Observation en temps réel de la réaction d’échange de brin ADN médiée par Rad51
February 13th, 2019
Fluorescence par résonance énergétique axée sur le transfert en temps réel observation systems de l’ADN brin réaction d’échange médiée par Rad51 ont été développés. En utilisant les protocoles présentés ici, nous sommes en mesure de détecter la formation des intermédiaires réactionnels et leur transformation en produits, tout en également analyser la cinétique enzymatique de la réaction.
Cette méthode peut aider à déchiffrer les étapes de l’échange de brins d’ADN et révèle les rôles des molécules des différentes protéines impliquées dans la combinaison pendant la réparation. Avec cette technique, nous pouvons surveiller l’échange de brins d’ADN en temps réel sans aucune perturbation de la réaction et utiliser le bloc utilisant pour déterminer la cinétique de chaque étape de réaction. Avec quelques ajustements mineurs, cette technique peut être appliquée pour étudier les activités des protéines de recombinaison purifiées dérivées d’autres espèces, telles que les mammifères et les plantes.
La démonstration de la procédure sera Kentaro Ito, un post-doc de mon laboratoire. Pour commencer, préparez le tampon de réaction A selon le protocole de texte. Ensuite, ajoutez 36 nanomole 16FA-oligonucleotide au tampon pour l’analyse d’appariement de l’ADN.
Incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter la protéine RAD-51 à une concentration finale de 1,5 micro grains de beauté au mélange et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ajouter la protéine SWI5-SFR1 à une concentration finale de 0,15 micro taupe au mélange et l’incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes supplémentaires.
Transférer 1,5 millilitres du mélange dans une cuvette de quartz de 1,0 cm par 1,0 cm contenant un agitateur magnétique. Insérer la cuvette dans un spectrofluoromètre et procéder à l’ajustement du contrôleur de température et de l’agitateur magnétique. Enregistrez le changement des émissions de fluorescence fam à 525 nanomètres lors de l’excitation à 493 nanomètres à un intervalle de seconde pendant 100 secondes.
Enfin, à l’aide d’une seringue, injecter de l’ADN double brin étiqueté ROX à une concentration finale de 36 nano taupes dans la cuvette. Enregistrez le changement d’émission de fluorescence à un intervalle d’une seconde pendant 30 minutes. Pour comparer les spectres de fluorescence entre les substrats et les produits finaux, insérez chaque cuvette contenant les 16 fa-oligonucléotides avec ou sans RAD-51 dans un spectrofluoromètre et incubez à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Ensuite, enregistrez l’émission de fluorescence FAM à 500 à 600 nanomètres lors de l’excitation à 493 nanomètres. Pour tester l’effet du RAD-51 sur les spectres de fluorescence, ajoutez rad-51 à une concentration finale de 1,5 micro grains de beauté. Et incuber le mélange à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Enfin, enregistrez les spectres de fluorescence de 500 à 600 nanomètres lors de l’excitation à 493 nanomètres. L’efficacité maximale du FRET est obtenue en mesurant la réduction maximale de l’intensité de fluorescence lorsque tous les substrats d’ADN à brin unique sont convertis en ADN à double brin dans l’analyse d’appariement. Ou en mesurant l’augmentation maximale de l’intensité lorsque tous les substrats d’ADN à double brin sont convertis en ADN à brin unique dans l’analyse de déplacement.
Dans les deux analyses, l’ajout de protéines RAD-51 n’a pas affecté l’émission de fluorescence du FAM, ni son efficacité d’assaison par les roches. Les effets des réactions spontanées entre les AD du substrat et le blanchiment photo subséquent sont faibles. Comme le montrent les changements négligeables dans l’émission de FAM sans RAD-51, par rapport aux changements substantiels observés avec rad-51.
L’ajout du complexe SWI5-SFR1 stimule fortement l’activité d’appariement du RAD-51. La réaction d’appariement est simulée à l’aide d’un modèle en trois étapes, composé de la formation du premier intermédiaire à trois brins, de la transition vers le deuxième intermédiaire et de la libération de l’ADN à brin unique et de la formation du duplex hétéro. Une comparaison du modèle en trois étapes avec un modèle en deux étapes indique que le modèle en trois étapes est un meilleur ajustement pour simuler l’appariement de l’ADN, sans ou avec le complexe SWI5-SFR1.
La constante d’équilibre calculée de chaque étape de réaction, avec ou sans SWI5-SFR1, montre que le complexe SWI5-SFR1 ne stimule pas la formation du premier intermédiaire à trois brins, mais stimule fortement la transition entre les deux intermédiaires à trois brins, et la libération de l’ADN SS. Il est essentiel de vérifier que chaque lot de protéines purifiées est exempt de nucléase et de contamination par l’hélicase.
Aperçu
Cet article présente une méthode d'observation en temps réel des réactions d'échange de brins d'ADN médiées par Rad51 utilisant le transfert de résonance d'énergie par fluorescence. La technique permet la détection des intermédiaires de réaction et l'analyse de la cinétique enzymatique sans perturber la réaction.
Composantes clés de l'étude
Domaine de la science
- Biochimie
- Biologie moléculaire
- Génétique
Contexte
- L'échange de brins d'ADN est un processus crucial dans la réparation de l'ADN.
- Rad51 joue un rôle important dans la recombinaison homologue.
- Comprendre la cinétique de cette réaction peut fournir des informations sur les mécanismes de réparation de l'ADN.
- Les techniques de surveillance en temps réel améliorent l'étude de ces processus biochimiques complexes.
Objectif de l'étude
- Développer un système pour observer l'échange de brins d'ADN en temps réel.
- Analyser les rôles de différentes protéines dans la réaction.
- Déterminer la cinétique de chaque étape du processus d'échange de brins d'ADN.
Méthodes utilisées
- Préparation du tampon de réaction et des oligonucléotides pour les essais de couplage ADN.
- Incubation des protéines RAD-51 et SWI5-SFR1 avec des substrats ADN.
- Utilisation d'un spectrofluoromètre pour surveiller les changements de fluorescence.
- Analyse des intermédiaires et produits de réaction par mesures d'émission de fluorescence.
Résultats principaux
- L'ajout de SWI5-SFR1 stimule significativement l'activité de couplage de RAD-51.
- Un modèle en trois étapes convient mieux à la simulation du couplage ADN par rapport à un modèle en deux étapes.
- L'étude fournit des données quantitatives sur la cinétique de l'échange de brins d'ADN.
- Les mesures de fluorescence ont indiqué des effets minimaux des réactions spontanées.
Conclusions
- La méthode développée permet une analyse cinétique détaillée de l'échange de brins d'ADN.
- SWI5-SFR1 améliore l'efficacité de RAD-51 dans le couplage ADN.
- Cette technique peut être adaptée pour étudier les protéines de recombinaison de diverses espèces.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Real-time observation of DNA strand exchange mediated by Rad51 provides a quantitative framework for evaluating recombination protein function, supporting target validation in DNA repair pathways. The FRET-based assay enables kinetic de-risking of mechanistic hypotheses by resolving transient intermediates, informing lead identification for modulators of homologous recombination. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking protein activity to functional DNA repair outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Rad51-mediated strand exchange to validate therapeutic targets in DNA repair pathways.
- Operational Value: Resolves formation and maturation of three-strand DNA intermediates, clarifying mechanism of action for accessory proteins like Swi5-Sfr1.
- Predictive Value: Supports three-step kinetic modeling that improves confidence in target engagement and pathway modulation predictions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts to measure strand exchange kinetics under varying protein conditions.
- Operational Value: Establishes a homogeneous, solution-based assay format compatible with spectrofluorometric detection for compound screening.
- Assay Readiness: Enables real-time monitoring without reaction disruption, supporting dose-response and time-course analyses for hit validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Facilitates cross-species comparison of recombination protein activity, supporting extrapolation from model systems to human homologs.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes effects of accessory proteins on specific reaction steps, reducing ambiguity in mechanism-based biomarker alignment.
- Preclinical Continuity: Provides a standardized method to assess functional conservation of Rad51 regulators across species, informing target selection.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, where kinetic profiling of DNA repair proteins informs go/no-go decisions prior to preclinical investment.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by quantifying how Swi5-Sfr1 stimulates intermediate maturation and ssDNA release in Rad51-mediated strand exchange.
- Screening: Delivers reproducible, real-time FRET signals that enable comparison of inhibitor or activator effects on reaction kinetics.
- Analytics: Provides step-resolved rate constants and equilibrium constants that allow quantitative comparison of protein variants or conditions.
- Translational Research: Enables assessment of evolutionary conservation by applying the assay to recombination proteins from mammals and plants.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for characterizing recombinase activity, reducing redundant assay development across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving transient intermediates and defining rate-limiting steps.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible kinetic data through real-time fluorescence monitoring in a cuvette-based format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by quantifying how accessory proteins modulate specific steps of strand exchange, reducing mechanistic uncertainty.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of DNA repair targets based on quantitative kinetic profiles and evolutionary conservation data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein purification, fluorescence spectroscopy, and kinetic data analysis.
- Dependent on access to a temperature-controlled spectrofluorometer with magnetic stirring and syringe injection capability.
- Necessitates standardized protein preparation to exclude nuclease and helicase contaminants that could confound reaction interpretation.
- Requires optimization of oligonucleotide labeling and concentration for each target species to ensure detectable FRET signals.
- Limited to in vitro systems; does not capture chromatin or nuclear context effects present in vivo.
