définissez le nombre maximum de cristaux à analyser.
La valeur par défaut est d’un ou cinq pour la presse MX P.La taille appropriée du faisceau peut également être sélectionnée. Mettez dans le groupe spatial, s’il est connu, dans la colonne de groupe spatial de force. Réglez ensuite la sensibilité au rayonnement des cristaux.
Si vous le souhaitez, définissez l’angle de rotation total à collecter pour la collecte complète de l’ensemble de données. Une fois que toutes les informations ont été entrées dans le système, enregistrez les valeurs. Cliquez dessus, retournez aux envois et appuyez sur envoyer l’envoi à l’ESRF.
Imprimez l’étiquette d’expédition et envoyez les échantillons. Les utilisateurs doivent organiser un ramassage avec un courrier en utilisant les détails du compte ESRF. Le jour de l’expérience, les échantillons sont transférés à la rosée massive d’une grande capacité.
Les scientifiques de la ligne beam lancent ensuite la collecte de données, qui peut être suivie par les utilisateurs à distance. Pour chaque type d’échantillon différent, les utilisateurs reçoivent un e-mail les informant que la collecte de données a commencé. L’exécution de toutes les étapes de tous les flux de travail peut être suivie en ligne et en temps réel.
Ceci est accessible à l’utilisateur en se connectant à ISPyB. Les résultats peuvent également être consultés et téléchargés. Pour chaque échantillon analysé, examinez les résultats de l’expérience automatique sur ISPyB.
Cliquez sur la session expérimentale souhaitée à ID30A1. Sélectionnez le pipeline de traitement automatique préféré. Téléchargez les données écrites dans le groupe spatial correct avec la plus grande compléttivité et la résolution la plus élevée.
En cliquant sur les derniers résultats de collecte, puis télécharger. Le flux de travail MX press P a été utilisé par la ligne de faisceau ESRF Massive pour monter entièrement automatiquement, centrer dans le faisceau de rayons X, caractériser et collecter des ensembles de données de diffraction complète à partir d’une série de cristaux de GCSH humain. Les échantillons ont été montés et la boucle analysée pour une zone à numériser.
Après les analyses de diffraction, quatre points ont été sélectionnés dans le cristal pour la collecte de données. La détermination manuelle de la structure par remplacement moléculaire a donné une carte de densité électronique de haute qualité après un seul cycle automatisé de raffinement. Pour cet ensemble de données, le pipeline automatisé a coupé les données à un point trois deux résolution angstrom.
Toutefois, les utilisateurs peuvent décider de couper les données à une résolution inférieure. La densité continue d’électrons est visible pour toute la chaîne d’acides aminés en dehors de l’étiquette d’histidine éterminale. Sur les quatre substitutions qui distinguent le GCSH humain et bovin, trois sont facilement identifiables dans la densité des électrons.
C’est moins clair pour l’acide aspartique de lysine 125 substitution. Pour lequel la densité électronique de la chaîne latérale n’est que partiellement résolue en raison de la flexibilité. Le modèle actuellement obtenu a une valeur de travail R de 20 points quatre pour cent et une valeur R libre de 23 points huit pour cent et peut être encore optimisé par des cycles supplémentaires de construction et de raffinement de modèles automatisés et manuels.
Il est important d’adapter les exigences à votre système. Par exemple, le réglage de la résolution déjà observée à une valeur connue peut gagner du temps et assurer une meilleure collecte de données. La collecte de données entièrement automatique a démocratisé la cristallographie et maintenant même les petits laboratoires peuvent se lancer dans un projet célèbre alors que cela n’était possible auparavant qu’avec une énorme puissance de l’homme.
Aperçu
Cet article décrit le processus automatisé de criblage et de collecte de données aux lignes de lumière de synchrotron dédiées à la cristallographie des protéines. Le système entièrement automatisé permet aux chercheurs de collecter et de traiter efficacement les données provenant d'échantillons cryorefroidis sans intervention humaine.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Cristallographie des protéines
- Diffraction des rayons X
- Automatisation de la collecte de données
Contexte
- La cristallographie aux rayons X est essentielle pour déterminer les structures protéiques.
- Les lignes de lumière de synchrotron sont cruciales pour obtenir des données à partir de cristaux faiblement diffractants.
- L'automatisation améliore l'efficacité et la qualité de la collecte des données.
- La ligne de lumière MASSIF-1 offre un flux de travail entièrement automatisé pour les macromolécules biologiques.
Objectif de l'étude
- Démontrer le processus de collecte automatisée de données aux lignes de lumière de synchrotron.
- Mettre en évidence les avantages de l'automatisation en cristallographie des protéines.
- Fournir un protocole détaillé que les chercheurs peuvent suivre.
Méthodes utilisées
- Montage et expédition de l'échantillon au synchrotron.
- Utilisation du système d'information ISPyB pour la gestion de l'expérience.
- Flux automatisés de collecte et de traitement des données.
- Surveillance en temps réel de la collecte des données et analyse des résultats.
Résultats principaux
- Collecte réussie de données de diffraction de haute qualité à partir de cristaux humains de GCSH.
- Le traitement automatisé a produit une carte de densité électronique à haute résolution.
- Identification de différences structurales entre la GCSH humaine et bovine.
- Mise en évidence de l'efficacité des flux de travail automatisés en cristallographie.
Conclusions
- L'automatisation de la collecte de données démocratise l'accès à la cristallographie.
- Des laboratoires plus petits peuvent désormais entreprendre des projets complexes auparavant limités aux grandes installations.
- L'ajustement des paramètres expérimentaux peut améliorer l'efficacité de la collecte de données.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Les lignes de lumière entièrement automatisées en synchrotron réduisent l'intervention manuelle en cristallographie macromoléculaire, permettant un criblage à haut débit et la collecte de données à partir de cristaux faiblement diffractants. Cette automatisation améliore la qualité et le débit des données, permettant aux équipes de recherche et développement en biopharmacie d'orienter leurs efforts scientifiques vers la validation des cibles et l'optimisation des candidats plutôt que vers les opérations sur la ligne de lumière. Cette technologie rend l'accès à la biologie structurale plus démocratique, en soutenant la réduction précoce des risques associés aux cibles thérapeutiques grâce à des informations structurales tridimensionnelles fiables.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques en fournissant des données structurales haute résolution sur les macromolécules biologiques.
- Valeur opérationnelle : Soutient la validation fonctionnelle des cibles grâce à la caractérisation automatisée et à la collecte de données issues d'essais de cristallisation.
- Valeur prédictive : Renforce la confiance dans les modèles cibles en produisant des cartes de densité électronique cohérentes et de haute qualité pour la conception assistée par la structure.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes cristallins validés pour les flux de travail en aval en automatisant le montage, le centrage et l'analyse de diffraction.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité des essais grâce à des flux de travail prédéfinis et à une surveillance en temps réel via ISPyB.
- Extensibilité : Permet le criblage d'un grand nombre de cristaux et la réutilisation de pipelines automatisés dans différents projets.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Établit un lien entre les données structurales au stade de la découverte et la validation préclinique en fournissant des modèles fiables pour les études mécanistiques.
- Avancement ajusté au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller en identifiant les différences structurales entre les variants d'espèces, comme les versions humaine et bovine de GCSH.
- Réduction du risque mécanistique : Précise les sites de fixation et la flexibilité, facilitant l'interprétation des relations structure-activité.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La ligne de faisceau automatisée s'intègre à la continuité du processus de découverte, depuis la validation précoce de la cible jusqu'à l'identification du composé directeur, en soutenant la génération de données destinées aux analyses et modélisations en aval.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et l'élucidation de voies biologiques par la résolution de structures cristallines de protéines et de complexes.
- Criblage : Fournit des systèmes prêts à l'essai avec des sorties quantitatives telles que la résolution, l'exhaustivité et la multiplicité pour une évaluation fiable des composés.
- Analytique : Fournit des lectures mesurables incluant les valeurs R-travail et R-libre, les seuils de résolution et les cartes de densité électronique afin de comparer les conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre les données structurales et la continuité préclinique en permettant l'ajustement de modèles spécifiques à une espèce, comme démontré avec GCSH.
- Réutilisation en entreprise : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour le criblage structural sur plusieurs cibles, réduisant ainsi la dépendance à l'égard d'expertises spécifiques à un site.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans les modèles cibles, réduction de l'ambiguïté mécanistique et appui à la conception de médicaments basée sur la structure.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la collecte de données entre les échantillons et les projets.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'aller/arrêt, efficacité du capital grâce à une réduction du personnel sur la ligne de faisceau et diminution du risque biologique dans le choix des candidats.
- Impact sur le portefeuille : Hiérarchisation des cibles ajustée au risque, fondée sur la confiance structurelle et les indicateurs de qualité des données.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Des compétences en cristallographie des protéines et en préparation d'échantillons sont nécessaires pour le montage et la caractérisation réussis des cristaux.
- L'accès à des installations de synchrotron et à des instruments tels que la ligne de lumière Massive one est essentiel pour la collecte automatisée de données.
- La standardisation entre les équipes exige une utilisation cohérente d'ISPyB pour le suivi des expériences, le choix des flux de travail et la récupération des résultats.
- L'adaptation à différents systèmes modèles implique l'ajustement de paramètres tels que les seuils de résolution, le groupe spatial et la sensibilité au rayonnement en fonction des propriétés des cristaux.
- Les limites pratiques incluent la nécessité d'échantillons cryorefroidis et la dépendance à la qualité des cristaux, ce qui influence les taux de réussite des flux de travail automatisés.
