Visualisation fluorescente de l'ARN étiqueté mangue dans les gels de polyacrylamide par l'intermédiaire d'une méthode de coloration

La méthodologie d’imagerie par gel marquée Mango démontrée ici est robuste et devrait pouvoir être simplement étendue en termes de sensibilité et de spécificité. Cela simplifierait davantage la purification systématique des ARN et des complexes d’ARN biologiquement importants par le simple opportunisme d’ajouter une étiquette mango à l’ARN d’intérêt. Arn sont impliqués dans de plus en plus de maladies pour cette méthode post datation est un moyen facile et rapide pour être en mesure de suivre et de visualiser l’ARN.

Un soin supplémentaire sera nécessaire pour transférer le gel d’un endroit à l’autre car les gels sont fragiles et sujets à la rupture. Pour préparer un gel de dénaturation de 30 millilitres, sélectionnez d’abord le pourcentage de polyacrylamide avec le bleu bromophénol approprié, et les dyes de cyanol de xylène comparées à un ARN d’intérêt pour assurer la séparation élevée de bande. Ensuite, mélangez les solutions A, B et C selon le tableau un et ajoutez APS et timud.

Versez immédiatement la solution de gel dans un appareil approprié de coulée de gel. Insérer le cône désiré et laisser le gel à la polymése pendant environ 30 minutes. Composent le réservoir de gel à l’aide de la solution 1 XTBE et retirez soigneusement le cône.

Soulevez soigneusement le gel et montez sur l’appareil de gel et fixez-les à l’aide de pinces liant. À l’aide d’une seringue, aspirer les puits immédiatement avant le chargement de l’échantillon. Préparez 1X échantillons d’ARN en ajoutant la solution de chargement de gel de dénaturation 2X aux échantillons d’ARN d’intérêt.

Utilisez un thermocycleur pour chauffer les échantillons à 95 degrés Celsius pendant cinq minutes. Ensuite, chargez les échantillons refroidis au fond de chaque puits à l’aide de conseils de chargement de gel. Et bien le gel à température ambiante assurant la puissance est effectivement faible pour ne pas casser la plaque de verre de l’appareil de gel.

Préparez la solution de coloration de gel 1X selon le manuscrit dans un récipient en verre propre qui est assez large pour s’adapter confortablement au gel. Ajoutez suffisamment de solution de coloration de gel 1X au récipient afin que le gel soit complètement recouvert de la solution lorsqu’il est placé sur un rotateur orbital. Une fois que le gel se termine en cours d’exécution, retirer le gel de l’appareil, couper ses puits, et un coin du gel afin d’aider à déterminer l’orientation.

Ensuite, transférez soigneusement le gel dans la solution de coloration du gel 1X. Pour effectuer l’imagerie, décanter soigneusement la solution de coloration et rincer le gel rapidement à l’eau. Enfin, transférez soigneusement le gel sur le plateau pour le placer dans l’imageur.

Rouler une pipette en verre sur le gel pour enlever les bulles piégées et l’excès de liquide. Et procéder à prendre une image de gel. Les aptamères de mangue un, deux, trois, quatre ont été sensiblement résister à la dénaturation jusqu’à environ une concentration molaire d’urée.

20 à 40 minutes de temps de coloration était suffisant pour la florescence maximale de gel. Le temps plus long n’était pas approprié pour les petits ARN utilisés dans cette étude car ils ont commencé à diffuser hors du gel. L’analyse de fluoromètre a prouvé que les aptamères de mangue un, deux, et trois en présence de l’urée pourraient plier plus rapidement que l’aptamer quatre.

En l’absence d’urée, le pliage a été beaucoup plus rapide que prévu. La sensibilité de la méthode de coloration de poteau a été montrée par les bandes simples correspondant aux ARN bien pliés pour chacune des variantes de mangue dans les gels indigènes et dénaturants avec un peu moins de sensibilité pour le plus tard. Quantification des gels indigènes a été journal linéaire sur environ un ordre de grandeur avec Mango un, deux, et quatre se comportant d’une manière plus linéaire que Mango trois.

La quantification des gels dénaturants était plus linéaire suggérant que la présence d’urée dans le gel de dénaturation pourrait fournir un moyen plus homogène de plier les aptamères une fois qu’ils sont placés dans la solution de coloration de biotine TO1. Les ARN marqués à la mangue peuvent être détectés en présence de l’ARN total à l’aide de taches de biotine TO1 par rapport à la coloration SG. N’oubliez pas de vous assurer que le contenant de coloration de gel est assez grand pour s’adapter au gel sinon le gel peut se replier sur lui-même.

Les échantillons d’ARN seront transférés d’un endroit à l’autre. Semblable aux gels dénaturants, cette méthode peut être exécutée pour un gel indigène. Faire fonctionner le gel dans une pièce froide à une puissance inférieure pour maintenir les conditions indigènes.