Name: Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: Découvrez la synthèse d'une nanoémulsion de platine stabilisée par le tripeptide KYF pour l'encapsulation de médicaments anticancéreux. Cette méthode biodégradable offre une voie prometteuse pour le traitement du cancer de l'ovaire.

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Nous reconnaissons l’appui financier de l’Institut National du Cancer, grant SC2CA206194. Aucun intérêts financiers concurrents ne sont déclarés.

1. synthèse de la teneur en acide oléique Acids–Platinum(II) conjugué
<ol><li>Activation du cisplatine<ol>
<li>Suspendre 50 mg (0,167 mmol) de cisplatine dans 4 mL d’eau (p. ex., nanopure) à 60 ° C.</li>
		<li>Ajouter goutte à goutte 55,2 mg (0.325 mmol) de AgNO3 dans 0,5 mL d’eau à la solution de cisplatine et de remuer la réaction pendant au moins 2 h à 60 ° C. Le précipité blanc de AgCl formera indiquant l’état d’avancement de la réaction.</li>
		<li>Pour déterminer si la réaction d’activation est terminée, effectuez le test avec 10 % HCl pour la présence d’ions Ag+ libres en solution. Le critère devrait être négatif (aucun précipité d’AgCl supplémentaire ne devrait former).</li>
		<li>Centrifuger le mélange réactionnel à 3 220 x g pendant 10 min et enlever le précipité blanc de AgCl.</li>
		<li>Récupérer le surnageant et filtrez-le via un filtre de seringue 0,2 mm. Tester le surnageant pour la présence de platine en appliquant 2 à 3 gouttes de la solution par l’intermédiaire de pipette Pasteur à SnCl2 cristaux. Le test est positif si la couleur du complexe coordonnée d’étain avec platinum jaune/orange foncé.</li>
		<li>Utiliser le liquide surnageant avec PT (ii) activés pour la deuxième étape.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Réaction de l’acide oléique avec activés pt (ii)<ol>
<li>Suspendre 94,2 mg d’acide oléique (0.333 mmol) dans 3 mL d’eau à 60 ° C.</li>
		<li>Ajouter 13,3 mg (0.333 mmol) de NaOH dans 1 mL d’eau et mélanger avec la solution d’activés pt (ii) de l’étape 1.1</li>
		<li>Remuer la réaction pendant 2 h à 60 ° C et ensuite à température ambiante pendant la nuit. Le produit brut est un précipité brun/jaune huileux.</li>
		<li>Centrifuger le mélange réactionnel à 3 220 x g pendant 10 min et enlever le surnageant. Sécher le produit brut à 25 ° C à l’aide d’un évaporateur rotatif. Purifier le produit par plusieurs lavages avec de l’acétonitrile. La couleur finale de acids–Pt(II) en acide oléique pure conjugué est jaune pâle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. synthèse de la KYF-Pt-NE et le FITC marqués Nanoémulsion FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>Synthèse du tripeptide KYF et le tripeptide fluorescent étiqueté FITC-KYF<ol>
<li>Synthétiser la KYF en utilisant la chimie des peptides à semi-conducteurs standard. Utiliser la norme suivante conditions de couplage pour fixer chaque acide aminé : Wang résine (2,19 mmol), d’acides aminés Fmoc protégé (4.38 mmol), tétrafluoroborate de 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium (TBTU) (4.38 mmol) et diisopropyléthylamine (DIPEA) (8,76 mmol). Dissoudre les acides aminés avec TBTU dans le diméthylformamide (DMF) et DIPEA.</li>
		<li>Faire tremper de 5,7 g de résine d’alcool Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl (0,382 meq/g) dans 25 mL de DMF pour 1 h avant son utilisation.</li>
		<li>Déprotéger le groupe amine de l’acide aminé L-phénylalanine avec 15 mL de solution de pipéridine/DMF de 20 % pendant 5 min, jeter le solvant et répéter le lavage avec cycle de 20 min.</li>
		<li>Laver la résine pendant 1 min avec les solvants suivants : DMF, alcool isopropylique (IPA), IPA, DMF, IPA, DMF, DMF, DMF. Éliminer le solvant après chaque lavage.</li>
		<li>Effectuer le test de Kaiser pour déterminer la présence du groupe de2 NH gratuit sur la résine (voir sous-étapes) et si positif (la graine de résine est violette), ajouter de l’acide aminé Fmoc-L-tyrosine et effectuer l’accouplement pendant la nuit.<ol>
<li>Préparer les solutions de test dans des flacons séparés Kaiser.</li>
			<li>Dissoudre 5 g de ninhydrine dans 100 mL d’éthanol.</li>
			<li>Dissoudre les 80 g de phénol dans 20 mL d’éthanol.</li>
			<li>Mélanger 2 mL de solution aqueuse de 0,001 M de cyanure de potassium avec 98 mL de pyridine.</li>
			<li>Ajouter 2-3 gouttes de chaque Kaiser tester des solutions d’échantillon et de la chaleur dans l’eau bouillante pendant 5 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sur le couplage réussi du second acide aminé, effectuer le test de Kaiser et si négatif procéder avec protocole de déprotection (étapes 2.1.3 à 2.1.5). Répétez le processus avec l’acide aminé phénylalanine-Fmoc.<ol>
<li>Sur le couplage de tous les acides aminés, laver la résine pendant 1 min avec 5 mL de DMF, IPA, DMF, méthanol, dichlorométhane et l’éther diéthylique, après chaque lavage jeter le solvant. Économiser la résine pour un traitement ultérieur.</li>
			<li>Utiliser la moitié de la résine pour les prochaines étapes (2.1.7-2.1.9) pour modifier le peptide avec FITC. Pour obtenir la non modifiés KYF tripeptide, suivez la procédure à partir de 2.1.10.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Modifier l’acide aminé N-terminal de la KYF KYF-N3 avec de l’acide 6-azidohexanoic. À cette fin, mélanger 1 g (0,382 mmol) de résine KYF Wang et 120,1 mg (0.764 mmol) de l’acide 6-azidohexanoic avec 245,2 mg (0.764 mmol) de TBTU et 197,1 mg (1.528 mmol) de DIPEA dans 30 mL de DMF. Remuer la réaction du jour au lendemain à la température ambiante.</li>
		<li>Obtenir la KYF-FITC de la synthèse de la KYF-N3 à la fluorescéine propargylique via une réaction de clic. À cette fin, se mêlent 253 mg (0,097 mmol) de la KYF-N3 Wang résine 3,78 mg (0,019 mmol) de CuI solide, 71,9 mg (0,193 mmol) de fluorescéine propargylique et 2,24 mg (0.017 mmol) de DIPEA. La réaction doit changer de couleur du vert au brun.</li>
		<li>Après 24h, laver trois fois la résine pendant 1 min en alternant avec 5 mL de DMF et IPA cinq fois, le méthanol et l’eau trois fois, DMF et l’eau trois fois et avec le dichlorométhane et éther diéthylique. Éliminer le solvant après chaque lavage.</li>
		<li>Fendre la KYF-FITC ou peptide KYF de la résine avec une solution d’acide trifluoroacétique (TFA) / triisopropylsilane (conseils) / h2O le rapport de 95/2.5/2.5 plus de 3 heures.</li>
		<li>Précipiter le peptide brut dans un froid l’éther diéthylique, laver trois fois avec de l’éther froid et sec puis sous le vide.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthèse de nanoémulsion FITC-KYF-stabilisé avec PT (ii) (FITC-KYF-Pt-NE) et KYF-Pt-NE<ol>
<li>Dissoudre 10 mg (0.0126 mmol) de acids–Pt(II) en acide oléique conjugué dans 1,5 mL d’isopropanol et place dans une seringue de 5 mL.</li>
		<li>Placer la seringue avec la teneur en acide oléique acids–Pt(II) conjugué dans un pousse-seringue et régler le débit à 0,1 mL/min.</li>
		<li>Pour synthétiser le FITC-KYF-Pt-NE, dissoudre 1 mg (0.00105 mmol) de FITC-KYF et 1 mg (0.00219 mmol) de KYF (rapport molaire de 1:2 de FITC-KYF:KYF) dans 20 mL d’eau et régler la température de la solution à 37 ° C. Couvrir les parois du récipient avec du papier aluminium pour éviter le Photoblanchiment du fluorophore FITC. Pour synthétiser la KYF-Pt-NE, dissoudre 2 mg (0,0044 mmol) de tripeptide KYF dans 20 mL d’eau et régler la température de la solution à 37 ° C.</li>
		<li>Ajouter le conjugué de la teneur en acide oléique acids–Pt(II) goutte à la solution du tripeptide FITC-KYF/KYF ou KYF. Effectuez cette étape sous le capot.</li>
		<li>Agiter la solution du jour au lendemain à la température ambiante pour évaporer les solvants organiques et permettre l’auto-assemblage de FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-né</li>
		<li>Concentrer le FITC-KYF-Pt-NE ou KYF-Pt-NE dans un concentrateur centrifuge (10k MWCO) et se laver trois fois avec 4 mL de l’eau nanopure.</li>
		<li>Stocker les solutions aqueuses de KYF-Pt-NE et FITC-KYF-Pt-NE à 4 ° C.</li>
		<li>Analyser pour platine contenu à l’aide de la spectroscopie d’absorption atomique (AAS), suivant guide48 les directives du fabricant.<ol>
<li>Élaborer des normes platine dans HCl 10 % pour la courbe d’étalonnage (efficace pour AAS se situe entre 100 à 1 200 ppb (parties par milliard)).</li>
			<li>Dissoudre 50 µL de solution de KYF-Pt-NE d’étape 2.2 dans 100 µL d’eau régale (mélange 3:1 d’acide chlorhydrique concentré et acide nitrique) et laisser à température ambiante une nuit. Ajouter 850 µL d’eau pour atteindre un volume d’échantillon final de 1 mL. Analyser l’échantillon à l’aide d’AAS. La concentration en acide finale devrait être de 10 % dans tous les échantillons analysés.</li>
			<li>Enregistrer la lecture de la concentration de Pt en ppb et calculer le contenu final de platine dans l’échantillon (compte de la dilution de l’échantillon et le volume initial de nanoémulsion).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. confocal imagerie de l’assimilation de la FITC-KYF-Pt-NE
<ol><li>6 lignées cellulaires de cancer de l’ovaire (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G et ES2), des graines en 4 plats confocal de puits-chambre à la densité de 4. 7 x 104 cellules par chambre et la culture avance une nuit à 37 ° C.</li>
	<li>Après 24h, laver les cellules trois fois avec une solution saline du tampon phosphate (PBS) et incuber avec FITC-KYF-Pt-NE dans un milieu de culture cellulaire (voir étape 6.1 pour cellule ligne détails spécifiques) pendant 15 min à 37 ° C.</li>
	<li>Après incubation, retirez le support et laver les cellules trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Fixer les cellules avec du méthanol froid pendant 5 min à-20 ° C et laver trois fois avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Permeabilize les cellules avec 1 mL de 0.1 % Triton-X pendant 10 min à température ambiante et de la laver trois fois avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Incuber les cellules pendant 90 min avec LAMP1 anticorps conjugué avec Alexa Fluor 647 (1 mL) à 01:50 dilution dans du PBS à température ambiante. Ensuite, laver les cellules 3 fois avec du PBS.</li>
	<li>Diluer la solution mère de DAPI (1 mg/mL) à 1 mg/mL dans du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL de la solution diluée dans chaque chambre et incuber pendant 15 min à température ambiante. Laver les cellules 3 fois avec du PBS.</li>
	<li>Monter les lamelles couvre-objet sur une diapositive à l’aide du milieu de montage.</li>
	<li>Image des cellules à l’aide de microscope confocal de cellules vivantes à excitation longueur d’onde de 405 nm, 488 nm et 633 nm. Définissez les paramètres de détection comme suit : Gain de puissance de laser de 0,2 % et pas plus de 1 %, unité 1 de Pinole aérée, maître offset numérique de 650-750, 0.</li>
	<li>Ouvrir une image dans le logiciel d’imagerie. Sous image affichée, sélectionnez le graphique et sélectionnez Insert barre d’échelle, d’insérer de la barre d’échelle à l’image.</li>
</ol>4. études de libération de médicaments
<ol><li>Effectuer les études de libération de médicaments dans du PBS. Ajustez les valeurs de pH de trois tampons de PBS à 7,4, 6.8 et 5.0 respectivement.</li>
	<li>Diluer 5 μL de KYF-Pt-NE dans le 180 μL de tampon PBS pH approprié, transfert à 3,5 Coupe du mini dialyse MWCO kDa et incuber à 37 ° C dans du PBS.</li>
	<li>Retirer le tampon de chaque trois tubes dialyse mini à 2, 4, 6, 24, 48 et 140 h et de mesurer les concentrations de platine par AAS. Préparer tous les échantillons selon étape 2.2.8 mais ajuster le volume final de l’échantillon à 500 µL.</li>
</ol>5. méthodes de Culture cellulaire
<ol><li>Les lignées de culture cellulaires A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, TOV - 21G, ES-2 dans le milieu de culture cellulaire (DMEM) complété avec 10 % (A2780, CP70, SKOV-3, ES-2) ou 15 % (TOV - 21G, OV-90) sérum fœtal (SVF), avec la L-Glutamine et la pénicilline/streptomycine. Faites pousser toutes les cellules dans un 5 % de CO2, atmosphère saturée d’eau à 37 ° C.</li>
	<li>Graines de 3 x 105 cellules dans chaque plaque à 96 puits et de la culture avant toute la nuit pour des expériences d’incubation in vitro. Préparer les solutions de carboplatine, cisplatine et KYF-Pt-NE dans l’eau. Ajuster la concentration de PT (ii) en KYF-Pt-NE pour correspondre à la concentration de carboplatine et cisplatine pour chaque lignée cellulaire. Incuber pendant 72 heures à 37 ° C.</li>
	<li>Après incubation, évaluer la viabilité cellulaire par dosage colorimétrique (le test de prolifération cellulaire MTT). En bref, éliminer le milieu et ajouter 110 μL de 10 % MTT en moyenne à chaque puits et incuber pendant 2 h à 37 ° C. Puis ajouter un détergent 100 μl à chaque puits et incuber pendant 5 h à 37 ° C.</li>
	<li>Vérifier l’absorbance à 570 nm en utilisant le lecteur de plaques. Analyser les résultats en utilisant une analyse statistique avec le test Z et P-test.</li>
</ol>

Auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts à divulguer.

Des étapes cruciales dans la synthèse de nanoémulsion incluent le rapport molaire des substrats de réglage, maintenir contrôle température et le débit de la fréquence pendant l’ajout de acids–Pt(II) en acide oléique, fournissant suffisamment de temps pour l’auto-assemblage et purifier le produit à l’aide une colonne de concentrateur centrifuge. Ces paramètres influent sur la taille et la morphologie de la KYF-Pt-NE ; ainsi, il est particulièrement important maintenir le bon rapport molaire et ajuster les conditions synth...

Ces dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour l’ingénierie des nanoparticules pour des applications biomédicales comme medicaments et bioimaging1,2,3,4. La multifonctionnalité des systèmes à base de nanoparticules nécessite souvent incorporant plusieurs composants dans une formulation. Les blocs de construction qui reposent souvent sur des lipides ou des polymères se distinguent par leurs propriétés physico-chimiques ainsi que leur biocompatibilité et biodégradabilité, qui finalement pourrait affecter la fonction de la nanostructure1, 5,6. Des matériaux biologiques, tels que des protéines et des peptides, ont longtemps été reconnus comme éléments prometteurs de nanostructures multifonctionnel en raison de leur séquence flexibilité7,8. Peptides s’auto-assembler en ordonnées architectures supramoléculaires formant hélicoïdale rubans9,10, échafaudages fibreuse11,12et bien d’autres encore, ouvrant ainsi la voie au renforcement des nanostructures hybrides axée sur la biomolécule utilisant un ascendant approche13.
Peptides ont été explorées pour des applications en médecine et en biotechnologie, en particulier pour la thérapie anticancéreuse14 et maladies cardiovasculaires15 aussi bien en ce qui concerne les antibiotiques développement16,17, métabolique troubles18et les infections19. Il y a plus d’une centaine de petit-peptide thérapeutique, l’objet d’essais cliniques20. Les peptides sont faciles à modifier et rapide à synthétiser à petit prix. En outre, ils sont biodégradables, ce qui facilite grandement leur applications biologiques et pharmaceutiques21,22. L’utilisation de peptides comme éléments structuraux comprend l’ingénierie des nanoparticules peptidique, rompus et des dépôts d’hydrogel pour Liberation controlee23,24,25,26 , 27, biocapteurs à base de peptides28,29,30,31ou des dispositifs bio-électroniques32,33,34. Ce qui est important, même petits peptides avec deux ou trois résidus d’acide aminé qui incluent la phénylalanine trouvées pour guider l’auto-assemblage traite35,36,37 et créer des émulsions stabilisées38 .
Médicaments à base de platine, en raison de leur grande efficacité, sont utilisés dans de nombreux régimes de traitement du cancer, aussi bien seul ou en combinaison avec d’autres agents39,40. Composés de platine induisent des lésions de l’ADN en formant des liaisons transversales des monotypes et système ou interstrand. Les lésions de l’ADN-Pt sont reconnues par la machinerie cellulaire et, si ne pas réparés, conduisent à l’apoptose cellulaire. Le plus important mécanisme, par lequel pt (ii) contribue à la mort des cellules cancéreuses, est l’inhibition de l’ADN transcription41,,42. Toutefois, les avantages de la thérapie de platine sont diminués par une toxicité systémique du PT (ii) qui déclenche des effets secondaires graves. Ceci mène à plus faible dosage clinique de PT (ii)43, qui aboutit souvent à des concentrations sous thérapeutiques du platine pour atteindre l’ADN. En conséquence, la réparation de l’ADN qui suit contribue à la survie des cellules du cancer et l’acquisition de résistance pt (ii). La chimio-résistance de platine est un problème majeur dans la thérapie anticancéreuse et la principale cause d’échec de traitement44,45.
Nous avons développé une conception stable qui encapsule l’agent pt (ii) afin de fournir un effet protecteur dans la circulation systémique et pour diminuer les effets secondaires induits par Pt II. Le système est basé sur un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique stabilisé avec un tripeptide KYF pour former une nanoémulsion (KYF-Pt-NE)46. Les éléments constitutifs de la KYF-Pt-NE, les acides aminés de tripeptide ainsi que l’acide oléique, ont le statut de Generally Recognized As Safe (GRAS) avec la Food and Drug Administration (FDA). La KYF-Pt-N’est préparé à l’aide d’une méthode de nanoprécipitation47. En bref, le conjugué de acids-Pt(II) en acide oléique est dissous dans un solvant organique et ensuite ajouté goutte à goutte d’une solution aqueuse de KYF (Figure 1) à 37 ° C. La solution est agitée pendant plusieurs heures pour permettre à l’auto-assemblage de la la KYF-Pt-NE. La nanoémulsion est concentrée dans 10 kDa centrifuge concentrateurs et laver trois fois avec de l’eau. La modification chimique de la KYF avec un fluorophore permet la synthèse de fluorescent FITC-KYF-Pt-NE convient d’imagerie biomédicale.

<table><tbody><tr><td>2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tétraméthyluronium tétrafluoroborate (TBTU)</td><td>ANASPEC INC. :</td><td>AS-20376</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Boîte confocale à 4 puits</td><td>Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td>Pour l’imagerie</td></tr> de <tr><td>l’acide 6-bromohexanoïque</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>24477</td><td>Modification par clic pour le peptide</td></tr><tr><td>A2780</td><td>Généreusement offert par le professeur John Martignetti de l’hôpital</td><td></td> Mount Sinai <td>Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire</td></tr><tr><td>Barnstead Nanopure</td><td>Thermo Fisher</td><td>D11901</td><td>Système de filtration d’eau</td></tr><tr><td>BUCHI rotavapor R-3</td><td>Buchi</td><td>Z568090</td><td>Pour l’élimination des solvants et le séchage des échantillons</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5810 R</td><td>eppendorf</td><td>5811F</td><td>Pour la séparation du complexe de platine</td></tr><tr><td>Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99 %</td> <td>Acros Organics</td><td>19376-0050</td><td>Tests in vitro</td></tr><tr><td>CP70</td><td>Généreusement offert par le professeur John Martignetti de l’hôpital</td><td></td> Mount Sinai <td>Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire</td></tr><tr><td>Bain d’eau numérique</td><td>VWR</td><td>97025-134</td><td>Pour réchauffer les milieux de culture cellulaire</td></tr><tr><td>Diffusion dynamique de la lumière (DLS)</td><td>Brookhaven Instrument Corporation</td><td></td><td>Pour les mesures de la taille des nanoparticules</td></tr><tr><td>ES-2</td><td>ATCC</td><td>CRL-1978</td><td>Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99,79 %</td> <td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>00493</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-L-Phe Résine d’alcool 4-alkoxybenzyle (0,382 meq/g),</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01914</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>H59730</td><td>Incubateur CO2 SPPS</td></tr><tr><td>HERACELL 150i</td><td>Incubateur Fisher</td><td></td> Thermo Scientific <td></td></tr><tr><td>Pousse-seringue haute pression</td><td>New Era</td><td>1010-US</td><td>Pour l’ajout de complexes de platine dans la synthèse de nanoparticules</td></tr><tr><td>Plaque chauffante/agitateur</td><td>VWR</td><td>12365-382</td><td>Pour l’agitation et le chauffage</td></tr> <tr><td>des échantillonsLAMP-1 Anticorps (conjugué avec Alexa Fluor 647)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-18821 AF647</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>N,N-diisopropyléthylamine (DIPEA)</td><td>Oakwood Chemical</td><td>005027</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Ninhydrin 99 %</td> <td>Alfa Aesar</td><td>A10409</td><td>Kaiser</td></tr><tr><td>test Acide oléique</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01421</td><td>Pour la synthèse du complexe de platine</td></tr><tr><td>OV90</td><td>ATCC</td><td>CRL-11732</td><td>Lignée cellulaire du cancer de</td></tr><tr><td>l’ovaire PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>Pour le lavage cellulaire</td></tr><tr><td>Support de montage Permount</td><td>Fisher Chemical</td><td>SP15-100</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Phénol</td><td>Fisher Chemical</td><td>A92500</td><td>Test Kaiser</td></tr><tr><td>Acide phosphotungstique</td><td>Fisher Chemical</td><td>A248-25</td><td>coloration négative pour TEM</td></tr><tr><td>Piperidine 99 %</td> <td>BTC</td><td>219260-2.5L</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Platinum AAS standard soultion</td><td>Alfa Aesar</td><td>88086</td><td>1000ug/ml pour courbe d’étalonnage</td></tr><tr><td>Bromure de propargyle 97 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>L10595</td><td>Pour modification d’alcyne de fluorescéine</td></tr><tr><td>Armoire biologique scientifique</td><td>Thermo Scientific Fisher</td><td>1385</td><td>Bio-hood pour culture cellulaire</td></tr><tr><td>Système d’aspiration autonettoyant</td><td>Welch</td><td>2028</td><td>Pompe à vide pour rotavapor</td></tr><tr><td>Nitrate</td><td>d’argent Acros Organics</td><td>19768-0250</td><td>Activation du cisplatine</td></tr><tr><td>SKOV3</td><td>ATCC</td><td>HTB-77</td><td>Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Fisher Scientific</td><td>S313-1</td><td>Pour la synthèse du complexe de platine</td></tr><tr><td>Chlorure</td> <td>d’étain (II)Sigma Aldrich</td><td>208256</td><td>Test de présence de platine</td></tr><tr><td>TOV21G</td><td>ATCC</td><td>CRL-11730</td><td>Lignée cellulaire du cancer de l’ovaire</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique 99 % (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triisopropylsilane (TIPS)</td><td>Chem-Impex INT' L INC.</td><td>01966</td><td>SPPS</td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Pour l’imagerie</td></tr><tr><td>Poudre d’uranine 40 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25328A</td><td>Pour la modification alcyne de la fluorescéine</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 (10000 MWCO)</td><td>Sartorious</td><td>VS2001</td><td>Pour le lavage et la condensation des nanoparticules</td></tr><tr><td>VWR Microscope inversé</td><td>VWR</td><td>89404-462</td><td>Pour la surveillance des cultures cellulaires</td></tr></tbody></table>

une nanoémulsion tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

A Tripeptide-Stabilized Nanoemulsion of Oleic Acid

Les auteurs décrivent une méthode pour produire une nanoémulsion composée d’un noyau de acids-Pt(II) en acide oléique et d’un revêtement (KYF) de lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF-Pt-NE). La KYF-Pt-NE encapsule pt (ii) à 10 % m/m, a un diamètre de 107 ± 27 nm et une charge négative de la surface. La KYF-Pt-NE est stable dans l’eau et dans le sérum et est biologiquement active. La conjugaison d’un fluorophore à KYF permet la synthèse d’une nanoémulsion fluorescente qui convient pour l’imagerie biologique. La synthèse de la nanoémulsion s’effectue dans un environnement aqueux et les formes de KYF-Pt-NE par auto-assemblage d’un peptide KYF court et un conjugué de acids-platinum(II) en acide oléique. Le processus d’auto-assemblage dépend de la température de la solution, le rapport molaire des substrats et la vitesse d’écoulement de l’addition du substrat. Étapes cruciales incluent maintenant le taux d’agitation optimal pendant la synthèse, permettant un délai suffisant pour l’auto-assemblage et pré concentre la nanoémulsion progressivement dans un concentrateur centrifuge.

Image représentant TEM KYF-Pt-ne préparé à l’aide de ce protocole est montré dans la Figure 2 a. La KYF-Pt-NEs sont sphériques en morphologie, bien dispersée et de taille uniforme. Le diamètre du noyau de la KYF-Pt-NEs, mesurés directement à partir de trois images TEM avec un minimum de 200 mesures fait, est de 107 ± 27 nm. Le diamètre hydrodynamique des KYF-Pt-NE, analysée par spectroscopie lumineuse dynamique (DLS), s’est avéré pour être de 240 nm avec un i...

Ce protocole décrit une méthode efficace pour synthétiser une nanoémulsion d’un conjugué de la teneur en acide oléique acids-platinum(II) stabilisé avec un tripeptide lysine-tyrosine-phénylalanine (KYF). Les formes nanoémulsion dans des conditions douces synthétiques par auto-assemblage de la KYF et le conjugué.

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

We describe a method to produce a nanoemulsion composed of an oleic acids-Pt(II) core and a lysine-tyrosine-phenylalanine (KYF) coating (KYF-Pt-NE). The ...

Compte tenu de la large gamme de courtes séquences peptidiques, cette méthode peut être étendue à de nombreuses autres conceptions de nanoparticules. La modification du peptide peut rendre le système adapté au diagnostic. L’encapsulation du platine anticancéreux aux médicaments dont l’agent stabilisateur biodégradable et à faible toxicité est très pertinente pour les applications pharmaceutiques.Les études préliminaires in vivo sur le cancer de l’ovaire sont prometteuses et feront l’objet d’études plus approfondies. Pour commencer, suspendre 50 milligrammes de cisplatine en quatre millilitres d’eau ultra-pure à 60 degrés Celsius. Ajouter la solution nitrate d’argent drop-wise à la solution de cisplatine et remuer le mélange à 300 à 400 RPM pendant deux heures à 60 degrés Celsius dans l’obscurité.Après cela, utilisez 10% par l’acide chlorhydrique de poids pour confirmer qu’il n’y a pas d’ions argentés libres dans la solution. Si aucun chlorure d’argent supplémentaire ne se forme à l’ajout d’acide chlorhydrique, centrifugeuse le mélange à 3220 fois la gravité pendant 10 minutes. Décanter le supernatant et le filtrer à travers un filtre à seringues de 0,2 micromètre.Ensuite, testez le filtrate pour le platine en appliquant deux à trois gouttes à 10 deux cristaux de chlorure. Le platine est présent si la suspension devient brun foncé ou orange. Ensuite, ajoutez 13,3 milligrammes d’hydroxyde de sodium dans un millilitre d’eau en suspension de 94,2 milligrammes d’acide oléique en trois millilitres d’eau à 60 degrés Celsius.Remuer le mélange pendant deux heures à 60 degrés Celsius. Ensuite, éteignez le feu et continuez à remuer à température ambiante pendant 16 à 24 heures pour obtenir le produit brut comme un précipité huileux brun-jaune. Centrifuger le mélange de réaction à 3220 fois la gravité pendant 10 minutes, et enlever le supernatant.Séchez les produits sur un évaporateur rotatif à 25 degrés Celsius. Suspendre le produit brut en cinq millilitres d’acétylisation en vortexant et en récupérant le produit par centrifugation. Répétez ce processus de lavage au moins deux trois fois de plus pour obtenir l’acide oléique pur platine II conjugué comme un solide jaune pâle.Tout d’abord, faire tremper 5,7 grammes de résine Wang protégée par fmoc L-phenylalanine dans 25 millilitres de diméthylformamide pendant une heure. Ensuite, faire tremper la résine dans 15 millilitres de 20% de pipérine dans DMF pendant cinq minutes tout en secouant à 80 RPM pour dé-protéger l’amine. Égoutter la résine et répéter la protection pendant 20 minutes.Lavez la résine avec du DMF et de l’alcool d’isopropylique par la suite. Une fois que la déprotection a été confirmée, ajouter fmoc protégé L-tyrosine TBTU et DIPEA et agiter le mélange pendant 16 à 24 heures pour effectuer le couplage. Laver la résine avec du DMF et de l’alcool isopropylique.Effectuez le test Kaiser et continuez avec la déprotection et le lavage comme décrit précédemment. Couple et dé-protéger fmoc protégé lysine de la même manière. Lavez la résine avec du DMF, de l’IPA, du méthanol, du dichlorométhane et de l’éther de diéthyle par la suite.Réserver un gramme de résine kyf pour la modification fitc. Faire tremper le reste de la résine dans 95 % d’acide trifluoroacétique. 2,5% de triisopropylsilane et 2,5% d’eau pendant trois heures pour fendre le tripeptide de la résine.Précipiter le peptide brut avec de l’éther de déthyle refroidi à 20 degrés Celsius. Lavez le précipité trois fois par centrifugation en portions de 30 à 40 millilitres d’éther de déthyle froid et séchez-le sous vide. Ensuite, mélanger le gramme restant de résine KYF avec 120,1 milligrammes d’acide 6-acétaohexanoïque dans 30 millilitres de DMF avec TBTU et DIPEA.Agiter le mélange de 16 à 24 heures à température ambiante pour obtenir le tripeptide modifié à l’azide. Ensuite, combinez 253 milligrammes de cette résine avec 3,78 milligrammes de cuivre solide (I)iodure 71,9 milligrammes de florisean propargyl et 2,24 milligrammes de DIPEA. Laisser le mélange réagir en secouant pendant 24 heures.Ensuite, lavez soigneusement la résine de roulement KYF modifiée fitc. Fendre le FITC modifié KYF de la résine et la purifier de la même manière que le tripeptide non modifié. Pour commencer à préparer la nanoemoulsion, dissoudre 10 milligrammes de l’acide oléique platine II conjuguer en 1,5 millilitres d’IPA.Dessinez cette solution dans une seringue de 5 millilitres, fixez une aiguille de calibre 20 et montez la seringue sur une pompe à seringues au-dessus de la zone de réaction. Réglez la pompe à seringues à 0,1 millilitre par minute. Pour une nanoémulsion avec kyf modifié FITC, dissoudre un milligramme de KYF modifié FITC et un milligramme de KYF non modifié dans 20 millilitres d’eau.Pour une nanoémulsion avec KYF non modifié, dissoudre au lieu de cela deux milligrammes de KYF dans 20 millilitres d’eau. Chauffer la solution KYF modifiée ou non modifiée par le FITC à 37 degrés Celsius. Assurez-vous que la solution KYF est en mouvement à environ 400 RPM, et que la seringue est alignée avec la solution.Puis, démarrer la pompe seringue pour commencer à ajouter l’acide oléique platine deux conjugué drop sage. Une fois le conjugué ajouté, réduire la vitesse d’agitation à 150 rPM et laisser refroidir la solution à température ambiante. Continuer à remuer pendant 16 à 24 heures.Ensuite, concentrez la nanoémultion dans une unité de filtre centrifuge de 10 000 Dalton. Lavez la nanoémulsion dans une unité de filtre centrifuge trois fois avec quatre portions millilitres d’eau ultrapure. Et puis le stocker comme une solution aqueuse à quatre degrés Celsius.Le produit final est opalescent pour les nanoparticules KYF et fluorescent pour les nanoparticules modifiées par le FITC. Les gouttelettes dans une nanoémulsion préparée avec kyf non modifié étaient sphériques, bien dispersées, et relativement uniformes dans la taille. D’après les images de microscopie électronique de transmission, les noyaux avaient environ 107 nanomètres de diamètre.La nanoémulsion modifiée par le FITC, qui apparaît ici en vert, pourrait pénétrer dans les cellules de diverses lignées de cellules cancéreuses ovariennes. Alors que le diamètre hydrodynamique des deux formulations a augmenté pendant quatre mois de stockage dans l’eau, les dimensions globales ont été préservées. En outre, aucune opsonisation de l’émulsion n’a été observée après une journée d’incubation dans le sérum bovin fœtal à 20 %.La sortie de platine de l’émulsion a été la plus lente à pH 7,4 avec seulement 20,8% du platine libéré après quatre heures. La libération de platine s’est accélérée à mesure que le pH diminuait. La nanoémulsion enduite kyf contenant du platine a réduit la viabilité de ces lignées de cellules cancéreuses ovariennes à un degré beaucoup plus élevé que ce qui a été réalisé par le carboplatine, l’analogue cliniquement pertinent.La nanoémulsion a également montré une réduction comparable ou plus grande de la viabilité que le cisplatine dans cinq des six lignées cellulaires. La nanoémulsion enduite de KYF a constamment induit une réduction comparable ou plus grande de la viabilité que l’acide oléique platine II conjugué seul. Il s’agit d’une méthode simple et efficace pour encapsuler les thérapeutiques hydrophobes dans l’échafaudage de nanoparticules de base de tripeptide.Les peptides courts sont biodégradables et ont une faible toxicité, ce qui est important pour la médecine et la biotechnologie. Effectuez cette procédure sous le capot des vapeurs pour éviter l’exposition à des solvants organiques. L’acide oléique platine et les nanoémulsions de platine KYF ont des propriétés anticancéreuses et doivent donc être manipulés avec un soin particulier.Cette méthode est simple en termes d’activité et d’équipement à faible filabilateur, mais elle repose sur une application correcte de la stratégie de synthèse et des concepts chimiques sous-jacents. Notre méthode peut être étendue pour fournir d’autres petites molécules de drogue. Le noyau de nanoparticules se compose d’acide oléique et est donc adapté à l’encapsulation des agents hydrophobes.

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Déphasage nanoémulsions (PSNE) peut être vaporisé en utilisant des ultrasons focalisés de haute intensité pour améliorer chauffage localisé et améliorer l'ablation thermique des tumeurs. Dans ce rapport, la préparation de PSNE stable avec une distribution de taille étroite est décrite. En outre, l'impact de PSNE vaporisé à l'échographie médiée par ablation est démontrée dans des tissus imitant fantômes.

Synthèse de la Phase-shift nanoémulsions à distributions de taille étroite de vaporisation des gouttelettes acoustique et bulles améliorée échographie médiée par ablation

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Les principales étapes de polymérisation anionique vivante de l' éther glycidylique de phényle (PheGE) sur méthoxy-polyéthylène glycol (mPEG b -PPheGE) sont décrits. Les micelles de copolymère séquence résultant (SMCA) ont été chargés de doxorubicine 14% (% en poids) et une libération prolongée du médicament pendant 4 jours dans des conditions physiologiquement pertinentes ont été obtenus.

Anionique Polymérisation d&#39;un copolymère amphiphile pour la préparation du copolymère bloc micelles Stabilisé par π-tc Interactions Stacking

Pour administrer des médicaments anticancéreux aux sites tumoraux avec une spécificité élevée et des effets secondaires réduits, de nouvelles méthodes basées sur les nanoparticules sont nécessaires. Ici, nous décrivons des micelles réticulées de disulfure qui peuvent être facilement préparées par oxydation médiée par le peroxyde d’hydrogène et sont capables de se dissocier efficacement dans un environnement tumoral réducteur pour libérer des charges utiles.

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Ensemble liposome assisté par octanol sur puce pour la bio-ingénierie

Dans ce protocole, nous avons développé un acide rétinoïque (AR) encapsulé dans une nanoémulsion cationique à utiliser comme adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’antigène. En ajoutant l’AR approuvé par la FDA à la nanoémulsion, la sIgA spécifique de l’antigène a été promue dans le vagin et l’intestin grêle après l’injection intramusculaire de la nanoémulsion.

Acide rétinoïque encapsulé dans une nanoémulsion cationique en tant qu’adjuvant pour favoriser les réponses systémiques et muqueuses spécifiques de l’OVA

Découvrez la synthèse d'une nanoémulsion de platine stabilisée par le tripeptide KYF pour l'encapsulation de médicaments anticancéreux. Cette méthode biodégradable offre une voie prometteuse pour le traitement du cancer de l'ovaire.

Une Nanoémulsion Tripeptide-stabilisé de l’acide oléique

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