Identification des substrats de Kinase CK2 roman en utilisant une approche biochimique polyvalente

Ce protocole permet l’étiquetage spécifique et l’enrichissement et l’identification ultérieurs des substrats endogènes CK2 à partir d’un échantillon biologique complexe tel qu’un lysate cellulaire ou tissulaire. Cette méthode peut être appliquée à n’importe quel type de cellule ou tissu. Facilitant ainsi l’étude du CK2 dans divers contextes biologiques.

John Chojnowski, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, lyse mécaniquement l’échantillon de tissu ou les cellules de culture comme décrit dans le protocole de texte pour recueillir un total de 900 microlitres de l’échantillon. Centrifugeuse à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, transférez 270 microlitres du supernatant à chacun des trois nouveaux tubes de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Retirez 40 microlitres du supernatant restant à utiliser comme contrôle d’entrée et transférez-les dans un nouveau tube. Placez tous les échantillons sur la glace.

Tout d’abord, étiquetez chacun des trois tubes d’échantillon comme indiqué ici. Au tube de réaction Kinase, ajouter 2,7 microlitres de CK2 et 2,7 microlitres de GTPgammaS de 2,5 millimlaires. Feuilleter le tube pour le mélanger et le placer immédiatement sur la glace.

Pour le tube GTPgammaS seulement, ajouter 2,7 microlitres de 2,5 millimolar GTPgammaS, et 2,7 microlitres de Lysis Buffer. Feuilletez ce tube pour le mélanger et placez-le immédiatement sur la glace. Au tube PNBM Only ajouter 5,4 microlitres de Lysis Buffer.

Feuilleter le tube pour le mélanger et le placer immédiatement sur la glace. Incuber les trois tubes dans un bain d’eau à 30 degrés Celsius pendant une minute. Après cela, ajouter 13,5 microlitres de PNBM à 12 milligrammes par millilitre à chaque tube.

Inverser les tubes pour mélanger les échantillons et incuber les échantillons à température ambiante pendant une heure. Pendant que les échantillons couvent, étiquetez chacune des colonnes pour que l’échantillon soit chargé, comme indiqué ici. Préparez les colonnes en inversant chaque colonne plusieurs fois pour résuspendre la résine Sephadex G-25 dans le tampon de stockage.

Attachez chaque colonne à un support de pince, et laissez-la reposer intacte pendant environ cinq minutes pour laisser la résine se déposer. Ensuite, placez un tube sous l’ouverture inférieure de chaque colonne. Retirez les bouchons du haut et du bas de chaque colonne, pour permettre au tampon de stockage de s’écouler dans les tubes par gravité.

Une fois le tampon de stockage épuisé, ajoutez environ 2,7 millilitres de tampon de lyse à chaque colonne pour les équilibrer, en vous assurant de recueillir et de jeter le flux à travers. Répétez ce processus d’ajout de tampon de lyse et de rejet du flux à travers, trois fois. Pour commencer, chargez chaque échantillon dans sa colonne respective.

Recueillir et jeter le flux à travers. Ajouter 420 microlitres de tampon de lyse à chaque colonne pour laver les échantillons. Laissez le tampon de lyse filtrer à travers la colonne, et de recueillir et de jeter le flux à travers.

Ensuite, placez les tubes en position sous chaque colonne pour la collecte d’échantillons. Ajouter 500 microlitres de tampon de lyse à chaque colonne pour élucider les échantillons. Recueillir le flux à travers, qui contient maintenant une population enrichie de substrats CK2 thiophosphorylatés et alcalinés dans la réaction de kinase.

La réaction GTPgammaS seulement contiendra des substrats thiophosphorylatés et aldyllés par n’importe quel CK2 endogène présent. La seule réaction du PNMB contiendra des protéines alcalinées de fond. Retirez 80 microlitres de chaque Elution sous forme d’échantillon de contrôle d’entrée Elution.

Ensuite, divisez chaque échantillon en deux tubes qui contiennent chacun 200 microlitres. Étiquetez chacun des tubes comme étant soit anti-thiophosphate ester ou immunoglobuline G, comme indiqué ici. Ajouter 2,8 microgrammes d’anticorps anti thiophosphate ester à chacun des tubes d’ester anti thiophosphate.

Ajouter 2,8 microgrammes d’anticorps Isotype Control à chacun des tubes IGG. Placez ensuite les tubes sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant deux heures. Au cours des 15 dernières minutes de l’incubation de l’échantillon, utilisez une lame de rasoir propre pour couper l’extrémité d’une pointe de pipette P200 pour augmenter la taille de la jauge.

Immédiatement avant l’utilisation, vortex brièvement le tube de stockage contenant les perles d’agarose. À l’aide de la pointe de pipette coupée, transférer 100 microlitres de boue de perles par immunoprécipitation vers un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre. Il est important de vortex les perles avant chaque transfert pour empêcher les perles de s’installer.

Centrifuger les tubes à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une minute. Retirer et jeter le surnatant. Resuspendez les perles en ajoutant 200 microlitres de Lysis Buffer et en vortexant brièvement pour mélanger.

Répétez ce processus de centrifugeuse et de lavage des perles trois fois. Après le lavage final, déposer les perles sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à aller de l’avant. Lorsque les échantillons ont fini d’être incubés, centrifugez-les à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant trois minutes.

Ensuite, transférez 200 microlitres de chaque échantillon dans les tubes contenant les perles lavées. Placez les tubes sur un rotateur à quatre degrés Celsius pendant une heure. Ensuite, centrifuger les tubes à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une minute.

Retirez 40 microlitres de chaque supernatant pour économiser comme un contrôle d’épuisement. Retirer et jeter le reste du supernatant, en prenant soin de ne pas déranger les perles. Lavez les échantillons en ajoutant 200 microlitres de tampon de lyse à chacun et vortexing brièvement.

Centrifugeuse à 17 500 fois la gravité et à quatre degrés Celsius pendant une minute, rejetant le surnatant. Répétez ce processus de lavage et de centrifugation trois fois en prenant soin de ne pas déranger les perles. Après cela, ajouter 50 microlitres de tampon échantillon 2X à chaque échantillon contenant des perles.

Pour tous les autres échantillons, qui incluent le contrôle des entrées, les contrôles d’entrée Elution et les contrôles d’épuisement, ajoutez 8 microlitres de tampon d’échantillon 6X. Pipette chaque tube de haut en bas pour mélanger à l’exception des tubes contenant des perles, et chauffer tous les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes avant de procéder à SDS-PAGE. Pour évaluer si l’immunoprécipitation a été réussie, exécutez 25 à 30 microlitres de chaque échantillon qui ont été échappés des perles sur un gel distinct de polyacrylamide de 12,5%.

Tacher chaque gel avec Coomassie Blue pour visualiser les protéines enrichies à partir de différentes étapes du protocole expérimental. À l’aide de nouvelles lames de rasoir propres, excisez soigneusement toutes les bandes uniques présentes dans la réaction kinase anti-thiophosphate ester IP Lane tout en prenant note de leur poids moléculaire approximatif. Une nouvelle lame de rasoir doit être utilisée pour chaque bande unique.

La base sous-jacente de cette technique est cette technique est la capacité inhabituelle de CK2 d’utiliser GTP pour le transfert de groupe de phosphoryl. L’ajout de l’holoenzyme exogène de CK2 avec l’analogue de GTP, GTPgammaS, à un lysate de cellules, a comme conséquence une thiophosphorylation des substrats endogènes de CK2. Le traitement ultérieur du lysate avec le mésylate alkylating de réagent p-Nitrobenzyl génère l’ester moiety de thiophosphate sur ces protéines spécifiques de substrat, qui peuvent alors être immunopréciées utilisant un anticorps d’ester d’anti thiophosphate et finalement identifiés par spectrométrie de masse.

Dans les résultats positifs représentatifs montrés ici, CK2 dépendant, thiophosphorylation et alkylation suivante ont été réussis. Comme prévu, un signal anti thiophosphate amélioré par ballonnement occidental n’est observé que dans la voie contenant la réaction complète de kinase, et non dans le GTPgammaS seulement et le PNMB n’a traité que des échantillons. Un gel taché bleu coomassie des protéines immunoprécipitées et faites allusion, démontrent également un résultat positif.

Comme plusieurs bandes uniques ne sont évidentes que dans l’ester anti-thiophosphate IP Lane, dans lequel le lysate a été incubé avec CK2 exogène et GTPgammaS. La bande marquée est ensuite excisée du gel et soumise à l’identification des protéines par spectrométrie de masse. À la suite de cette procédure, les substrats CK2 putatifs identifiés par une spectrométrie de masse doivent être validés à l’aide d’une approche supplémentaire, par exemple par phosphorylation dépendante CK2 dans un essai standard de kinase in vitro.