Name: Effet des anticorps Anti-c-fms sur la Formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-18T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Découvrez la génération d'ostéoclastes à partir de moelle osseuse murine et l'effet de l'anticorps Anti-c-fms sur l'ostéoclastogenèse. Cette méthode offre des applications thérapeutiques pour les maladies osseuses inflammatoires.

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Ce travail a été soutenu en partie par un JSPS KAKENHI don de la société japonaise pour la Promotion de la Science (n ° 16K 11776 à K., n ° 17K 17306 K. S., n ° 16K 20637 à K. K., n ° 16K 20636 à M. S., n ° 18K 09862 à I. M.).

Toutes les procédures animaux et soins des animaux ont été réalisés selon les règlements et règles de l’Université de Tohoku.
1. manutention et Dissection postérieur murin
<ol><li>Avant la dissection, remplir une plaque avec environ 50 mL de α-MEM selon la taille du contenant et placez-le sur la glace. Cela servira comme un conteneur de collection jusqu'à la fin de la dissection de tous les os. Pour cela et les expériences, utilisez α-MEM contenant 10 % bovine sérum fœtal (SVF) 100 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine.</li>
	<li>Euthanasier la souris C57Bl/6J par inhalation d’une dose létale d’isoflurane 5 %.</li>
	<li>Fixez la souris dans une position couchée à l’aide de goupilles percés à travers les paumes et les pieds et les vaporiser avec de l’éthanol à 70 %.</li>
	<li>Faire une incision de la peau à l’aide de pinces et ciseaux chirurgicaux stériles au niveau de la hanche et étendez-le descendant jusqu’aux pieds, exposant ainsi les muscles.</li>
	<li>Couper le tendon y attacher le muscle quadriceps et le tendon d’y attacher le muscle ischio-jambiers à l’os. Décollez les muscles exposant les articulations des hanches et des genoux. Localiser ces tendons facilitera la libérant les deux muscles de leurs pièces jointes sans laisser les balises des tissus mous. Ne pas couper dans l’os.</li>
	<li>Positionner les ciseaux entre la tête du fémur et de l’espace commun et couper en libérant du fémur mais conservant l’os. Cela permettra de détachement des os sans le risque d’exposer la moelle osseuse.</li>
	<li>De même couper les muscles attachant sur le tibia. Couper le tibia exempt de son attachement à l’articulation de la cheville en conservant l’OS pour éviter la contamination.</li>
	<li>Grattez tout autres tissus mous du fémur et du tibia en utilisant les lames des ciseaux et kimwipe et placez-le dans une assiette avec α-MEM mis dans la glace.</li>
</ol>2. isolement de la moelle osseuse du membre postérieur murin
<ol><li>Remplissez une seringue à aiguille 30 G de α-MEM.</li>
	<li>Déconnectez le tibia et le fémur de l’articulation du genou.</li>
	<li>Couper les extrémités de l’OS long des deux côtés à l’aide de ciseaux.</li>
	<li>Tenez l’os de l’arbre à l’aide de pinces à épiler, introduire l’aiguille dans l’espace de la moelle de l’os et rincer doucement le contenu de la moelle dans une boîte de Petri de 6 cm. L’OS apparaît blanche, indiquant l’extraction de tous les contenus de la moelle osseuse. Répétez pour tous les os.</li>
	<li>Extrait de la souche de la moelle osseuse à l’aide d’une passoire de cellule 40 μm en nylon dans un tube à centrifuger conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min.</li>
	<li>Jeter le surnageant, laver avec 5 mL de α-MEM et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. lavage de répétition pour un total de 2 fois.</li>
	<li>
Resuspendre le culot dans 10 mL de α-MEM et effectuer un nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre comme suit :
	<ol>
<li>Réaliser une dilution au 1:1 de suspension cellulaire en ajoutant 10 μL de la suspension cellulaire à 10 μL de 0,4 % trypan bleu dans un tube de 1,5 mL et pipeter une fois.</li>
		<li>Couvrir la chambre hémocytomètre avec un couvercle coulissant et transférer la suspension de colorant à l’hémocytomètre. Il est important de ne pas trop remplir ou sous-classement de la chambre et laisser la suspension remplir la chambre par capillarité.</li>
		<li>Placez l’hémocytomètre sur une platine du microscope. À l’aide d’objectif 10 x, se concentrer sur la place du centre. Compter toutes les cellules liées par 3 lignes. Pour s’assurer que les cellules ne sont pas comptées deux fois, compter les coins en haut et à droite de chaque carré. Les cellules mortes apparaîtront bleu foncé, ceux-ci sont exclus de la comte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selon l’application en aval, les cellules des graines dans un récipient de culture approprié. Pour cette expérience particulière, suivez la section 3.</li>
</ol>3. génération de BMM
<ol><li>Semences 1 x 107 cellules/10 mL dans un 10 cm culture plat et ajouter le M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours.</li>
	<li>Après 3 jours, retirez le milieu de culture, laver les cellules vigoureusement avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois pour enlever les cellules non adhérentes, ajouter 5 mL de température ambiante 0,02 % trypsine-EDTA dans du PBS et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 5 min.</li>
	<li>Détacher les cellules par pipetage approfondie. Assurez-vous que les cellules ont été détachées en observant la culture sous un microscope (les cellules apparaît arrondie et flottant dans les médias). Si les cellules restent attachées, répétez pipetage soigneusement pour détacher. Lorsque les cellules ont été détachés, ajouter 5 mL de α-MEM pour inactiver la réaction.</li>
	<li>Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 mL et centrifuger à 300 x g pendant 5 min. jeter le surnageant et laver avec 5 mL de α-MEM.</li>
	<li>Centrifuger à 300 x g pendant 5 min et resuspendre le culot dans 10 mL de α-MEM.</li>
	<li>Effectuez un comptage cellulaire comme décrit dans l’étape 2.7.1.</li>
	<li>Semences 1 x 106 cellules/10 mL dans un 10 cm culture plat et ajouter le M-CSF 100 ng/mL. La concentration finale de M-CSF est 100 ng/mL de milieu de culture. Incuber la culture à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours.</li>
</ol>4. génération des ostéoclastes de BMM comme précurseurs Ostéoclastiques
<ol><li>Après 3 jours, récolter les cellules attachées qui représentent BMM comme précurseurs ostéoclastiques, suivant les étapes de 3,2 à 3,7.</li>
	<li>BMM semence à 5 x 104 cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque 96 puits. Ajouter RANKL pour une concentration finale de 50 ng/mL ou TNF-α pour une concentration finale de 100 ng/mL. Ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.</li>
	<li>Ajoutez l’anticorps anti-c-fms (la concentration finale de 0, 1, 10, 100, 1000 ng/mL) dans chaque puits.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 4 jours. Modifier les médias tous les deux jours pendant 4 jours.</li>
</ol>5. tache de phosphatases acides tartrate-résistantes (TRAP)
<ol><li>Après 4 jours d’incubation, aspirer doucement le milieu de culture de chaque puits. Laver chaque bien une fois avec 200 μl de PBS 1 x température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 200 μl de 10 % de formol dans chaque puits de fixation et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le formol et laver chaque puits 3 fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Ajouter 200 μl de 0,2 % Triton X-100 dans du PBS à chaque bien de perméabilisation et incuber pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le Triton X-100 et laver chaque puits 3 fois avec de l’eau désionisée.</li>
	<li>Ajouter 200 μl de solution de tache de piège à chaque puits. Visualiser la tache sous le microscope. Il faudra de 10 à 30 min pour la tache pour se développer correctement.</li>
	<li>Aspirer la tache et laver chacun bien avec l’eau désionisée 3 fois et sécher à l’air. Conserver à température ambiante à utiliser en observation supplémentaires.</li>
</ol>6. essai de prolifération
<ol><li>BMM semence comme précurseurs d’ostéoclastes à 5 x 103 cellules/200 μL de α-MEM dans une plaque 96 puits. Ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 ng/mL dans chaque puits.</li>
	<li>Ajoutez l’anticorps anti-c-fms (la concentration finale de 0, 1, 10, 100, 1 000 ng/mL) et incuber à 37 ° C, 5 % CO2 pendant 3 jours sans changement médiatique.</li>
	<li>Après 3 jours, laver les cellules avec du PBS 1 x. Ajouter 100 μL de α-MEM dans chaque puits.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de solution kit de comptage de cellule et incuber à 37 ° C, 5 % de CO2 pendant 2 h et déterminer l’absorbance de chaque puits à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques.</li>
</ol>

<ol><li>Crotti, T. N., Dharmapatni, A. A., Alias, E., Haynes, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoimmunology%3A+Major+and+Costimulatory+Pathway+Expression+Associated+with+Chronic+Inflammatory+Induced+Bone+Loss%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">Osteoimmunology: Major and Costimulatory Pathway Expression Associated with Chronic Inflammatory Induced Bone Loss.</a> Journal of Immunology Research. 2015, 281287(2015).</li>
<li>Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bone resorption by osteoclasts.</a> Science. 289 (5484), 1504-1508 (2000).</li>
<li>Azuma, Y., Kaji, K., Katogi, R., Takeshita, S., Kudo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-alpha+induces+differentiation+of+and+bone+resorption+by+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-alpha induces differentiation of and bone resorption by osteoclasts.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (7), 4858-4864 (2000).</li>
<li>Kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+stimulates+osteoclast+differentiation+by+a+mechanism+independent+of+the+ODF%2FRANKL-RANK+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha stimulates osteoclast differentiation by a mechanism independent of the ODF/RANKL-RANK interaction.</a> Journal of Experimental Medicine. 191 (2), 275-286 (2000).</li>
<li>Kim, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+independent+of+the+TRANCE-RANK-TRAF6+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation independent of the TRANCE-RANK-TRAF6 axis.</a> Journal of Experimental Medicine. 202 (5), 589-595 (2005).</li>
<li>Redlich, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclasts+are+essential+for+TNF-alpha-mediated+joint+destruction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Osteoclasts are essential for TNF-alpha-mediated joint destruction.</a> Journal of Clinical Investestigation. 110 (10), 1419-1427 (2002).</li>
<li>Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-stimulated+osteoclastogenesis+is+mediated+by+tumor+necrosis+factor+via+its+P55+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investestigation%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor.</a> Journal of Clinical Investestigation. 100 (6), 1557-1565 (1997).</li>
<li>Zha, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TNF-alpha+contributes+to+postmenopausal+osteoporosis+by+synergistically+promoting+RANKL-induced+osteoclast+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicine+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">TNF-alpha contributes to postmenopausal osteoporosis by synergistically promoting RANKL-induced osteoclast formation.</a> Biomedicine & Pharmacotherapy. 102, 369-374 (2018).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+mediates+TNF-induced+inflammatory+osteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">M-CSF mediates TNF-induced inflammatory osteolysis.</a> Journal of Clinical Investigation. 115 (12), 3418-3427 (2005).</li>
<li>Kimura, K., Kitaura, H., Fujii, T., Hakami, Z. W., Takano-Yamamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-c-Fms+antibody+inhibits+lipopolysaccharide-induced+osteoclastogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Immunology+and+Medical+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Anti-c-Fms antibody inhibits lipopolysaccharide-induced osteoclastogenesis in vivo.</a> FEMS Immunology and Medical Microbiology. 64 (2), 219-227 (2012).</li>
<li>Kimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+osteoclastogenesis+in+a+mouse+periodontitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Diseases%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits osteoclastogenesis in a mouse periodontitis model.</a> Oral Diseases. 20 (3), 319-324 (2014).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+M-CSF+receptor+c-Fms+antibody+inhibits+mechanical+stress-induced+root+resorption+during+orthodontic+tooth+movement+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Angle+Orthodontist%22%5BJournal%5D)">An M-CSF receptor c-Fms antibody inhibits mechanical stress-induced root resorption during orthodontic tooth movement in mice.</a> Angle Orthodontist. 79 (5), 835-841 (2009).</li>
<li>Kitaura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+anti-c-Fms+antibody+inhibits+orthodontic+tooth+movement%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">An anti-c-Fms antibody inhibits orthodontic tooth movement.</a> Journal of Dental Research. 87 (4), 396-400 (2008).</li>
<li>Bettina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF+Mediates+Host+Defense+during+Bacterial+Pneumonia+by+Promoting+the+Survival+of+Lung+and+Liver+Mononuclear+Phagocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">M-CSF Mediates Host Defense during Bacterial Pneumonia by Promoting the Survival of Lung and Liver Mononuclear Phagocytes.</a> Journal of Immunology. 196 (12), 5047-5055 (2016).</li>
<li>Dougall, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RANK+is+essential+for+osteoclast+and+lymph+node+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Develpoment%22%5BJournal%5D)">RANK is essential for osteoclast and lymph node development.</a> Genes & Develpoment. 13 (18), 2412-2424 (1999).</li>
<li>Wiktor-Jedrzejczak, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+absence+of+colony-stimulating+factor+1+in+the+macrophage-deficient+osteopetrotic+%28op%2Fop%29+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Total absence of colony-stimulating factor 1 in the macrophage-deficient osteopetrotic (op/op) mouse.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87 (12), 4828-4832 (1990).</li>
<li>Yang, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+macrophage+colony-stimulating+factor+in+ankylosing+spondylitis+and+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Increased expression of macrophage colony-stimulating factor in ankylosing spondylitis and rheumatoid arthritis.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 65 (12), 1671-1672 (2006).</li>
<li>Takei, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+macrophage-colony+stimulating+factor+levels+in+synovial+fluid+of+loose+artificial+hip+joints%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">High macrophage-colony stimulating factor levels in synovial fluid of loose artificial hip joints.</a> The Journal of Rheumatology. 27 (4), 894-899 (2000).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dans cette étude, nous avons étudié l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation des ostéoclastes induite par la TNF-α et prolifération des précurseurs des ostéoclastes induite par la M-CSF. Nous avons constaté que le montant effectif des anticorps anti-c-fms pour l’inhibition de l’osteoclastogenesis entre la formation des ostéoclastes induite par le RANKL, formation d’ostéoclastes induite de TNF-α et M-CSF-induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques est d...

Les ostéoclastes sont des cellules très spécialisées, et ils se différencient des cellules souches hématopoïétiques par la fusion de plusieurs précurseurs ostéoclastiques. Ils sont essentiels pour le remodelage osseux sain et contribuent à la résorption osseuse pathologique associée à des maladies ostéolytiques inflammatoires comme l’arthrite rhumatoïde et la maladie parodontale1.
Fonction Osteoclastogenesis et ostéoclastes sont médiés par deux facteurs clés ; macrophages stimulant les colonies facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand de facteur nucléaire kappa-B (RANKL). M-CSF tant RANKL sont importants pour de différenciation ostéoclastique2. Un autre facteur qui a été montré pour induire la formation des ostéoclastes de macrophages de la moelle osseuse in vitro est le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α)3,4,5. TNF-α ostéoclastique médiée par la formation s’est avérée être crucial pour l’ostéolyse en maladies osseuses destructrices comme6de la polyarthrite rhumatoïde, la maladie parodontale7et l’ostéoporose postménopausique8.
C-fms est le récepteur membranaire de M-CSF et intervient dans son action. Le rôle de c-fms est bien documenté dans la littérature comme il a été démontré que l’administration d’un anticorps dirigé contre c-fms (anticorps anti-c-fms) complètement arrêtées osteoclastogenesis dans un modèle de l’arthrite ainsi que de TNF-α induite par les érosions osseuses tout en osteoclastogenesis lointain de l’articulation enflammée a été encore robuste9. L’administration d’anticorps anti-c-fms inhibe la résorption osseuse et de la formation d’ostéoclastes induite par le lipopolysaccharide (LPS) en souris cranienne10 aussi bien que dans la parodontite induite par LPS modèle11. En outre, les anticorps anti-c-fms inhibent résorption mécanique racine induite par le stress pendant la dent orthodontie mouvement12, ainsi que mouvement dentaire orthodontique et la résorption osseuse associée à dents orthodontique mouvement13.
M-CSF a été rapporté ont d’autres fonctions qui sont essentielles à la réponse immunitaire hôte. L’absence de M-CSF chez les souris op/op avec pneumonie bactérienne conduisent à l’augmentation de la charge bactérienne et de la diffusion bactérienne au foie avec nécrose hépatique14. Par conséquent, M-CSF est important pour une réponse immunologique dans la protection contre l’infection.
Cette étude démontre l’effet des anticorps anti-c-fms sur M-CSF et RANKL ou TNF-α a induit la formation d’ostéoclastes in vitro et M-CSF induit la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Ce protocole montre l’isolement des cellules de la moelle épinière murin des os longs et les étapes pour générer des macrophages de la moelle osseuse (BMM) qui sont considérés comme des précurseurs ostéoclastiques et d’induire la différenciation de BMM en ostéoclastes multinucléaires par deux méthodes ; RANKL ou TNF-α. Le protocole compare également l’arrestation d’osteoclastogenesis dans les deux méthodes à l’aide d’anticorps anti-c-fms.
Le processus par lequel la moelle osseuse est extrait et utilisée ultérieurement pour générer des précurseurs ostéoclastiques est fiable en produisant de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure qui peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval telles que le dépistage des drogues. L’utilisation de RANKL ou TNF-α pour induire l’osteoclastogenesis dans le présent protocole distingue osteoclastogenesis comme un processus physiologique (RANKL) d’osteoclastogenesis comme un processus pathologique (TNF-α), qui à son tour fournit deux procédures alternatives pour guider la décision, dont l’un est supérieur en ce qui concerne les réactifs à utiliser dans les applications en aval. Ce protocole prévoit également une méthode par laquelle nous pouvons déterminer une concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms qui peut être utilisé sans danger pour des études ultérieures impliqués dans la résorption osseuse et maladies ostéolytiques.

<table><tbody><tr>Anticorps <td></td><td></td><td>anti-c-Fms</td><td>AFS98, un anticorps monoclonal, antimurin, c-Fms (IgG2a)</td></tr><tr><td>TNF-&alpha ;</td><td></td><td></td><td>Des souris recombinantes TNF-&alpha ; préparées dans notre laboratoire. TNF-&alpha ; Fragment d’ADNc cloné par RT-PCR et cloné dans un pGEX-6P-I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) pour générer une protéine de fusion GST. GST-TNF-&alpha ; a été exprimé dans les cellules d’Escherichia coli BL21 (Stratagene, La Jolla, CA). Les cellules ont été lysées dans des conditions non dénaturantes et GST-TNF-&alpha ; a été purifié sur une colonne de glutathion-sépharose. GST a été scindé par PreScission Protease (Amersham Biosciences) par le fabricant. et a été éliminé par une colonne glutathion-sépharose.</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PEPROTECH</td><td>315-11</td><td>Ligand murin recombinant sRANK, Source : E. coli</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td></td><td></td><td>Humain recombinant M-CSF. 1/10 vol de CMG14&ndash ; 12 surnageants de culture cellulaire à 5 x 106 cellules dans une boîte de culture en suspension de 10 cm.</td></tr><tr><td>&alpha ;-MEM</td><td>Wako</td><td></td><td>avec L-Glutamine et rouge phénol Sérum</td></tr><tr><td>de veau fœtal</td><td>Biowest</td><td>s1820-500</td><td>Sérum de veau fœtal Origine française Plat</td></tr><tr><td>de culture</td><td>Corning</td><td>Plat de style</td>Corning <td></td> 100 mm x 20 mm</tr><tr><td>Plaque à 96 puits</td><td>Thermofischer Scientific</td><td></td><td>Nun clon Delta</td></tr><tr><td>surface Kit de comptage cellulaire-8</td><td>Dojindo, Kumamoto, Japon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de microplaques</td><td>Sunrise REMOTE ; Tekan Japan, Kawasaki, Japon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crépine cellulaire</td><td>Corning</td><td></td><td>40 &mu ; m Tube</td></tr><tr><td>à centrifuger</td> en nylon <td>Corning</td><td></td><td>50 mL Bouchon CentriStar</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako</td><td></td><td>Polyoxyéthylène (10) Octyphényléther</td></tr></tbody></table>

effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes in vitro

Effect of Anti-c-fms Antibody on Osteoclast Formation and Proliferation of Osteoclast Precursor In Vitro

Remodelage osseux est un processus complexe et implique des périodes de dépôt et de résorption. La résorption osseuse est un processus par lequel osseuse est décomposé par les ostéoclastes en réponse à différents stimuli. Précurseurs ostéoclastiques se différencient en ostéoclastes multinucléaires en réponse à la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL). Dans des conditions pathologiques, le profil des cytokines est différent et implique un mélange des cytokines inflammatoires. Facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) est l’un des cytokines plus importants que l'on retrouve en grande quantité dans les zones concernées avec ostéolyse inflammatoire. Le but du présent protocole est de fournir une méthode par laquelle murin de moelle osseuse est isolé pour générer les ostéoclastes par induction avec M-CSF et RANKL ou TNF-α, qui est inhibée par la suite en augmentant les doses d’anticorps anti-c-fms, le récepteur pour M-CSF. Cette expérience met en évidence la valeur thérapeutique des anticorps anti-c-fms dans les maladies inflammatoires de la résorption osseuse.

Ce protocole vise à évaluer l’effet des anticorps anti-c-fms sur la formation des ostéoclastes en présence de RANKL ou TNF-α et de déterminer l’effet du M-CSF sur la prolifération des précurseurs ostéoclastiques. Dans ce protocole, nous avons fourni un procédé fiable par laquelle de grandes quantités de cultures d’ostéoclastes pure sont générées. Nous fournissons aussi un moyen de tester la concentration appropriée d’anticorps anti-c-fms pour inhiber la formation des ostéoclastes dans des...

Ce protocole comprend la dissection de murin des os longs et l’isolement de la moelle osseuse, pour générer des macrophages de la moelle osseuse et de produire des ostéoclastes à l’aide de la colonie de macrophages stimulant facteur (M-CSF) et activateur du récepteur du ligand facteur nucléaire Kappa-B (RANKL) ou facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et leur arrestation par des anticorps anti-c-fms, récepteurs de M-CSF.

Effet des anticorps Anti-c-fms sur la Formation des ostéoclastes et la prolifération des précurseurs des ostéoclastes In Vitro

Bone remodeling is a complex process and it involves periods of deposition and resorption. Bone resorption is a process by which bone is broken down by ...

Cette expérience met en évidence la valeur thérapeutique de l’anticorps anti-c-fms dans les maladies de perturbation inflammatoire des os, telles que la polyarthrite rhumatoïde et la parodontite. Le processus par lequel la moelle osseuse est extraite et utilisée pour générer des précurseurs ostéoclastes, donne de grandes quantités d’ostéoclastes purs, qui peuvent être utilisés dans de multiples applications en aval. Ce protocole fournit deux méthodes alternatives d’ostéoclastogenèse, soit en utilisant rankl ligand ou TNF alpha.En outre, cette méthode donne un aperçu de l’effet de l’anticorps Anti-c-fms sur l’ostéoclastogenèse. La démonstration visuelle de cette procédure familiarise le chercheur avec le processus de dissection et d’obtention des cellules de moelle en grandes quantités. Pour commencer à remplir une plaque qui servira de récipient de collecte avec environ 50 millilitres d’alpha MEM, selon la taille du récipient, et le placer sur la glace.Utilisez des broches pour percer les paumes et les pieds d’une souris euthanasié pour la fixer en position supine, et vaporiser soigneusement avec 70% d’éthanol. Utilisez des ciseaux chirurgicaux stériles et des pinces à épiler pour faire une incision cutanée au niveau de la hanche et l’étendre jusqu’aux pieds, exposant les muscles. Localiser et couper le tendon attachant le muscle quadriceps.Peler le muscle et le couper au niveau de la hanche. Ensuite, localisez le tendon attachant le muscle ischio-jambier à l’os. Peler les muscles exposant l’os, et libérer les ischio-jambiers de son attachement, en s’assurant de ne pas couper dans l’os.Placez les ciseaux entre la tête du fémur et l’espace commun. Coupez-y libérant le fémur, mais en gardant l’os intact, ce qui permettra le détachement des os sans risque d’exposer la moelle osseuse. Couper les muscles attachés au tibia de la même manière.Ensuite, coupez le tibia libre de son attachement à l’articulation de la cheville, tout en gardant l’os intact pour éviter la contamination. Utilisez les lames de ciseaux et les lingettes de laboratoire pour gratter les tissus mous restants du fémur et du tibia et les placer dans la plaque préparée avec alpha MEM placé sur la glace. La dissection doit être effectuée avec soin afin de minimiser la contamination.C’est pourquoi l’ablation approfondie des tissus mous et la localisation osseuse sont cruciales. Remplissez une seringue d’aiguille de calibre 30 avec alpha MEM. Déconnecter le tibia et le fémur de l’articulation du genou, et couper les extrémités de l’os long des deux côtés à l’aide de ciseaux.Utilisez des pinces à épiler pour retenir l’os de l’arbre. Insérez l’aiguille dans l’espace de moelle osseuse et rincez lentement le contenu de la moelle dans un plat de culture de six centimètres et répétez pour tous les os. L’os deviendra blanc, ce qui indique l’extraction de toute la teneur en moelle osseuse.Utilisez une passoire à cellules en nylon de 40 micromètres pour filtrer l’extrait de moelle osseuse dans un tube de centrifugeuse conique de 50 millilitres. Centrifuger le tube à 300 fois G pendant cinq minutes. Jeter le surnatant.Pour laver, ajouter cinq millilitres d’alpha MEM à la pastille. Pipette les cellules pour les détacher, centrifugeuse, et répéter le lavage pour un total de deux fois. Après avoir compté ces cellules isolées, telles que décrites dans le manuscrit, grainer 10 millions de cellules par 10 millilitres, dans un plat de culture de 10 centimètres, et ajouter M-CSF aux cellules.Incuber la culture à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. Retirer le milieu après trois jours, et laver les cellules deux fois vigoureusement avec 10 millilitres de PBS pour enlever les cellules nonherent. Ajouter cinq millilitres de température ambiante 0,02% trypsine-EDTA et PBS, et incuber à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.Bien pipette les cellules pour les détacher. Observez la culture au microscope pour vous assurer que les cellules ont été détachées et apparaissent arrondies et flottant dans les médias. Lorsque les cellules ont été détachées, inactivez la réaction en ajoutant cinq millilitres de l’alpha MEM.Recueillir les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et une centrifugeuse à 300 fois G pendant cinq minutes. Après avoir jeté le supernatant, laver avec cinq millilitres d’alpha MEM, et centrifugeuse à nouveau à 300 fois G pendant cinq minutes. Suspendre à nouveau la pastille en 10 millilitres d’alpha MEM.Ensemencer 1 million de cellules par 10 millilitres dans un plat de culture de 10 centimètres, et ajouter M-CSF. Incuber la culture à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant trois jours. Récoltez les cellules attachées, qui représentent les MBM comme précurseurs ostéoclastes après trois jours, comme cela a été fait précédemment pendant la génération de MBM.Ensemencer les MBM à 50 000 cellules par 200 micro litres d’alpha MEM dans une plaque de puits de 96 par puits. À chaque puits, ajouter les stimuli désirés. Et puis ajouter M-CSF pour une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre.Ajouter des anticorps Anti-c-fms à chaque puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone pendant quatre jours, tout en changeant de média tous les deux jours pendant quatre jours. Et puis procéder à la coloration et les analyses, comme décrit dans le manuscrit.La formation ostéoclaste dans la culture traitée par M-CSF et RANKL, avec l’anticorps anti-c-fms, a été évaluée. Avec 101 000 nanogrammes par anticorps anti-c-fms millilitre, une diminution significative du nombre d’ostéoclastes a été observée par rapport au contrôle. Alors que, avec un nanogramme sur 10 par millilitre anticorps Anti-c-fms, il n’y avait pas de diminution significative.Puis, la formation ostéoclaste dans la culture alpha de M-CSF et de TNF, avec l’anticorps d’Anti-c-fms, a été évaluée. Avec 10, 100, 1000 nanogrammes par millilitre anticorps anti-c-fms, une diminution significative du nombre d’ostéoclastes a été observée par rapport au contrôle, sans diminution significative à un nanogramme par millilitre. Et la culture M-CSF avec 1, 10, 100 nanogrammes par millilitre anticorps Anti-c-fms, il n’y avait pas de diminution significative du nombre de précurseurs ostéoclastes par rapport à la lutte.Cependant, à 1000 nanogrammes par millilitre, il y a eu une diminution significative du nombre de précurseurs ostéoclastes, ce qui indique qu’une concentration aussi élevée que 1000 nanogrammes par millilitre est nécessaire pour inhiber significativement la prolifération des précurseurs ostéoclastes. Assurez-vous de libérer les liaisons tout en gardant l’os intact, ce qui minimisera les risques de contamination.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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