Méthode d'empalement de microélectrode pour enregistrer le potentiel de membrane d'une artère cérébrale moyenne cannulated

Ce protocole peut être utilisé pour mesurer le potentiel membranaire des vaisseaux sanguins normaux et diseaseés et pour évaluer les agents pharmacologiques qui modulent le potentiel membranaire, le tonus vasculaire et le flux sanguin. Les potentiels membranaires générés par cette technique sont proches de la plage physiologique puisque les muscles lisses vasculaires à l’intérieur d’un vaisseau sont dans un syncytium. Avant de commencer la procédure, placez un amplificateur électromètre différentiel à double canal près de la chambre du navire à l’endroit désiré.

Utilisez un câble BNC-BNC pour connecter la sortie du canal amplificateur A ou B à l’entrée du canal du numériseur. Montez la sonde dans le micromanipulateur, et tournez le micromanipulateur vers le microscope et le myographe sur une table sans vibrations. Placez les boutons et les interrupteurs à l’avant de l’amplificateur dans les positions appropriées pour l’expérience, tel que décrit dans le manuel.

Ensuite, connectez le sol du bain au sol de circuit de l’amplificateur avec une électrode appropriée, et assurez-vous que la cage est mise à la terre au châssis de l’amplificateur. Pour préparer les microélecrodes en verre borosilicate, utilisez un puller standard pour obtenir un cône court, graduel, de huit à 10 millimètres avec un diamètre inférieur à un micromètre, en boucle deux fois pour des résistances plus élevées et des pointes plus petites. Utilisez une seringue microfibre pour remplir la microélecrode de chlorure de potassium trois molaire, en rétractant lentement le piston pendant l’injection pour laisser l’espace pour le fluide à remplir et pour empêcher la formation de bulles à l’intérieur de la microélecrode.

Placez la microélecrode complètement chargée sur le support de microélecrode, et poussez soigneusement mais fermement la tige d’électrode dans le support par le trou ennuyé. Enlevez tout excès de liquide à l’aide d’un tissu de laboratoire et connectez l’assemblage du support d’électrode à la sonde amplificateur. Effectuer un test d’électrode pour mesurer la résistance aux électrodes.

Ouvrez ensuite le logiciel d’enregistrement, attribuez un nom au fichier et enregistrez le fichier pour analyse future. Ensuite, rincez la chambre myographe avec de l’eau distillée plusieurs fois avant de charger la chambre avec cinq millilitres de solution physiologique normale de sel, ou PSS. À l’aide d’une seringue de cinq ou dix millilitres, remplissez les canules de verre et le tube attenant à un PSS normal filtré sans introduire de bulles d’air, et utilisez des forceps contondants pour faire un demi-nœud dans deux sutures de nylon monofilament 10-0.

Ensuite, à l’aide de forceps de dissection sous un microscope à dissection, placez les nœuds de suture partiellement fermés sur les deux canules légèrement à l’écart des pointes. Pour l’isolement de l’artère cérébrale moyenne, utilisez des ciseaux à ressort et des forceps pour identifier et disséquer un segment non ramifié de l’artère cérébrale moyenne, avec un diamètre intérieur de 100 à 200 micromètres, du cerveau du rat. Utilisez des forceps fins pour monter l’artère cérébrale moyenne sur les canules de verre, et serrer les sutures pour fixer l’artère à la canule.

Fermez la canule distale de sorte qu’il n’y aura pas de flux à l’intérieur de l’artère, et connectez la pipette d’entrée à un réservoir de PSS. Visualisez l’artère cérébrale moyenne cannulée à l’aide d’une caméra couplée à la charge montée sur un microscope inversé et un logiciel d’imagerie. Réglez la longueur axiale du MCA à une longueur approximative de telle sorte qu’elle ne semble ni rigide ni flasque.

Equilibrer la solution de bain avec 95% d’oxygène et 5% de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius. Plongez le sol de l’amplificateur dans le PSS du myographe. Illuminez la chambre du récipient et visualisez la pointe de la microélecrode dans la solution de bain au microscope.

À l’aide du micromanipulateur, déplacez la pointe de la microélecrode près de la paroi externe du vaisseau sanguin et commencez l’enregistrement. Déplacez lentement la pointe de la microélectrode vers le navire, en visant le centre du navire. Lorsque la pointe se trouve à proximité du vaisseau, avancez l’électrode vers l’avant en un seul mouvement rapide pour empaler la membrane du muscle.

Une fois la membrane pénétrée, des changements dans le potentiel membranaire peuvent être observés. Ne touchez pas le micromanipulateur une fois que la membrane a été empalé. Lorsque les changements potentiels de la membrane ont été enregistrés, utilisez le manipulateur pour supprimer la microélectrode en un seul mouvement rapide, et arrêter l’enregistrement avant d’enregistrer les fichiers de données.

L’empalement est considéré comme réussi lorsqu’il y a une déviation rapide vers des valeurs négatives, que le potentiel de la membrane est stable pendant au moins 30 secondes et que la tension revient brusquement à zéro millivolts lors de l’enlèvement de l’électrode. Après un empalement réussi et une stabilisation potentielle de la membrane, les médicaments d’intérêt peuvent être perfusés dans le bain et des changements dans le potentiel membranaire peuvent être enregistrés. Dans cette expérience représentative, la perfusion avec le chlorure de potassium a dépolarisé la membrane d’environ six millivolts, tandis que la perfusion avec un activateur calcium-dépendant des canaux de potassium calcium-activés de grande conductance a hyperpolarisé la membrane par presque quatre millivolts.

La chose la plus importante à retenir est de tirer des microélecrodes hautement résistantes qui ont un cône court et graduel avec un diamètre inférieur à un micromètre.