Amélioration d’Extrusion de haute viscosité de microcristaux de Time-resolved série femtoseconde cristallographie à rayons x Lasers

Ce protocole a été conçu pour s’assurer que les problèmes fréquemment rencontrés lors d’expériences cristallographiques en série résolues dans le temps ne compromettent pas la qualité des données. Un avantage majeur de cette méthode est son adaptabilité aux systèmes de cristal individuels. Le test d’extrusion de caméra à grande vitesse nous permet également de mesurer directement la stabilité de l’extrusion.

Tout d’abord, chargez 50 microlitres de LCP à base de monoléine cristalladen dans une seringue de 100 microlitres environ 30 minutes avant l’injection. Pour l’injection dans un environnement de vide, chargez cinq microlitres de MAG 7.9 et cinq microlitres de paraffine liquide dans le dos d’une deuxième seringue. En tenant la seringue verticalement, expulser les bulles d’air de la seringue.

Connectez la seringue avec MAG 7.9 et la paraffine à un coupler standard de seringues. Et purger l’air du coupler en appuyant doucement sur le piston jusqu’à ce qu’un petit volume du mélange soit visible à l’extrémité de l’aiguille du coupler. Connectez la seringue de l’échantillon au coupler seringue prenant la voiture pour ne pas introduire d’air dans l’échantillon.

Incorporer le lipide et la paraffine en passant l’échantillon à travers le coupler plusieurs fois. Ensuite, chargez 20 microlitres de LCP préméxé dans une autre seringue de 100 microlitres. Retirez la seringue vide du coupler et attachez le LCP préméxé au cristal contenant de la seringue à l’aide d’un coupler standard de seringues.

Ensuite, passez l’échantillon à travers le coupler 100 fois. Pour amener l’échantillon dans la phase cubique, ajouter trois microlitres de monoléine et mélanger 50 fois. Répétez cette procédure jusqu’à ce qu’une phase transparente se soit formée pour éviter un excès de monoléine.

Comme test préliminaire pour la rigidité et l’extrudabilité de l’échantillon, détachez la seringue vide du coupler de seringues et maintenez la seringue verticalement, pressez une petite quantité d’échantillonneur à travers le coupler. Si l’échantillon extrudé forme un cylindre droit, alors l’échantillon est prêt pour le test d’extrusion. Ajustez le volume total de l’échantillon à 100 microlitres en ajoutant plus de LCP préméxé.

Attachez la seringue de l’échantillon et deux seringues vides au coupler à seringues à trois sens. Mélanger au moins 50 fois en passant la moitié de l’échantillon dans la deuxième seringue, puis en appuyant simultanément sur les deux moitiés de l’échantillon dans la troisième seringue. Placez la seringue contenant l’échantillon mixte sous un microscope stéréo pour vérifier une distribution homogène de cristaux.

Purgez une pompe HPLC et toutes les conduites d’eau pour vous assurer que les débits sont exacts. Ensuite, purgez le stade hydraulique de l’injecteur. Ensuite, allumez et connectez la caméra au logiciel fourni.

Avec une vidéo en direct en cours d’exécution pour la rétroaction visuelle, placez la pointe de la buse au centre du cadre et mettre au point avec l’étape à trois axes. Réglez la vitesse d’image sur la caméra à 1000 images par seconde. Ensuite, réglez la résolution à 512 par 512 pixels.

Avec le temps d’exposition maintenant défini par le taux d’image, ajustez le niveau d’éclairage jusqu’à ce que la buse soit visible. Repositionnez la pointe de la buse de sorte qu’elle soit centrée de gauche à droite et qu’elle soit située dans le tiers supérieur du cadre. Configurez la caméra en mode time lapse.

Réglez l’intervalle à 30 secondes et les répétitions à 40 fois. Réglez le mode déclencheur au hasard. Et entrez le nombre d’images pour enregistrer à 1000.

Maintenant, chargez le réservoir avec 20 microlitres de l’échantillon d’essai et fixez la buse capillaire. Fixez le réservoir rempli à l’injecteur. Ensuite, fixez la conduite de gaz au port sur la buse et démarrez le flux de gaz.

Par la suite, démarrez simultanément la pompe et l’enregistrement de la caméra. Surveillez l’extrusion jusqu’à ce que la pression de la pompe monte brusquement près de l’heure de fin prévue. Ensuite, arrêtez d’enregistrer, éteignez la pompe et évacuez la pression du système en ouvrant la soupape de secours.

Par la suite, ouvrez le fichier vidéo avec le logiciel d’analyse et calibrez les outils de mesure. Trouvez un cadre dans la vidéo où il y a une fonction trackable visible dans l’extrusion. Enregistrez le numéro du cadre.

Ensuite, avancez la vidéo vers un cadre où la même fonctionnalité est visible, mais a déménagé de sa position dans l’étape précédente. Enregistrez le numéro du cadre. À l’aide de l’outil de mesure en ligne droite, mesurez la distance entre le point de départ et de fin de la fonctionnalité par mesure d’analyse.

Répétez les étapes précédentes plusieurs fois pour chaque segment de la vidéo. Enfin, tracez la série de données. Le matériau de départ idéal pour la procédure décrite ici est une densité élevée de microcrystals incorporés dans un support visqueux pour l’injecteur.

Des cristaux de protéine ont été utilisés pour recueillir des données trsfx sur la rhodopsine de bactéries pompées de proton, qui a indiqué les changements ultra rapides qui se produisent après absorption de photons. Après la préparation de l’échantillon à l’aide d’un coupler à trois, l’inspection visuelle du matériau dans la seringue montre l’homogénéité de l’échantillon. Et les images au microscope peuvent confirmer la densité des cristaux.

L’échantillon est en phase cubique lorsque le milieu de livraison est clair et visqueux. Les mélanges turbides sont une indication que l’échantillon est en phase éponge ou lamelle, mais ne sont pas concluants car une forte densité cristalline peut obscurcir la clarté du LCP. Un test de basse pression pour identifier la phase de l’éponge peut être effectué en tirant le piston de seringue loin de l’échantillon.

Pendant l’essai de jet, l’échantillon devrait extruder une longue colonne continue de LCP qui se déplace à une vitesse presque constante. Les échantillons qui s’exécutent en mode goutte à goutte indiquent que la viscosité est trop faible. Les données des échantillons qui forment une colonne doivent montrer que l’extrusion reste au-dessus d’une vitesse minimale dictée par les paramètres expérimentaux.

Après optimisation à l’aide de ce protocole, les données cristallographiques en série résolvant le temps peuvent être collectées dans une installation spécialisée. Ceci révélera les changements conformationnels dans la protéine entière pendant qu’elle exécute sa fonction.