Name: Analyse de l’endocytose absorption et Transport rétrograde au réseau Trans-Golgi dans des cellules cultivées à l’aide de Nanocorps fonctionnalisés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 5 s
Description: Découvrez l'analyse du transport rétrograde des protéines vers le réseau trans-Golgi dans les cellules HeLa à l'aide de nanocorps fonctionnalisés. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de l'homéostasie membranaire.

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Ce travail a été soutenu par Grant 31003A-162643 par la Swiss National Science Foundation. Nous remercions Nicole Beuret et le Biozentrum Imaging Core Facility (IMCF) pour la prise en charge.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nanocorps représentent une nouvelle classe d’échafaudages de liant de protéine avec nombreux avantages par rapport aux anticorps traditionnels : ils sont petits, stable, monomère, peuvent être sélectionnés pour les obligations de haute affinité et manque le disulfure33,35, 44 , 45. ils sont utilisés dans un certain nombre d’applications, tels que dans les systèmes de cultures cellulaires et les...

Le trafic rétrograde des protéines et des lipides de la surface de la cellule aux différents compartiments intracellulaires est crucial pour le maintien de l’homéostasie de la membrane afin de contrebalancer la sécrétion et de recycler les composants d’antérograde transport machineries1 , 2. après internalisation par endocytose clathrine dépendant ou - indépendant, cargaison de protéines et de lipides commencez par remplir tôt endosomes d'où ils sont encore redirigé soit le long du système endo-lysosomale, recyclé à la membrane plasmique, ou ciblées au réseau trans-Golgi (TGN). Recyclage des endosomes et/ou la surface de la cellule vers le TGN fait partie du cycle fonctionnel d’un certain nombre de récepteurs transmembranaires fret antérograde comme les récepteurs de mannose-6-phosphate cation-dépendants et indépendants de cation (CDMPR et CIMPR) de livraison nouvellement synthétisé hydrolases lysosomales de la TGN à fin endosomes et lysosomes3,4,5, sortiline et SorLA6,7, Wntless (WLS) transportant des ligands Wnt à la surface des cellules 8 , 9 , 10 , 11. autres protéines récupérées vers le TGN sont TGN46 et ses isoformes connexes12,13,14, SNAREs (récepteurs solubles de fixation de fusion - éthylmaléimide-sensible-facteur des N) 15 , 16 , 17, précurseur de l’amyloïde (APP) de protéines18,19, ankylose progressive (ANK) protéines20métalliques transporteurs transmembranaires et comme ATP7A/B ou DMT121,22, traitement des enzymes dont la carboxypeptidase D, la furine ou BACE123,24,25. En dehors de ces protéines endogènes, les toxines bactériennes et végétales (p. ex., toxine de Shiga et le choléra, ricine et abrin) détournent les mécanismes de transport rétrograde pour atteindre l’ER pour retrotranslocation dans le cytosol26,,27, 28,29.
Afin d’analyser directement les trafic rétrograde, nous avons précédemment développé un ensemble d’outils axés sur les nanobody pour étiqueter une suivre protéines cargo de la surface de la cellule à compartiments intracellulaires30. Nanocorps représentent une nouvelle famille de protéines liants dérivés de homodimérique heavy-chain-seulement anticorps (hcAbs) qui se produisent naturellement dans les poissons cartilagineux et camélidés31,32. Ils constituent le domaine variable de chaîne lourde (HHV) de hcAbs et ont de nombreux avantages par rapport aux anticorps traditionnels (p. ex., IgG) : ils sont monomères, petit (~ 15 kDa), hautement soluble, dépourvu de ponts disulfures, peut être exprimée par les bactéries et sélectionné pour liaison de haute affinité33,34,35,36. Pour rendre notre outil nanobody polyvalente et largement applicable, nous avons utilisé fonctionnalisés anti-GFP nanocorps aux protéines de surface-étiquette et piste taggés GFP à leur domaine extracellulaire/lumière. Par fonctionnalisation de nanocorps avec mCherry, peroxydase d’ascorbate 2 (APEX2)37, ou séquences de tyrosine de sulfatation (TS), transport rétrograde des protéines transmembranaires de cargaison de bonne foi peut être analysé par soit fixe et imagerie cellulaire, en direct de microscopie électronique, ou biochimique. Puisque la sulfatation tyrosine médiée par des sulfotransférases tyrosylprotéine (TPST1 et TPST2) est une modification post-traductionnelle restreinte pour le trans-Golgi/TGN, nous pouvons étudier directement transport et la cinétique des protéines d’intérêt de la surface de la cellule à cette intracellulaire Golgi compartiment38,39,40.
Dans cet article des méthodes, nous décrivons la facilité de production des nanocorps fonctionnalisés (VHH-2xTS, - APEX2, - mCherry et dérivés), adapté pour un certain nombre d’applications pour analyser le transport rétrograde dans les cellules de mammifères,30. Nous nous concentrons principalement sur l’utilisation de TS site-modifié nanobody pour l’analyse du trafic intracellulaire de la surface cellulaire vers le compartiment de sulfatation.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-GFP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118144600001</td><td>produit est distribué par Sigma-Aldrich, mais fabriqué par Roche</td></tr><tr><td>Anticorps anti-His6</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A190-114A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-actine</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0545</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-souris HRP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-0168</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>dissous dans 1x PBS/1 %BSA</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Applichem</td><td>A3672</td><td></td></tr><tr><td>D-biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4501</td><td>dissous dans 500 mM stérile 500 mM de NaH2PO4 ou DMSO</td></tr><tr><td>5-aminolevuilnic acid (dALA) chlorhydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>dissous dans de l’eau stérile</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Applichem</td><td>A3778</td><td>dissous dans de l’eau stérile</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18037059001</td><td>Le produit est distribué par Sigma-Aldrich, mais fabriqué par Roche</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5936</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pr-1</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/Streptomycine</td><td>Bioconcept</td><td>4-01F00-H</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Applichem</td><td>A3704</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' Eagle modifié' s medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FCS)</td><td>Biowest</td><td>S181B-500</td><td></td></tr><tr><td>Sulfur-35 sous forme de sulfate de sodium</td><td>Hartmann Analytics</td><td>ARS0105</td><td>Le produit contient 5 mCi</td></tr><tr><td>Sels équilibrés d’Earle</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6267</td><td></td></tr><tr><td>MEM solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>MEM solution vitaminique (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete, Mini cocktail inhibiteur de protéase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Le produit est distribué par Sigma-Aldrich, mais fabriqué par Roche</td></tr><tr><td>Isopropyl-&beta ;-D-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Applichem</td><td>A1008</td><td>dissous dans de l’eau stérile, le stock est de 1 M</td></tr><tr><td>Sel de carbénicilline disodique</td><td>Applichem</td><td>A1491</td><td>dissous dans de l’eau stérile, la substance est de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Sulfate de kanamycine</td><td>Applichem</td><td>A1493</td><td>dissous dans de l’eau stérile, la substance est de 100 mg/mL</td></tr><tr><td>Coomassie-R (Brilliant Blue)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B-0149</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Applichem</td><td>A3813</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Ni Sepharose Haute Performance</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5268-01</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes His GraviTrap</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0033-99</td><td></td></tr><tr><td>Kit tampon His</td><td>GE Healthcare</td><td>GE11-0034-00</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de dessalage jetables PD10</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>Gels Mini-Protean TGX, 4-20 %, 15 puits</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) sans Ca2+/Mg2+</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Plats de 35 mm</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>plaques à 6 puits</td><td>TPP</td><td>92406</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre (n° 1.5H)</td><td>VWR</td><td>631-0153</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF)</td><td>Applichem</td><td>A0999.0025</td><td>dissous dans 40 % de DMSO 60 % d’isopropanol, mère dans 500 mM</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Applichem</td><td>A1553</td><td></td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>Applichem</td><td>A1552</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Merck Millipore</td><td>105833</td><td>dissous dans de l’eau stérile, la matière est de 1 M</td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Merck Millipore</td><td>102382</td><td>dissous dans de l’eau stérile, la matière est de 1 M</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Merck Millipore</td><td>106404</td><td>dissous dans de l’eau stérile, la crosse est de 5 M</td></tr></tbody></table>

analyse de l’endocytose absorption et transport rétrograde au réseau trans-golgi dans des cellules cultivées à l’aide de nanocorps fonctionnalisés

Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells

Transport des protéines et les membranes de la surface de la cellule à l’appareil de Golgi et au-delà est essentiel pour l’homéostasie, l’identité de l’organite et physiologie. Afin d’étudier les protéines rétrograde trafic, nous avons récemment développé une boîte à outils polyvalent basé sur nanobody pour analyser des transports de la surface cellulaire pour le complexe de Golgi, soit par l’imagerie fixe et de cellules vivantes, en microscopie électronique, ou biochimique. Nous avons conçu le nanocorps fonctionnalisés anti-vert protéine fluorescente (GFP) — reliures petit, monomère, haute affinité des protéines — qui peut être appliqué aux lignées de cellules exprimant des protéines de la membrane d’intérêt avec une portion extracellulaire de GFP. Nanocorps dérivés liés aux reporters GFP sont spécifiquement internalisés et transporté piggyback le long des routes de tri des journalistes. Nanocorps ont été fonctionnalisés avec des fluorophores à suivre le transport rétrograde en microscopie par fluorescence et de vivre l’imagerie, avec peroxydase d’ascorbate 2 (APEX2) pour étudier la localisation ultrastructurale de journaliste-nanobody complexes par les électrons microscopie et avec des motifs de sulfatation (TS) de tyrosine pour évaluer la cinétique d’arrivée du réseau (TGN) trans-Golgi. Dans cet article méthodologique, nous décrivons la procédure générale pour exprimer par les bactéries et de purifier nanocorps fonctionnalisés. Nous illustrons l’utilisation puissante de notre outil à l’aide de la nanocorps mCherry - et TS-modification pour analyser l’absorption endocytose et arrivée de TGN des protéines de la cargaison.

Afin d’étudier le transport des protéines rétrograde vers diverses destinations intracellulaires, nous avons récemment créé un outil anti-GFP nanobody pour étiqueter des protéines de fusion recombinantes découlent de la surface cellulaire30. Ici, nous démontrons la production bactérienne de ces dérivés nanocorps et démontrer leur application pour étudier l’absorption endocytose par microscopie à fluorescence et immunoblotting, ainsi que leur utilisation afin d’étud...

Transport rétrograde des protéines de la surface de la cellule de l’appareil de Golgi est essentielle pour maintenir l’homéostasie de la membrane. Nous décrivons ici une méthode pour analyser biochimiquement transport de surface-à-Golgi cellulaire des protéines recombinantes, nanocorps fonctionnalisés dans les cellules HeLa.

Analyse de l’endocytose absorption et Transport rétrograde au réseau Trans-Golgi dans des cellules cultivées à l’aide de Nanocorps fonctionnalisés

Transport of proteins and membranes from the cell surface to the Golgi and beyond is essential for homeostasis, organelle identity and physiology. To ...

Cette méthode permet la production et l’application de nano-corps bactériens exprimés et fonctionnalisés pour analyser le transport rétrograde des protéines de la surface cellulaire vers les compartiments intercellulaires. En particulier le réseau Trans-Golgi. Le principal avantage de cette technique est l’utilisation de la sulfation. Une modification post-traduction très spécifique, compartimentée et sensible pour évaluer l’arrivée d’un complexe nano-corps de reporter dans le compartiment DTN. Cette méthode, combinée à d’autres nano-corps dérivatisés pour l’imagerie cellulaire de vie et la microscopie électronique, peut également être utilisée pour étudier les processus endocitiques des récepteurs de surface cellulaire liés à la maladie. Notre répertoire de nano-corps fonctionnalisés a été conçu pour étudier le transport rétrograde dans les cellules de culture. Cependant, ces outils peuvent également être appliqués dans des organismes multicellulaires. Pour commencer cette procédure, choisissez une colonie bactérienne contenant le vecteur d’intérêt de la plaque et inoculer un flacon contenant 20 millilitres de LB moyen complété par des antibiotiques. Incuber toute la nuit à 37

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Cette vidéo présente une méthode pour étudier l’absorption et le transport rétrograde de nanocorps fonctionnalisés afin de comprendre leurs voies de trafic intracellulaire. En introduisant du sulfate radiomarqué et en utilisant des techniques d’isolement et de détection, cette méthode permet d’étudier l’absorption endocytaire et l’arrivée des protéines cargo par le réseau trans-Golgi.

Suivi de l’arrivée de protéines de surface marquées à la GFP dans le réseau trans-Golgi à l’aide de nanocorps fonctionnalisés

Le trafic membranaire implique le transport des protéines de la membrane plasmique vers l’intérieur de la cellule (c’est-à-dire l’endocytose), suivi du trafic vers les lysosomes pour la dégradation ou vers la membrane plasmique pour le recyclage. Les méthodes décrites dans cet article sont conçues pour étudier l’endocytose et le recyclage des protéines de la membrane plasmique.

Les tests de protection du L-glutathion à base cellulaire pour étudier l’endocytose et le recyclage des protéines de la membrane plasmique

Nous décrivons un procédé pour marquer la protéine à la surface des neurones vivants en utilisant un anticorps polyclonal spécifique à des épitopes extracellulaires. Protéine liée par l'anticorps sur la surface de la cellule et ensuite internalisée par endocytose peut être distinguée de la protéine restante sur, ou à un trafic, de la surface au cours de l'incubation.

Étiquetage différentiel de surface cellulaire et intériorisé protéines après Anticorps alimentation de Live de culture neurones

Cet article décrit les méthodes pour la synthèse et le marquage fluorescent de nanoparticules (NP). Les IP ont été appliquées dans des expériences pulse-chase d'étiqueter le système endo-lysosomale des cellules eucaryotes. La manipulation du système d'endo-lysosomal par les activités de l'agent pathogène intracellulaire Salmonella enterica ont été suivis par imagerie des cellules vivantes et quantifiée.

Application de nanoparticules fluorescentes pour étudier Rénovation du système Endo-lysosomale par des bactéries intracellulaires

le trafic de signalisation et module récepteur cellulaire réactivité aux ligands et est, elle-même, répondant à des conditions cellulaires, y compris la signalisation induite par le ligand. Ici, nous décrivons une technique puissante et flexible pour évaluer quantitativement le trafic des récepteurs induite par le médicament en utilisant immunomarquage et analyse colocalizational.

Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

L'étude du trafic membranaire est cruciale pour comprendre les fonctions neuronales. Ici, nous introduisons un procédé pour quantifier la motilité des vésicules dans les neurones. C'est une méthode pratique qui peut être adaptée à la quantification du trafic membranaire dans le système nerveux.

Quantification des molécules d&#39;endosome et de lysosome dans les neurones cultivés utilisant des sondes fluorescentes

Deux méthodes basées sur la biotinylation, conçues pour déterminer l'expression de la surface cellulaire et la vitesse endocytaire des protéines exprimées à la membrane plasmatique, sont présentées dans ce rapport.

Détermination de l&#39;expression de la surface cellulaire et du taux endocytique des protéines dans les cultures d&#39;astritcy primaires utilisant la biotinylation

Nous décrivons une analyse optique des vésicules synaptiques (SV) recyclage dans les neurones en culture. Alliant ce protocole de transfection double pour exprimer un marqueur présynaptique et la protéine d’intérêt permet de localiser les sites présynaptiques, leur Vésicule synaptique capacité de recyclage et déterminer le rôle de la protéine d’intérêt.

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Les endosomes de recyclage font partie du réseau tubulaire endosomal. Nous présentons ici une méthode pour quantifier la dynamique du recyclage des endosomes en utilisant GFP-STX13 comme marqueur d’organite.

Le test basé sur la microscopie pour étudier et analyser les endosomes de recyclage à l’aide du trafic SNARE

Le transport endocytaire et rétrograde des protéines de la membrane plasmique vers le réseau trans-Golgi est essentiel au maintien de l’homéostasie membranaire et à la régulation de la signalisation. Ici, nous décrivons une méthode pour imager et quantifier le transport endocytaire de protéines cargo transmembranaires par microscopie à cellules vivantes en utilisant des nanocorps anti-GFP dérivés dans des cellules HeLa.

Imagerie de cellules vivantes du transport endocytaire à l’aide de nanocorps fonctionnalisés dans des cellules en culture

Découvrez l'analyse du transport rétrograde des protéines vers le réseau trans-Golgi dans les cellules HeLa à l'aide de nanocorps fonctionnalisés. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes de l'homéostasie membranaire.

Analyse de l’endocytose absorption et Transport rétrograde au réseau Trans-Golgi dans des cellules cultivées à l’aide de Nanocorps fonctionnalisés (Vidéo) | JoVE Journal

Analyse de l’endocytose absorption et Transport rétrograde au réseau Trans-Golgi dans des cellules cultivées à l’aide de Nanocorps fonctionnalisés

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