Phagocytose des macrophages alvéolaires et dégagement de bactéries chez la souris

Nous rapportons ici les méthodes courantes pour analyser la fonction phagocytaire des macrophages alvéolaires murines et clairance bactérienne du poumon. Ces méthodes d’étudient de la phagocytose des perles de l’isothiocyanate de fluorescéine in vitro et in vivo phagocytose de Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. On décrit également une méthode de dégagement de P. aeruginosa chez la souris.

Pseudomonas aeruginosa est un pathogène de niveau BSL-2. N’oubliez pas de suivre toutes les pratiques de sécurité de niveau BSL-2 lors de la manipulation de cet organisme. Ici nous démontrerons l’isolement primaire de cellules, la phagocytose in vitro, et l’analyse phagocytique de voie, et la phagocytose in vivo et l’évaluation bactérienne de dégagement chez les souris.

La livraison intratracheal réussie exige la pratique pour maîtriser. Assurez-vous que le microsprayer est correctement chargé, l’aiguille est entre les deux plis vocaux, et la vitesse du piston est correctement contrôlée. Commencez par fixer la souris dans la position supine avec les membres écartés sur un tableau de dissection recouvert de serviettes en papier et en accrochant une ficelle sous les dents avant pour rétracter la tête de sorte que la trachée est positionnée droite et de niveau.

Désinfecter la souris avec 70% d’éthanol et utiliser des forceps réguliers pour tirer vers le haut de la peau à la ligne centrale du corps. Utilisez des ciseaux chirurgicaux pour couper la peau de l’abdomen jusqu’au haut de la gorge. Utilisez l’extrémité émoussée des ciseaux chirurgicaux standard pour disséquer soigneusement le muscle de la gorge et les tissus conjonctifs.

Ouvrez la paroi abdominale sous la cage thoracique. Couper le diaphragme et couper la partie inférieure de la cage thoracique pour exposer partiellement les poumons. Utilisez des ciseaux à ressort pour exposer la trachée et utilisez les forceps pour saisir un anneau de cartilage.

Utilisez des micro ciseaux pour faire soigneusement une incision d’environ 1,5 millimètre sur la face ventrale de la trachée. Enfiler délicatement une courte longueur de fil de suture sous la trachée et insérer une canule de calibre 18 dans la trachée. Lorsque la canule est en place, lavez doucement le poumon trois fois avec un millilitre de PBS frais par lavage, en retirant doucement le liquide dans la seringue avant de le réinfuser dans le poumon pendant trois fois de suite.

Après chaque lavage, transférer le liquide de lavage bronchoalveolar ou BALF dans un tube conique de 15 millilitres pour centrifugation du liquide total récolté. Resuspendez la pastille dans un millilitre de PBS frais pour une deuxième centrifugation et réutilisez les macrophages alvéolaires lavés en deux millilitres de Dulbecco’s Modified Eagles Medium ou DMEM complétés par 10% de sérum bovin fœtal non inactivé par la chaleur. Ensuite, transférez les macrophages alvéolaires primaires dans une boîte de Pétri à fond de verre pour leur culture de deux jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur cellulaire.

Après 48 heures, laver la culture avec un millilitre de PBS avant de nourrir la culture avec deux millilitres de milieu frais. Ensuite, ajoutez 50 perles conjuguées au latex coconjugé fitc de deux micromètres de diamètre par cellule à la culture pour une incubation d’une heure à 37 degrés Celsius dans un incubateur cellulaire. À la fin de l’incubation, lavez la plaque abondamment cinq fois avec un millilitre de PBS frais par lavage pour enlever les perles extracellulaires et image aléatoirement 100 cellules pour compter les cellules contenant des perles intracellulaires.

Pour un test d’opsonisation, incuber deux fois 10 à la huitième mouton globules rouges ou SRBCs avec 50 microlitres de lapin anti-SRBC immunoglobuline M ou IgM pendant 30 minutes à température ambiante. Puis incuber les SRBCs opsonized avec 50 microlitres de sérum humain C5-déficient pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius pour fixer les fragments d’inhibiteur de C3b et de C3b sur les SRBCs IgM-enduits. Ensuite, aspirez les médias et ajoutez 100 microlitres d’une fois 10 aux sept SRBC opsonisés par millilitre de milieu à chaque puits d’une plaque de 96 puits contenant une fois 10 au quatrième macrophages murins cultivés pendant la nuit par puits.

Incuber la coculture macrophage de souris SRBC pendant une heure à 37 degrés Celsius, puis enlever les SRBCs non liés en lavant avec 100 microlitres de tampon de lyse de potassium chlorure d’ammonium pendant une minute. Une fois que les CRSR non liés ont été enlevés, rincer avec 100 microlitres de médias. Lyse les cellules restantes avec 0,1% de sodium dodecyl sulfate et traiter les lysates avec 50 microlitres de 2, 7-diaminofluorene complété avec 3% peroxyde d’hydrogène et six urée molaire.

Mesurez ensuite l’absorption de la formation bleu fluorène catalysée par l’hémoglobine sur un spectrophotomètre à 620 nanomètres. Utilisez une courbe standard à des valeurs d’absorption de 620 nanomètres avec un nombre connu de CRS pour déterminer le nombre de CRS opsonisés phagocytisés. Pour évaluer la phagocytose par récepteur de reconnaissance de modèle, lavez les macrophages alvéolaires primaires de souris cultivées de deux jours avec un millilitre de PBS et traitez les cellules avec 500 microlitres de milieu frais contenant 100 fluor-488 alexa conjugués Zymosan-A-bioparticules.

Après une heure à 37 degrés Celsius, arrêter la phagocytose avec 500 microlitres de PBS glacé et laver les cellules abondamment cinq fois avec un millilitre de PBS par lavage. Après le dernier lavage, fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes à température ambiante et laver les cellules cinq fois de plus comme démontré. Après le dernier lavage, couvrir les cellules de 500 microlitres de PBS frais pour l’imagerie sous contraste différentiel d’interférence et canal fluorescent à 488 nanomètres pour quantifier le nombre de macrophages alvéolaires contenant des zymosan-A-bioparticules.

Pour l’évaluation de phagocytose de macrophage alvéolaire in vivo, confirmez le niveau approprié de sedation par manque de réponse au pincement d’onteil dans une souris anesthésiée et placez la souris sur une planche plate avec un fil en plastique sous les incisives supérieures. Placez la souris dans une tribune semi-couchée à 45 degrés avec la surface ventrale orientée vers le haut et utilisez des forceps incurvés pour retirer et supprimer la langue. Insérez ensuite un microsprayer entre les plis vocaux pour administrer intratracheally 50 microlitres de cinq fois 10 aux six unités colonie-formation de P.aeruginosa GFP dans les poumons de l’animal anesthésié.

Pour confirmer que l’aiguille du microsprayer se trouve dans la trachée, déplacez doucement la seringue et observez les plis vocaux de chaque côté de l’aiguille. Une heure après l’infection, recueillir le fluide de lavage comme il vient de le démontrer et pelleter les macrophages alvéolaires par centrifugation. Resuspendez une fois 10 à la troisième cellule dans 100 microlitres de PBS frais pour la cytocentrifugeuse sur une glissière en verre.

Ensuite, taches différentielles les diapositives cytospun pour les macrophages alvéolaires, les neutrophiles et les lymphocytes, selon les protocoles histochimiques standard. Sélectionnez aléatoirement 100 macrophages alvéolaires pour quantifier le pourcentage de cellules qui phagocytosed bactéries. Dans le premier essai in vivo de dégagement des bactéries, injecter intratracheally une dose sublétale d’environ 2,5 à cinq fois 10 les cinquièmes unités de formation de colonies par millilitre de P.aeruginosa dans le type sauvage anesthésié et les souris mutantes et mesurer le poids corporel de chaque animal chaque jour pendant six jours.

Dans le deuxième essai, injecter un nouvel ensemble de souris sauvages et mutantes avec un létal trois fois 10 aux sept unités de formation de colonies par dose millilitre de P.aeruginosa et enregistrer la mortalité dans les deux jours suivant une injection, la collecte de l’ensemble du tissu pulmonaire au moment de la mort ou deux jours après l’injection pour la quantification de la charge bactérienne pulmonaire à l’infection maximale. Après la récolte des poumons, couper les échantillons pulmonaires en petits morceaux sur la glace et homogénéiser les fragments pulmonaires à l’aide d’un homogénéiseur électrique ajusté. Ensuite, plaque 100 microlitres d’homogénéité sur pseudomonas plaques d’agar d’isolement en dilutions sérielle 10 fois.

La microscopie de fluorescence indique que la phagocytose macrophage alvéolaire primaire de souris des perles de latex de FITC se produit après une heure d’incubation, avec des macrophages de KO TRIM72 démontrant une capacité phagocytique sensiblement plus élevée. Inversement, la surexpression de TRIM72, une protéine dont la fonction est inconnue dans les cellules macrophages murines, entraîne une diminution plus que cinq fois de la phagocytose complémentaire. Alexa fluor-488 conjugués Zymosan-A particules, cependant, sont ingérés en quantité égale par les macrophages alvéolaires primaires isolés de type sauvage ou souris KNOCKOUT.

La coloration différentielle de BALF récoltée à partir de type sauvage et d’animaux knock-out révèle un nombre similaire de macrophages, mais une capacité phagocytique plus élevée pour les macrophages récoltés à partir de souris knock-out. En outre, les souris knockout TRIM72 démontrent une récupération plus rapide de leur poids corporel, maintiennent leur survie, et présentent une charge bactérienne inférieure à celle des animaux de type sauvage après l’administration intratrachéale de P.aeruginosa. En utilisant cette technique, d’autres processus phagocytiques qui sont importants pour la pneumonie comme la phagocytose neutrophile et la contribution relative d’autres phagocytes dans le dégagement des bactéries peuvent être analysés.

En combinaison avec les inhibiteurs pharmacologiques, le transfert adaptatif et les animaux transgéniques, cette technique peut aider les chercheurs à explorer la composante moléculaire d’un type spécifique de phagocytose pour les phagocytes d’intérêt.