Name: Appliquer des avancées In Vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Découvrez la culture in vitro du microbiote intestinal humain à l'aide de bioréacteurs simulant les conditions gastro-intestinales. Cette méthode permet d'étudier les dynamiques microbiennes dans un environnement contrôlé pour la recherche en microbiologie.

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Mme Audrey Thomas-Gahring est reconnu pour son GC/MS de travail. Nous tenons également à remercier Massimo Marzorati pour l’édition du manuscrit.

<ol><li>Johansson, M., Larsson, J., Hansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+two+mucus+layers+of+colon+are+organized+by+the+MUC2+mucin%2C+whereas+the+outer+layer+is+a+legislator+of+host-microbial+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The two mucus layers of colon are organized by the MUC2 mucin, whereas the outer layer is a legislator of host-microbial interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (1), 4659-4665 (2011).</li>
<li>Xu, J., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Honor+thy+symbionts%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Honor thy symbionts.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (18), 10452-10459 (2003).</li>
<li>Jandhyala, S., Talukdar, R., Subramanyam, C., Vuyyuru, H., Sasikala, M., Reddy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+normal+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Role of the normal gut microbiota.</a> World Journal of Gastroenterology. 21 (29), 8787-8803 (2015).</li>
<li>Macfarlane, G., Macfarlane, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+intestinal+fermentation%3A+association+between+food+components%2C+delivery+systems%2C+bioavailability+and+functional+interactions+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Models for intestinal fermentation: association between food components, delivery systems, bioavailability and functional interactions in the gut.</a> Current Opinion in Biotechnology. 18 (2), (2007).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simulating+distal+gut+mucosal+and+luminal+communities+using+packed-column+biofilm+reactors+and+an+in+vitro+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simulating distal gut mucosal and luminal communities using packed-column biofilm reactors and an in vitro chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 108, 36-44 (2015).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabinoxylans%2C+inulin+and+Lactobacillus+reuteri+1063+repress+the+adherent-invasive+Escherichia+coli+from+mucus+in+a+mucosa-comprising+gut+model%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biofilms+and+Microbiomes%22%5BJournal%5D)">Arabinoxylans, inulin and Lactobacillus reuteri 1063 repress the adherent-invasive Escherichia coli from mucus in a mucosa-comprising gut model.</a> NPJ Biofilms and Microbiomes. 27 (2), 16016(2016).</li>
<li>Van den Abbeele, P., Van de Wiele, T., Verstraete, W., Possemiers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host+selects+mucosal+and+luminal+associations+of+coevolved+gut+microorganisms%3A+a+novel+concept%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The host selects mucosal and luminal associations of coevolved gut microorganisms: a novel concept.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (4), 681-704 (2011).</li>
<li>Van den Abbeele, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+a+mucosal+environment+in+a+dynamic+gut+model+results+in+a+more+representative+colonization+by+lactobacilli%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Incorporating a mucosal environment in a dynamic gut model results in a more representative colonization by lactobacilli.</a> Microbial Biotechnology. 5 (1), 106-115 (2012).</li>
<li>Kinross, J., Darzi, A., Nicholson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+microbiome-host+interactions+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Medicine%22%5BJournal%5D)">Gut microbiome-host interactions in health and disease.</a> Genome Medicine. 3 (3), 14(2011).</li>
<li>Wissenbach, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+metabolomics+of+defined+in+vitro+gut+microbial+ecosystems%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Optimization of metabolomics of defined in vitro gut microbial ecosystems.</a> International Journal of Medical Microbiology. 306 (5), 280-289 (2016).</li>
<li>McDonald, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+microbial+community+reproducibility%2C+stability+and+composition+in+a+human+distal+gut+chemostat+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiological+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of microbial community reproducibility, stability and composition in a human distal gut chemostat model.</a> Journal of Microbiological Methods. 95 (2), 167-174 (2013).</li>
<li>Venema, K., van den Abbeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+models+of+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+and+Research.+Clinical+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Experimental models of the gut microbiome.</a> Best Practice and Research. Clinical Gastroenterology. 27 (1), 115-126 (2013).</li>
<li>Krishnan, S., Alden, N., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+and+functions+of+gut+microbiota+metabolism+impacting+host+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Pathways and functions of gut microbiota metabolism impacting host physiology.</a> Current Opinion in Biotechnology. 36, 137-145 (2015).</li>
<li>Lach, G., Schellekens, H., Dinan, T., Cryan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiety%2C+Depression%2C+and+the+Microbiome%3A+A+Role+for+Gut+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Anxiety, Depression, and the Microbiome: A Role for Gut Peptides.</a> Neurotherapeutics. 15 (1), 36-59 (2018).</li>
<li>Arias-Jayo, N., Alonso-Saez, L., Ramirez-Garcia, A., Pardo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Axenic+Larvae+Colonization+with+Human+Intestinal+Microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Axenic Larvae Colonization with Human Intestinal Microbiota.</a> Zebrafish. 00 (00), (2017).</li>
<li>Zhu, W., Lin, K., Li, K., Deng, X., Li, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reshaped+fecal+gut+microbiota+composition+by+the+intake+of+high+molecular+weight+persimmon+tannin+in+normal+and+high-cholesterol+diet-fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Function%22%5BJournal%5D)">Reshaped fecal gut microbiota composition by the intake of high molecular weight persimmon tannin in normal and high-cholesterol diet-fed rats.</a> Food and Function. 9 (1), 541-551 (2018).</li>
<li>Nguyen, T., Vieira-Silva, S., Liston, A., Raes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+informative+is+the+mouse+for+human+gut+microbiota+research%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+Model+Mechanisms%22%5BJournal%5D)">How informative is the mouse for human gut microbiota research.</a> Disease Model Mechanisms. 8 (1), 1-16 (2015).</li>
<li>Hale, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+Versus+Phylogeny%3A+a+Comparison+of+Gut+Microbiota+in+Captive+Colobine+Monkey+Species%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Diet Versus Phylogeny: a Comparison of Gut Microbiota in Captive Colobine Monkey Species.</a> Microbial Ecology. 75 (2), 515-527 (2018).</li>
<li>Lu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+contributes+to+longitudinal+diversity+of+fecal+microbiota+in+swine+selected+for+lean+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Host contributes to longitudinal diversity of fecal microbiota in swine selected for lean growth.</a> Microbiome. 6 (1), 4(2018).</li>
<li>Payne, A., Zihler, A., Chassard, C., Lacroix, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+and+perspectives+in+in+vitro+human+gut+fermentation+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances and perspectives in in vitro human gut fermentation modeling.</a> Trends in Biotechnology. 30 (1), 17-25 (2012).</li>
<li>Muegge, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+drives+convergence+in+gut+microbiome+functions+across+mammalian+phylogeny+and+within+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diet drives convergence in gut microbiome functions across mammalian phylogeny and within humans.</a> Science. 332 (6032), 970-974 (2011).</li>
<li>Santiago-Rodriguez, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemostat+culture+systems+support+diverse+bacteriophage+communities+from+human+feces%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Chemostat culture systems support diverse bacteriophage communities from human feces.</a> Microbiome. 9 (3), 58(2015).</li>
<li>Sousa, T., Paterson, R., Moore, V., Carlsson, A., Abrahamsson, B., Basit, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gastrointestinal+microbiota+as+a+site+for+the+biotransformation+of+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">The gastrointestinal microbiota as a site for the biotransformation of drugs.</a> International Journal of Pharmaceutics. 363 (1-2), 1-25 (2008).</li>
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<li>Molly, K., Van de Woestyne, M., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+5-step+multi-chamber+reactor+as+a+simulation+of+the+human+intestinal+microbial+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Development of a 5-step multi-chamber reactor as a simulation of the human intestinal microbial ecosystem.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 39 (2), 254-258 (1993).</li>
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<li>Tan, J., McKenzie, C., Potamitis, M., Thorburn, A., Mackay, C., Macia, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+short-chain+fatty+acids+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of short-chain fatty acids in health and disease.</a> Advances in Immunology. 121, 91-119 (2014).</li>
<li>Yang, J., Kweon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiota%3A+a+key+regulator+of+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Reports%22%5BJournal%5D)">The gut microbiota: a key regulator of metabolic diseases.</a> BMB Reports. 49 (10), 536-541 (2016).</li>
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</ol>

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Systèmes de culture in vitro ont été développés pour étudier le microbiote intestinal du gros intestin. Ils utilisent des appareils conçus pour simuler les conditions physiologiques du tractus intestinal gastro, favorisant la croissance d’une communauté bactérienne de l’intestin mature pour chaque région du côlon33. Si le concept est logique et compréhensible, le fonctionnement réel des systèmes de culture in vitro pour étudier le microbiote intestinal nécessite précision et la compréhension de ce...

Le microbiote intestinal est une communauté de micro-organismes qui se trouvent dans le tractus gastro-intestinal (TGI).  Cette communauté a atteint une concentration maximale dans le côlon, ce qui est prévu pour tenir 1013-1014 bactéries, 500-1 000 espèces, qui vivent en symbiose avec le colon du milieu1,2. La composition et la fonctionnalité de la microbiote intestinal changent dans l’espace le long de la GIT, formant des communautés spécifiques de région, avec la plus grande diversité trouve son extrémité distale2,3,4,5. Pour chaque région anatomique, distincts des communautés microbiennes résident dans la lumière et sur la muqueuse6. La communauté de lumen a un accès plus direct aux nutriments comme substrats traversent le compartiment Luminale7. Malgré cela, certaines bactéries résident préférentiellement dans la couche de mucus, utilisant la mucine produite par les cellules du côlon comme une énergie source1,5,8. La différence de micro-environnements entre les phases luminales et muqueuses donnent divergence et le développement des communautés spécifiques de phase. Ensemble, ces collectivités assurent des fonctions métaboliques, tels que le métabolisme des éléments nutritifs et la production de vitamines et des fonctions immunologiques, telles que la prévention de la colonisation des pathogènes humains1,3, 9. le microbiote intestinal fonctionne également sur le plan fonctionnel en conjugaison avec le côlon humain cellules3.
Une partie importante de la GIT humaine, il n’est pas surprenant que le microbiote intestinal est connu pour contribuer à ces deux hôtes santé et maladie état3,9,10,11,12. Un changement dans la population microbienne de l’intestin a été associé à plusieurs maladies humaines, y compris les troubles GIT comme maladie intestinale de l’intestin (MICI) et syndrome de l’intestin intestinale (IBS), mais aussi des autres maladies comme l’obésité, les maladies circulatoires et autisme 3 , 9 , 10 , 11 , 12. métabolites issus de la microbiote intestinal ont un effet global, pour atteindre des endroits loin l’intestin12,13. Par exemple, l’axe cerveau-intestin est associée à des troubles mentaux comme la dépression et l’anxiété14. Par conséquent, étudier le microbiote intestinal est important à plusieurs champs de recherche et s’applique à de nombreuses maladies, même ceux pas souvent associée à la GIT.
Alors qu’il est largement reconnu qu’étudier le microbiote intestinal est important, c’est une entreprise compliquée. Plusieurs modèles animaux sont disponibles, de petits animaux comme le poisson-zèbre, les rats et les souris, aux plus grands comme des singes et des porcs15-19. Toutefois, l’application de ces animaux en fonction de la microflore intestinale humaine n’est pas simple, étant donné que ces animaux ont un unique bactériennes communautaires qui a évolué sur l’environnement et l’alimentation, et qu’ils sont anatomiquement distincts de l’homme20 , 21. l’utilisation de sujets humains supprime la question de la pertinence, mais introduit une autre série de défis. Études sur les humains sont coûteux, chronophages et sont moralement contraints de11. En outre, des facteurs de confusion influencent le microbiote intestinal dans les études chez l’homme, y compris l’âge ou le stade de développement, l’environnement, alimentation, médicaments et facteurs génétiques2,4,22.  Il y a aussi des restrictions sur ce qui peut être testé chez l’homme, et quel type d’échantillons peut être récoltée à quel fois4.
Un inconvénient essentiel d’utiliser un système in vivo pour étudier le microbiote intestinal est la présence de composants de mammifères. Le microbiote intestinal et les cellules humaines interagissent entre eux, et dans in vivo définition, il est impossible de distinguer les deux. Les métabolites produits par le microbiote intestinal sont recueillies par les cellules du côlon, si des mesures ne peuvent être calculés avec précision. Par conséquent, toute étude mécanistique doit être limitée au point final mesure11. Un autre inconvénient majeur pour les études in vivo est l’impossibilité de récolter des échantillons de différentes régions du TGI longitudinalement23. Cela ne permet pas pour l’évaluation des changements qui peuvent survenir dans les micro-environnements du côlon au fil du temps,12.  Nombreuses in vivo études, y compris les études chez l’homme, s’appuient sur l’analyse des échantillons de matières fécales pour détecter les modifications apportées à la gut microbiota12. Tout cela est instructif, il ne fournit pas de données sur le microbiote intestinal dans le GIT et ne différencie pas entre les communautés Luminale et muqueux5,6,7,8.
Pour le microbiote intestinal, l’application d’une méthode in vitro est nécessaire pour étudier la dynamique des communautés bactériennes, sans ingérence des composants chez les mammifères. À l’aide d’une méthode in vitro permet le contrôle serré des conditions environnementales10, essais de plusieurs paramètres en même temps et la possibilité de déguster longitudinalement et grands volumes11. Puisqu’une méthode in vitro utilise un dispositif mécanique et pas une foule, aucune considération n’est nécessaires pour l’âge, environnement, alimentation ou l’origine génétique. Ces systèmes peuvent servir à tester soit la communauté de microflore intestinale entière, sélectionné seulement les organismes ou souches même unique. Ce qui est important, les résultats obtenus in vitro sont reproductibles, tout en conservant un niveau de diversité comparable aux études in vivo11,22.
Selon l’hypothèse en question et les résultats escomptés, j’ai des étudesin vitro n peuvent être effectuées de diverses façons.  Ils peuvent utiliser des systèmes single-navires et des méthodes simples, tels qu’incuber les échantillons fécaux homogénat24 ou exécuter des cultures de lot unique au cours des 24 à 48 h25. Ils peuvent également être exécutées à l’aide des systèmes single-navires et des méthodes plus complexes, telles que l’utilisation d’un système chémostat pour produire un de communauté microbienne intestinale stable11. Cependant, l’utilisation d’un seul réacteur peut trop simplifier le microbiote12 puisqu’il ne représente qu’une partie du côlon, même si le côlon est composé des régions ascendantes, transversales et descendantes.
Afin d’étudier la communauté microflore intestinale qui se développe dans les différentes régions du côlon (les régions de l’ascendants, transversales et descendants), un système complex, plusieurs étape peut être employé. Dans ces systèmes, plusieurs navires sont mis en place pour imiter les différentes régions du côlon, donc le microbiote intestinal des régions ascendants, transversales et descendants sont cultivés séparément. Ces vaisseaux sont reliés, à l’aide de pompes pour déplacer des substrats dans l’ordre, de l’ascension vers le tube transversal aux régions du côlon descendant, imitant le flux d’éléments nutritifs par l’intermédiaire de la GIT.
L’objectif de cette étude était de démontrer comment un système de culture in vitro de 5 étages (voir Table des matières) peut servir à cultiver la communauté de microflore intestinale et de démontrer la dynamique communautaire en termes de stabilité et de la composition. Dans ce système, un seul navire représente l’estomac et un représente l’intestin grêle. Le côlon est divisé en trois régions (ascendant, transverse, descendant), avec un seul navire représentant chaque région26. Dans ce dispositif expérimental, deux systèmes complets ont été exécutés en parallèle, avec 1 unité contenant des transporteurs de mucine à représente la surface de la muqueuse et l’unité 2 ne contenant aucune transporteurs de mucine. Les communautés qui ont mis au point dans les phases luminales et muqueuses de chaque région ont été comparées les uns aux autres et à l’inoculum fécal au fil du temps en utilisant le séquençage des gènes ARNr 16 s et l’analyse de l’AGCC. Les résultats présentés montrent le type de communauté, à la fois en termes de composition et de la fonctionnalité, qui peut provenir de ce type de système in vitro.

<table><tbody><tr><td>TWINSHIME</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Milieu défini (Milieu de croissance M-SHIME adulte avec amidon)</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tube Masterflex</td><td>cole Parmer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Poche de drainage d’urine</td><td>Bard</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Labsorb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Échantillon fécal</td><td>Openbiome</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Seringues</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Defined medium</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Oxgall Bile</td><td>Becton Dickson</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pancréatine</td><td>Sigma-Aldrich NA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verrerie</td><td>Ace Glass</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Mucine porcine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Gélose bactériologique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sachets de stérilisation</td><td>VWR</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>BeadBug</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Triple-Pure High Impact Zirconium 0,1 mm Tube batteur de billes</td><td>Benchmark Scientific</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sans RNAse, sans DNAse, eau stérile</td><td>Roche</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Shimadzu QP2010 Ultra GC/MS</td><td>Shimadzu</td><td></td><td>Colonne NA</td></tr><tr><td>Stabilwax-DA, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 & micro ; m</td><td>Restek</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>transporteurs de mucine plastique</td><td>Prodigest</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

appliquer des avancées in vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

La microflore intestinale humaine joue un rôle essentiel dans la santé humaine et la maladie. Étudier le microbiote intestinal à l’aide d’un modèle in vivo , est difficile en raison de sa complexité et son association diversifiée avec des composants de mammifères. L’objectif de ce protocole est à la culture le microbiote intestinal in vitro, qui permet l’étude de la dynamique de microflore intestinale, sans avoir à tenir compte de la contribution du milieu chez les mammifères. L’utilisation in vitro culture technologique, l’état physiologique du tractus gastro intestinal est simulés, y compris les paramètres tels que le pH, la température, conditions anaérobies et temps de transit. La surface intestinale du côlon est simulée en ajoutant transporteurs enduit de mucine, créant une phase muqueuse, dimension supplémentaire. Le microbiote intestinal est introduit en inoculant avec les matières fécales humaines. Après l’inoculation avec ce mélange complexe de bactéries, microbes spécifiques sont enrichies dans les différents longitudinale (ascendant, transverses et descendants de colons) et des environnements (luminales et muqueuses) transversales du modèle in vitro. Il est essentiel permettre au système d’atteindre un état stable, dans laquelle la communauté et les métabolites produits demeurent stables. Les résultats expérimentaux dans ce manuscrit démontrent comment la communauté de microflore intestinale inoculées se développe dans une communauté stable au fil du temps. Une fois que l’état d’équilibre est atteint, le système peut servir à analyser les interactions bactériennes et fonctions communautaires ou pour tester les effets des additifs sur le microbiote intestinal, comme les aliments, composants alimentaires ou des produits pharmaceutiques.

Le protocole ci-dessus décrit la mise en place, l’inoculation et le fonctionnement d’un système in vitro de 5 étapes pour étudier le microbiote intestinal du côlon. Pour générer les données présentées ci-dessous, après extraction de l’ADN, séquençage d’ADN gène 16 s ARNr marqueur de la région de V1V2 a été réalisé en utilisant le haut débit séquençage (p. ex., MiSeq Illumina plate-forme) par le centre de Microbiome à l’hôpital pour enfants de Philadelphie,27</su...

Nous présentons ici un protocole pour cultiver le microbiote intestinal du côlon in vitro, à l’aide d’une série de bioréacteurs qui simulent les conditions physiologiques du tractus gastro intestinal.

Appliquer des avancées In Vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

Le but de ce protocole est de culture du microbiote intestinal in vitro. Il permettra d’étudier la dynamique du microbiote sans avoir à tenir compte de la contribution d’un composant moderne. En utilisant ce système in vitro à plusieurs étapes, nous comptons la communauté du microbiote pour se développer dans le lumin et sur le muqueux de plusieurs régions du côlon peut être commencé simultanément.Une démonstration visuelle de cette méthode est utile en raison de la complexité de ce système in vitro. Commencez par remplir le côlon ascendant avec 500 millilitres de milieu défini, le côlon transversaux avec 800 millilitres de milieu défini, et le côlon descendant avec 600 millilitres de milieu défini. Ajouter des agrocarriers mucine dans les régions du côlon dans une quantité proportionnelle au volume du réacteur, et utiliser le tube de l’échantillon et la seringue pour éliminer tout milieu défini excédentaire de chaque réacteur.Utilisez les sondes de pH pour régler le pH dans chaque réacteur. Et allumez la chasse d’azote pendant 20 minutes. Ensuite, décongelez l’homogénéité fécale selon les directives du fabricant avant de charger une seringue de 60 millilitres avec l’échantillon homogénétisés fécal.Ensuite, inoculer chaque réacteur du côlon à travers le port de l’échantillon avec une quantité d’homogénéité égale à 5% de chaque volume du réacteur pour la culture de nuit avec contrôle du pH. Le lendemain matin, nettoyez la serrure luer sur le port d’échantillonnage de chaque bioréacteur avec de l’alcool. Lorsque les ports ont séché, reliez la seringue de 30 millilitres, dégagée de tout air, à l’un des ports échantillonnés.Retirez le piston trois à cinq fois pour assurer un mélange complet des composants du navire avant d’aspirer 15 millilitres du supernate de la culture du bioréacteur. Transférer ensuite l’échantillon luminal dans un tube falcon stérile et le placer sur la glace. Pour l’analyse de l’ADN, recueillir un à trois millilitres de liquide luminal à l’aide d’une seringue de cinq millilitres.Recueillir la forme supernée des autres bioréacteurs de la même manière. Pour réserver le matériel d’échantillon pour l’analyse des acides gras à chaîne courte, centrifugeuse 15 millilitres de l’échantillon luminal d’intérêt, et filtrer la seringue le supernate à travers un filtre pore de 0,2 micromètre pour moins 80 degrés Celsius de stockage. Pour réserver des échantillons pour l’analyse de l’ADN, centrifugez un millilitre de liquide luminal et stockez la pastille à moins 80 degrés Celsius.Pour la récolte d’échantillons muqueux, retirez les porteurs de mucine préparés de quatre degrés Celsius et allumez la chasse d’azote. Ouvrez rapidement le couvercle du réacteur et remplacez 50 % des porteurs de chaque réacteur par de nouveaux. Lorsque tous les transporteurs ont été remplacés, réédez rapidement le couvercle et maintenez la chasse d’azote pendant encore 20 minutes.Puis aliquot 0,25 à 0,5 grammes d’agar porteur de mucine dans des tubes individuels de deux millilitres pour moins 80 degrés Celsius de stockage jusqu’à l’extraction de l’ADN. Trois fois par jour, le système fait automatiquement des cycles. Cela commence par 140 millilitres de milieu défini transféré dans le bioréacteur de l’estomac suivi d’une incubation d’une heure avec contrôle du pH.À la fin de l’incubation, le contenu de l’estomac est transféré dans l’intestin grêle avec 60 millilitres de jus pancréatique. Dans le bioréacteur de l’intestin grêle, le pH est ajusté automatiquement à 6,7 à 6,9, et le contenu couve pendant 90 minutes. Pendant cette incubation, la chasse d’azote pour chaque système est activée pendant un total de 10 minutes.À la fin de cette incubation, le contenu de l’intestin grêle est transféré dans le côlon ascendant, du côlon ascendant au côlon transversaux, du côlon transversaux au côlon descendant, et du côlon descendant aux déchets. Dans cette analyse représentative des coordonnées principales, la communauté a changé de façon amortie entre le premier et le septième jours. Toutefois, du jour 11 après l’inoculation jusqu’à la fin de l’expérience, les échantillons occupaient une petite région de l’espace d’analyse des coordonnées principales pour les deux échantillons afin d’échantillonner les scores de distance en fonction de l’unité taxonomique opérationnelle, de la présence à l’absence et de l’abondance.La mesure de trois acides gras à chaîne courte proéminente révèle que l’acide propionique, l’acide butanoïque et l’acide acétique fluctuent du début de l’expérience jusqu’au jour 15 après l’inoculation. Après le jour 15, les quantités de ces acides produits dans chaque région du côlon sont restées constantes avec seulement des changements minimes jusqu’à la fin de l’expérience. L’analyse de la communauté stable pour la phase luminale et muqueuse de chaque région du côlon démontre que les communautés qui se développent dans les différentes régions du côlon du système in vitro sont similaires à la composition fécale de l’inoculum.La comparaison de la diversité alpha du système in vitro révèle un niveau de diversité similaire à celui de l’inoculum pour toutes les régions à l’exception des échantillons luminaires de la région ascendante. Démontrer que le système de culture in vitro est capable de produire une communauté comparable à l’inoculum fécal tant en termes de composition que de diversité. Pour produire une communauté stable de microbiotes intestinaux en utilisant ce protocole, il est essentiel de s’assurer que les solutions sont préparées avec précision et que les conditions anérobies et les paramètres de pH sont maintenus tout au long de l’expérience.À la suite de cette procédure, des échantillons peuvent être analysés pour la composition de la communauté à l’aide du séquençage de l’ADN de la prochaine génération, suivi d’une analyse bioinformatique et d’une fonctionnalité utilisant la métabolomique.

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Bioengineering

Bioingénierie

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Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie de mise en place d’un système de culture d’organes intestinaux ex vivo pour étudier les interactions entre des fragments de tissu intestinal de souris et des bactéries intestinales spécifiques. Le dispositif se compose de deux paires de ports d'entrée-sortie, le premier connectant la lumière du tissu intestinal et y fournissant la suspension bactérienne spécifique, et le second fournissant en permanence des fluides aux puits du dispositif pour...

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Mise en place d&#39;épithéliales humaines Enteroids et Colonoids de tout le tissu et la biopsie

Ici, un protocole pour récolter, conserver et traiter les souris petits organites intestinaux avec des motifs de pathogènes associés moléculaires (PAMP) et Listeria monocytogenes est décrit, ainsi que l' accent sur ​​l' expression des gènes et des techniques de normalisation appropriées pour la protéine.

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