Un Workflow Simple Migration/Invasion à l’aide d’un imageur automatisé de cellules vivantes

La mobilité des cellules cancéreuses est cruciale pour l’initiation de la métastase. Par conséquent, l’investigation du mouvement cellulaire et de la capacité envahissante des cellules de tumeur est d’un grand intérêt. Cette méthode intégrée pour étudier la migration et l’invasion des cellules cancéreuses, sur une seule plate-forme en temps réel, offre une option facilement reproductible et efficace dans le temps pour étudier la mobilité cellulaire et la pathologie.

Cette méthode peut fournir un aperçu de l’invasion des cellules cancéreuses, par le biais de la matrice extracellulaire, et peut être appliquée à d’autres types de cellules. Pour obtenir un temps d’égratignure optimal, assurez-vous que la densité d’ensemencement a été optimisée et ne prolongez pas la période d’incubation une fois que le monocouche cellulaire a atteint 100 pour cent de confluence. Pour déterminer le nombre optimal de cellules ensemencées pour un test de migration, placez les cellules dans une gamme de densités en triplicate dans une plaque de 96 paroi.

Placez la plaque dans l’imageur de cellule en direct et sélectionnez les analyses d’horaire à partir de la liste de tâches dans le logiciel d’imageur. Dans le volet d’installation du tiroir, déterminez les positions de la plaque et cliquez sur ajouter vessel’to select the plate type. Dans le volet de configuration de l’analyse, sélectionnez ou modifiez le modèle d’analyse en fonction de la configuration expérimentale de la plaque, et définissez le type d’analyse en standard.

Cliquez à droite sur la chronologie et sélectionnez des intervalles définis. Ensuite, réglez ajouter des scans toutes les deux heures pendant 24 heures, et cliquez sur appliquer. Après 24 heures, ouvrez la configuration du tiroir pour permettre la sélection de la plaque expérimentale et cliquez sur retirer le navire.

Sélectionnez trois à six images représentatives et placez-les dans une nouvelle collection d’images. Pour déterminer une définition de traitement appropriée, utilisez le réglage de segmentation, le nettoyage et les filtres pour appliquer un masque de confluence approprié et utilisez le courant d’aperçu all’to afficher l’exactitude des masques. Lancez le travail d’analyse et déterminez une densité cellulaire optimisée, selon une confluence d’environ 100 pour cent par rapport au temps, dans les six à dix-huit heures, selon le moment où l’analyse de migration commence.

Ensuite, appliquez l’outil d’analyse de traitement des confluences aux images de contraste de phase haute définition automatiquement collectées pour générer une courbe de prolifération cellulaire par rapport au temps. Avant de commencer l’analyse, enduire la plaque pour l’essai d’invasion de 50 microlitres de gel matriciel extracellulaire, dilué dans le milieu de culture des cellules glacées, à une concentration de 100 microgrammes par millilitre. Ensuite, placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire pendant la nuit.

L’après-midi suivant, aspirez doucement l’excès de milieu et plaquez les cellules à la densité optimisée, en triplicate, dans les puits appropriés de la plaque extracellulaire enduite de matrice, et dans une plaque supplémentaire non encorée de 96 puits. Ensuite, placez les plaques dans l’incubateur de culture cellulaire pendant la nuit. Le lendemain matin, placez la plaque d’analyse de migration non encoated dans le support de plaque de base de l’outil à gratter, et utilisez les chevilles directrices pour placer soigneusement le dessus du support sur la base.

Appuyez et maintenez le levier noir tout en soulevant soigneusement le bloc d’épingles pour faire les rayures. Les rayures de chaque puits doivent être visibles à l’œil nu, ainsi qu’au microscope. Ensuite, lavez la plaque une ou deux fois avec un milieu de culture préchauffé pour enlever les cellules détachées ou les feuilles cellulaires.

Pour l’essai d’invasion, grattez la plaque enduite comme juste démontré. Après avoir enlevé les cellules et les feuilles détachées, utilisez une boîte froide pré-réfrigérée pour équilibrer la plaque à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes avant d’aspirer soigneusement le milieu froid. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de gel matriciel extracellulaire dilué dans les puits appropriés et placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trente minutes.

Les bulles sont courantes lorsqu’elles travaillent avec du gel matriciel extracellulaire, mais elles peuvent être éliminées en aspirant 70 % d’éthanol. Ajoutez ensuite 100 microlitres de milieu frais et chaud, avec ou sans le composé d’essai, aux puits appropriés de la plaque d’essai de migration ou d’invasion, et placez la plaque dans la plate-forme d’imagerie cellulaire vivante. Pour nettoyer l’outil à gratter, placez le bloc d’épingles supérieur dans des bateaux de lavage individuels de 45 millilitres, contenant 5 % de détergent un, un pour cent de détergent deux, de l’eau distillée stérile, ou 70 % d’éthanol pendant cinq minutes par lavage avant de remettre l’outil à gratter sur sa plaque de base, pour le stockage dans un environnement exempt de poussière.

Pour l’imagerie des analyses de blessure, après avoir permis à la plaque d’équilibrer pendant cinq minutes, sélectionnez type de navire comme le plan de journal d’image, et définir le type d’analyse comme blessure à gratter. Sélectionnez ou modifiez le modèle d’analyse, selon la configuration expérimentale de la plaque, et planifiez 24 heures de répétition toutes les une à deux heures pendant 72 heures, ou jusqu’à ce que les blessures soient guéries comme démontré. Lorsque toutes les blessures ont guéri, arrêtez l’analyse et sélectionnez trois à six images représentatives, couvrant une gamme de pourcentages sonores, y compris des images juste après que la plaie a été faite, et la fermeture de la plaie de 10 et 50 pour cent.

Pour déterminer une définition de traitement appropriée, appliquez un masque de plaie à gratter approprié et un masque de confluence tel que démontré, et utilisez le courant d’aperçu all''to afficher l’exactitude des masques. Ensuite, lancez le travail d’analyse. Lors d’un test de migration, la largeur de la plaie est la distance moyenne entre les feuilles cellulaires à côté de la plaie.

La confluence de la plaie est la confluence dans la zone blessée. La confluence initiale idéale de blessure devrait être près de zéro pour cent. La densité relative de la plaie et la confluence de la plaie suggèrent la vitesse des cellules occupant la zone de la plaie à gratter.

Ces données se chevauchent presque dans ces deux lignées cellulaires représentatives. Différentes lignées cellulaires démontrent des capacités de cicatrisation des plaies très différentes, ce qui indique des capacités migratoires différentielles entre les lignées cellulaires. Par exemple, la lamellipodie sont observées dans cette lignée cellulaire d’adénocarcinome de sein au front de migration au début de la migration, alors que cette lignée de cellules de cancer du sein productrices de mucine 1 n’a montré aucun signe de migration cellulaire au même moment.

En outre, la densité relative de blessure de la ligne d’adénocarcinome de sein a été saturée après 50 heures, alors que la densité relative de blessure de la ligne de cellules cancéreuses du sein mucin 1-produisant n’a pas changé au fil du temps, soulignant le phénotype fortement invasif des cellules d’adénocarcinome et et la non-invasiveness des cellules cancéreuses de sein mucin 1-productrices. Les cellules d’adénocarcinome se sont également comportées différemment tout en envahissant par le gel extracellulaire de matrice, démontrant une morphologie allongée avec des saillies principales, et dans des analyses de migration, un bleb au front de migration a été visualisé. Lors du placage, rappelez-vous que si trop peu de cellules sont ensemencées, l’égratignure ne se formera pas correctement, et si trop de cellules sont ensemencées, il y aura surpeuplement.

Suite à cette procédure, des traitements de suivi peuvent être ajoutés, ce qui permet d’adapter cette méthode pour le dépistage des voies à haut débit. Cette méthode permet aux chercheurs d’effectuer ces essais sur une seule plate-forme, qui est à haut débit, et permet aux chercheurs de surveiller leurs cellules en temps réel, plutôt qu’en fin de compte expérimental. Les désinfectants utilisés pour stériliser l’outil à gratter peuvent être dangereux.

Assurez-vous de collecter et d’éliminer les solutions en fonction du MSDS concerné et des lignes de déclenchement régulières de votre établissement.