Name: Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de los non décalcifié (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Découvrez une méthode d'immunofluorescence pour détecter les protéines dans les tissus crâniofaciaux de souris sans décalfication ni récupération antigénique. Cette technique simplifiée permet d'obtenir des résultats de haute qualité tout en réduisant le temps et la main-d'œuvre nécessaires.

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Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01DE020843 à Y.M.), l'International FOP Association (Y.M.) et une subvention de la National Natural Science Foundation of China (31500788 à J.Y.).

Toutes les expériences sur la souris ont été menées conformément aux lignes directrices de l'Université du Michigan concernant les soins et l'utilisation des animaux dans la recherche. Toutes les procédures animales utilisées dans cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux (IACUC) de l'Université du Michigan (Protocole #PRO00007715).
1. Préparation des tissus
<ol><li>
Préparation des tissus embryonnaires
	<ol>
<li>Préparer un plat de 10 cm et plusieurs plats de 3,5 cm contenant de la saline tamponnée en phosphate (PBS), et une plaque de culture de 12 puits contenant 2 mL 4 % de paraformaldéhyde (PFA) en PBS dans chaque puits pour chaque souris enceinte. Déposer tous les plats Petri et l'assiette sur la glace. REMARQUE: Manipulez 4% de PFA dans une hotte de fumée.</li>
		<li>Disséquer les embryons de souris enceintes dans le PBS glacé avec des forceps et des ciseaux comme décrit précédemment14.<ol>
<li>En bref, euthanasier une souris enceinte avec CO2, saisir la peau sous le centre du ventre avec des forceps et couper à travers la peau seulement, puis tirez doucement sur la peau pour la séparer de la paroi musculaire abdominale sous-jacente.</li>
			<li>Ensuite, couper dans la cavité abdominale en suivant la même ligne de l'incision de la peau. Enlever l'utérus contenant une chaîne d'embryons et enlever les embryons en coupant doucement la paroi utérine. Les tissus extraembryonnaires tels que le sac jaune et l'amnion seront enlevés.</li>
			<li>Couper et isoler la tête de chaque embryon.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Transférer chaque tête dans chaque puits d'une plaque de 12 puits contenant 4% de PFA avec une pipette de transfert en plastique ou des forceps. Fixer les échantillons dans 4 % de PFA à 4 oC pendant 4 h. Rincer les échantillons en PBS à 4 oC avec une secousse douce pendant 12 h. REMARQUE: Pour les embryons de moins de 16,5 (E16.5) embryonnaires, fixez les têtes d'embryon avec 4 % de PFA directement après l'isolement. Pour les embryons à E16.5 ou plus tard, retirer pour jeter la peau et le tissu adipeux des têtes et rincer plusieurs fois dans le PBS froid de glace avant la fixation.</li>
		<li>Cryoprotect têtes.<ol>
<li>Transférer chaque tête dans une nouvelle plaque de 12 puits contenant 2 ml de 30 % de saccharose en PBS à l'aide d'une pipette ou de forceps de transfert en plastique. Agiter doucement à 4 oC jusqu'à ce que la tête s'enfonce au fond du plat.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Enclenché des têtes.<ol>
<li>Transférer la tête cryoprotégée dans un moule contenant un composé optimal de température de coupe (OCT). Equilibrate échantillons en OCT pendant plusieurs minutes. Ajuster l'emplacement et la direction des échantillons avec des forceps.</li>
			<li>Placer le moule sur de la glace sèche pour congeler. Conserver les cryomolds qui en résultent dans un sac en plastique à -80 oC jusqu'à ce qu'ils soient prêts à être cryosectionné. REMARQUE: Le côté taillé des échantillons doit faire face au fond du moule d'encastrement.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Préparation des tissus durs non décalcifiés postnatals
	<ol>
<li>Euthanasier à 3 semaines ou 3 mois souris avec CO2. Enlever la peau et les tissus adipeux. Couper et isoler la tête ou les os longs de la souris.</li>
		<li>Fixer et cryoprotéger la tête ou le long os des souris tel que décrit dans les étapes 1.1.3-1.1.4.</li>
		<li>Encastré dans 8% de gélatine de la même manière que l'étape 1.1.5. Conserver les cryomolds dans un sac en plastique à -80 oC jusqu'à ce que la cryosection soit cryosection. REMARQUE: La décalcification n'est pas nécessaire ici. Pour préparer 8 % de gélatine, mélanger 8 g de gélatine avec 100 ml de PBS et faire bouillir à l'aide d'un micro-ondes. Sachez que le mélange bout facilement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Cryosectioning
<ol><li>Fixer la température du cryostat à -18 oC pour les tissus mous incorporés dans l'OCT ou à -25 oC et plus bas pour les tissus durs non décalcifiés incorporés dans la gélatine. Conserver les échantillons dans la chambre cryostat pendant environ 30 min pour l'équilibre à la température du cryostat.</li>
	<li>Expulser le bloc du cryomold. Congelez le bloc sur le mandrin de spécimen (porte de tissu) par le montage avec une baisse d'OCT. Gardez le côté paré de l'échantillon le plus éloigné du mandrin (face à l'opérateur).</li>
	<li>Chargez le mandrin monté sur le support de l'objet cryostat. Ajustez le support de la lame pour que l'angle de la lame soit de 3 à 5 degrés par rapport à l'échantillon.</li>
	<li>Recueillir des sections de 10 m sur des lames de microscope enduites. Sécher complètement les sections à RT, puis les stocker à -80 oC.</li>
</ol>3. Staining histologique et imagerie microscopique
<ol><li>Coloration d'immunofluorescence
	<ol>
<li>Sortez les toboggans à partir de -80 oC. Gardez les diapositives à RT pendant 1 h pour les sections de dry. Rincer les diapositives dans 0,1 % de PBST (0,1 % D'éthylène glycol tert-octylyl dans PBS; voir Table of Materials) trois fois pendant 5 min chacun pour laver les sections OCT et perméabilize.</li>
		<li>Optionnellement, effectuer la récupération d'antigène (facultatif).<ol>
<li>Préchauffer le tampon de citrate (10 mM de citrate de sodium pH 6) dans le plat de coloration avec vapeur ou bain d'eau à 95 à 100 oC. Immerger les glissières dans le tampon de citrate, couver pendant 10 min.</li>
			<li>Sortez le plat de coloration du vapeur ou du bain d'eau pour RT. Refroidir les toboggans à RT pendant 20 min ouplus 15. REMARQUE: Comme alternatives, utilisez le tampon Tris-EDTA (base Tris 10 mM, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9.0) ou edTA buffer (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) pour la récupération d'antigène induite par la chaleur. Utilisez un autocuiseur, un four à micro-ondes ou un bain d'eau pour la récupération d'antigènes induits par la chaleur, en plus du vapeur chaud. Une récupération d'antigène induite par l'enzyme à l'aide de trypsine ou de pepsine est une autre alternative. Optimiser la concentration et le temps de traitement de la récupération enzymatique pour éviter les sections dommageables. Optimisez la méthode de récupération d'antigène pour chaque combinaison anticorps/antigène.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Incuber chaque diapositive avec 200 l de solution de blocage (5% de sérum d'âne dilué en 0,1% DepBST) à RT pendant 30 min, puis retirer la solution de blocage sans rincer.</li>
		<li>Incuber chaque diapositive avec 100 oL d'anticorps primaires ou d'anticorps dilués dans la solution de blocage pendant 1 h à RT ou O/N à 4 oC. Rincer les diapositives avec PBS trois fois pendant 10 min chacune à RT.</li>
		<li>Incuber chaque diapositive avec 100 l d'anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage pendant 1 h à RT. Rinse glisse en PBS trois fois pendant 10 min chacun à RT. Protégez les diapositives de la lumière.</li>
		<li>Monts coulis.<ol>
<li>Ajouter deux gouttes de milieu anti-fade avec DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) sur la diapositive. Ensuite, couvrez-le d'un bordereau.</li>
			<li>Conserver à 4 oC dans l'obscurité jusqu'à ce qu'il soit prêt à l'image. REMARQUE: Comme alternative, étiquetez les noyaux avec DAPI ou Hoechst 33324 colorant dilué 1:2,000 dans PBS à RT d'abord, puis monter avec du glycérol.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) coloration. REMARQUE: L'ADN à double brin avec 3'-hydroxyl termini (3'OH DNA termini) se formera pendant l'apoptose dans la cellule. Ici, nous fournissons un protocole qui étiquete le termini d'ADN 3'OH gratuit in situ via l'étiquetage des fragments d'ADN avec la digoxinine-nucléotide en utilisant terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) par coloration spécifique à l'aide d'un kit commercial (voir Tableau des matériaux ).<ol>
<li>Optionnellement, les sections de tache avec les anticorps secondaires primaires et Alexa Fluor-488 étiquetés avant la coloration de TUNEL. Rincer les diapositives en PBS trois fois pendant 10 min chacune. REMARQUE: Cette étape est facultative pour une double coloration d'une protéine et TUNEL dans la même diapositive.</li>
		<li>Incuber chaque diapositive avec 100 L Proteinase K (10 g/mL en 10 mM Tris pH 7,5 et 5 mM EDTA) pendant 5 min à RT. Rinse glisse avec PBS trois fois pendant 10 min chacun à RT. REMARQUE: Ajuster le temps d'incubation et la température de Proteinase K pour chaque type de tissu. Pour 10 sections de têtes d'embryons fixées en 4% PFA, incuber pendant 5 min à RT. En plus de la méthode utilisant Proteinase K, utiliser des traitements alternatifs au besoin, y compris (1) fraîchement préparé 0,1% Polyéthylène glycol tert-octylyl éther, 0,1% de citrate de sodium, 10 min à 37 oC; (2) 0,25 % à 0,5 % de Pepsin en HCl (pH 2) ou 0,25 % de trypsine, 10 min à 37 oC; et (3) irradiation micro-ondes avec tampon de citrate de 0,1 M (pH 6).</li>
		<li>Appliquer 200 l de solution de blocage (5 % de sérum d'âne dilué en 0,1 % de PBST) sur chaque diapositive, incuber à RT pendant 30 min, appuyez sur la solution de blocage sans rincer.</li>
		<li>Appliquer 50 ll du tampon d'équilibre fourni par le kit sur chaque diapositive à RT pendant au moins 10 s. Appuyez sur le tampon sans rinçant.</li>
		<li>Préparer le mélange de réaction (enzyme TdT de force de travail) en mélangeant TdT Enzyme avec le tampon de réaction fourni par le kit au rapport de 3:7. Appliquer 50 ll du mélange de réaction sur chaque diapositive et incuber à 37 oC pendant 1 h. Appuyez sur le tampon sans rincer.</li>
		<li>Appliquer 200 l l de la mémoire tampon d'arrêt (1:30 diluée en ddH2O) fournie par le kit à chaque diapositive, puis incuber à RT pendant 10 min. Rincer les diapositives avec PBS trois fois pendant 10 min chacune.</li>
		<li>Étiquette avec anticorps Rhodamine.<ol>
<li>Appliquer 50 ll de conjugué anti-digoxigenine (rhodamine) (1:1 dilué dans la solution de blocage) à chaque diapositive. Incuber à RT pendant 30 min dans l'obscurité.</li>
			<li>Rincer les diapositives avec PBS trois fois pendant 10 min chacune. Le mont glisse comme étape 3.1.6.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>4. Acquisition d'imagerie
<ol><li>Utiliser des contrôles positifs (tissus positifs pour l'antigène cible) pour vérifier l'étiquetage du signal et les contrôles négatifs (omettre l'anticorps primaire, contrôle de l'isotype ou des tissus négatifs pour l'antigène cible) pour évaluer l'arrière-plan des images sous le fluorescent microscope.</li>
	<li>Définir les conditions de l'équipement et de la caméra (expositions et autres paramètres généraux) pour l'imagerie en fonction de l'intensité du signal des contrôles négatifs et positifs. REMARQUE: Ces conditions varient par (1) caméras et microscopes utilisés pour l'imagerie, (2) anticorps et (3) tissus pour chaque expérience. Les conditions courantes utilisées pour les tissus craniofacial sont ISO 200 avec un temps d'exposition allant de 1/100 s à 1 s dépendent de la qualité et la spécificité des anticorps. Les grossissements appropriés varient selon la taille des échantillons et le but des expériences.</li>
	<li>Acquérir des images avec un microscope épifluorescence classique ou un microscope confocal. Acquérir des images (y compris celles des contrôles correspondants) dans les mêmes conditions pour chaque canal couleur. Enregistrer des images avec le même format (tiff est le meilleur pour préserver l'information).</li>
</ol>5. Quantification de la fluorescence
REMARQUE: Dans de nombreux cas, la comparaison statistique des taches entre les différents groupes sera plus instructive. Avec les images d'immunofluorescence, quantifiez le niveau relatif de la protéine en mesurant la densité du signal, en comptant les cellules positives ou en calculant les zones positives. Pour l'analyse statistique, le nombre minimum d'échantillons biologiquement indépendants est de 3. Une méthode typique consiste à générer au moins trois sections de chaque échantillon et à prendre des images pour au moins trois zones représentatives dans chaque section.
<ol><li>
Quantification de l'intensité de la fluorescence à l'aide d'ImageJ
	<ol>
<li>Ouvrez le logiciel, et utilisez Analyze 'gt; Set Measurements pour vérifier que seule la zone et la densité intégrée sont sélectionnées. Utilisez le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir les images à analyser.</li>
		<li>Utilisez la barre d'outils pour sélectionner l'icône carrée ou circulaire à l'extrême gauche. Sélectionnez la zone à analyser sur l'image à l'aide de l'outil de sélection. Utilisez Analyze 'gt; Mesure pour obtenir la lecture de la zone sélectionnée et la densité intégrée dans la fenêtre Résultats. Sélectionnez une région à côté d'une cellule positive qui n'a pas de fluorescence pour lire l'arrière-plan.</li>
		<li>Répétez l'étape 5.1.2 pour analyser d'autres images. Ajusté la zone à analyser pour correspondre à celle de la première image.</li>
		<li>Copiez toutes les données de la fenêtre Résultats et collez dans une feuille de calcul une fois terminée sa mise en analyse.</li>
		<li>Calculer l'intensité de fluorescence corrigée (CTCF) comme densité intégrée — (Zone de cellule sélectionnée x Fluorescence moyenne des lectures de fond). Comparez la différence de fluorescence cellulaire totale corrigée entre les échantillons et faites un graphique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Quantification du nombre de cellules positives d'images fluorescentes à l'aide d'ImageJ
	<ol>
<li>Comptage manuel des cellules.<ol>
<li>Utilisez ImageJ 'gt; Plugins 'gt; Analyse pour installer le plugin Cell Counter.</li>
			<li>Utilisez le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir les images à analyser. Utilisez Plugins et Analyse pour ouvrir la fenêtre Counter et la fenêtre Résultats. REMARQUE: Le compteur cellulaire ne fonctionne pas sur les piles. Pour compter les piles, plugin Plot Z Axis Profile, puis utilisez image 'gt; Stacks 'gt; Plot Z Axis Profile pour surveiller l'intensité d'un retour sur investissement en mouvement à l'aide d'un outil de suivi des particules. Cet outil peut être manuel ou automatique.</li>
			<li>En cliquant sur l'un des boutons au bas de la fenêtre Counter pour initier le comptage. Cliquez directement sur une cellule/objet à compter jusqu'à la fin.</li>
			<li>Cliquez sur le bouton Résultats dans la fenêtre Compter. Le nombre total de cellules comptées sera indiqué dans la fenêtre Résultats. Enregistrez le journal des résultats sous forme de feuille de calcul et analysez.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Comptage automatisé des cellules.<ol>
<li>Utilisez le Fichier 'gt; Ouvrez pour ouvrir les images à analyser. Convertissez l'image RGB en une image à l'échelle grise avant de procéder.</li>
			<li>Utilisez l'Image 'gt; Ajuster 'gt; Seuil pour sélectionner toutes les zones qui doivent être comptées.</li>
			<li>Utilisez Analyze 'gt; Analyser les particules pour obtenir le nombre de cellules / particules. Définir une plage de la taille de particules valides (par exemple, 100-Infinity) au lieu de la valeur par défaut de 0-Infinity pour compter les cellules/particules dans une plage spécifique. Enregistrez le journal des résultats sous forme de feuille de calcul et analysez. REMARQUE: Pour obtenir d'autres informations de l'image, en plus de la zone, allez à analyser les mesures et définir les mesures et sélectionnez la boîte à côté de l'information nécessaire.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Trinh, L. eA., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+cell+and+molecular+dynamics+of+craniofacial+development%3A+challenges+and+new+opportunities+in+imaging+developmental+tissue+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).</li>
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<li>Oorschot, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+flat%E2%80%90embedding+method+to+prepare+ultrathin+cryosections+from+cultured+cells+in+their+in+situ+orientation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).</li>
</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

Ici nous fournissons un protocole détaillé pour la préparation de la tête de souris et des tissus osseux non décalcifiés, et la cryosection ingation pour l'immunostaining de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, et des marqueurs de signalisation de BMP. Nous détaillons également la stratégie d'obtention de données quantitatives à partir d'images immunofluorescentes. Ces méthodes peuvent également s'appliquer à d'autres tissus avec des modifications appropriées.
Les conditions de ...

Le visage est un élément clé de l'identité humaine, et est composé de plusieurs types de tissus, tels que l'épithélium, muscle, os, cartilage, dent. Ces tissus sont dérivés des trois couches germinales: ectoderm, endoderm, et mesoderm1,2. Pour le bon modelage et le développement des tissus craniofacial, la prolifération cellulaire, la mort et la différenciation doivent être fortement coordonnées et réglées par des voies de signalisation spécifiques, telles que Wnt, Fgf, Hh et Bmp voies3,4 ,5. Les défauts dans la prolifération, la survie ou la différenciation des cellules mèneront aux malformations craniofacial, qui sont parmi les défauts congénitaux les plus fréquents de naissance. Les souris transgéniques sont des outils utiles pour étudier les mécanismes de la morphogénèse craniofaciale et de la pathogénie1,2,3,4,5. Comprendre les changements dans les structures craniofaciales au cours du développement et de la pathogénie aidera à clarifier les principes clés du développement ainsi que les mécanismes des malformations craniofaciales1,2,3 ,4,5.
La coloration de monture entière ou de tissus sectionnés avec des anticorps spécifiques est une technique inestimable pour déterminer la distribution spatiale des protéines d'intérêt 6. Formellement, l'immunostaining de tissu peut compter sur l'immunohistochimie (IHC) ou l'immunofluorescence (IF). Par rapport au produit de réaction opaque produit avec un substrat chromogénique tel que 3,3'-Diaminobenzidine (DAB) par IHC, IF implique l'utilisation de conjugués fluorescents visibles par microscopie fluorescence. Par conséquent, IF peut clairement différencier les cellules positives du bruit de fond, et permet aux images d'être quantitativement analysées et améliorées d'une manière simple par des logiciels tels que ImageJ et Adobe Photoshop7,8. L'approche de coloration de montage entier fonctionne sur de petits blocs de tissu (moins de 5 mm d'épaisseur), qui peuvent fournir des informations tridimensionnelles sur l'emplacement des protéines/antigènes sans avoir besoin de reconstruction des sections9,10 . Cependant, par rapport aux sections de tissu, l'immunostaining de montage entier prend le temps et exige de grands volumes de solutions d'anticorps. Tous les anticorps ne sont pas compatibles avec l'approche de base de la monture entière. En outre, la pénétration incomplète des anticorps entraînera une coloration inégale ou une fausse coloration négative. Ici, nous nous concentrerons sur la détection d'immunofluorescence des protéines/antigènes sur les tissus sectionnés. Pour les tissus durs (par exemple, tête, dent, os long), le dépôt de calcium pendant le développement/pathogénie rend l'échantillon difficile à sectionner et facilement rincé pendant le traitement immunostaining11,12. La plupart des protocoles actuellement disponibles décalciment les tissus durs avant l'intégration pour faciliter la section, ce qui prend du temps et peut détruire la morphologie et les antigènes des échantillons s'ils sont manipulés de façon inappropriée11,12. Pour surmonter les problèmes, nous avons optimisé une approche pour la cryosection des tissus durs sans décalcification, conduisant à une meilleure visualisation de leur morphologie et la distribution des protéines de signalisation.
Le protocole décrit ici est utilisé pour déterminer les changements morphométriques et histologiques dans les tissus craniofacial des souris transgéniques BMP. Plus précisément, le protocole comprend (1) la récolte et la disséquement des tissus crâniens, (2) la section et l'immunostaining des marqueurs expérimentaux (Ki67, pSmad1/5/9) ainsi que la coloration TUNEL, (3) l'imagerie des sections à l'aide du microscope à fluorescence, et enfin (4) l'analyse et la quantification des résultats. Le protocole pour préparer et cryosection tissus durs sans décalcification est également décrit13. Ces méthodes sont optimisées pour les tissus craniofacial. Ils sont également applicables à d'autres tissus de différents âges d'échantillons avec des modifications appropriées.

<table><tbody><tr><td>Ruban adhésif</td><td>Leica</td><td>#39475214</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Antifade Mountant avec DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36931</td><td></td></tr><tr><td>Bovin serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Brand</td><td>12-545-E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1850</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>Olympus</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>In Situ. Kit de détection de la mort cellulaire</td><td>Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Brand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compound</td><td>Fisher Healthcare</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol&nbsp ; tert-octylphényléther</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Triton X-100</td></tr><tr><td>Protéinase K</td><td>Invitrogen</td><td>AM2542</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Ki67 de lapin</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9129</td><td>Lot# :3 ; RRID :AB_2687446</td></tr><tr><td>Lapin anti-pSmad1/5/9</td><td>anticorps Technologie de signalisation cellulaire</td><td>13820</td><td>Lot# :3 ; RRID :AB_2493181</td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>Sigma</td><td>1613859</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>10708976001</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

Tissue Preparation and Immunostaining of Mouse Craniofacial Tissues and Undecalcified Bone

L'immunostaining tissulaire fournit la détection très spécifique et fiable des protéines d'intérêt dans un tissu donné. Ici nous décrivons un protocole complet et simple pour détecter l'expression de protéine pendant la morphogenèse/pathogénie craniofacial utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. Le protocole consiste en la préparation et la cryosection des tissus, l'immunofluorescence indirecte, l'acquisition d'images et la quantification. En outre, une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés pour immunostaining est décrite, utilisant des tissus craniofacial et des os longs comme exemples. Ces méthodes sont essentielles pour déterminer l'expression des protéines et les changements morphologiques/anatomiques dans divers tissus pendant la morphogénèse craniofaciale/pathogénie. Ils sont également applicables à d'autres tissus avec des modifications appropriées. La connaissance de l'histologie et la haute qualité des sections sont essentielles pour tirer des conclusions scientifiques à partir des résultats expérimentaux. Les limites potentielles de cette méthodologie comprennent, sans s'y limiter, la spécificité des anticorps et les difficultés de quantification, qui sont également discutées ici.

Sections embryonnaires de tissu craniofacial Après les étapes ci-dessus, les têtes ont été disséquées du contrôle (P0-Cre) ou mutant (bmpr1a activé de façon constitutive dans les cellules de crête neurale, P0-Cre; caBmpr1a) embryons au jour embryonnaire (E) 16.5 ou 18.5. Après fixation dans 4% PFA pendant 4 h, les échantillons ont été incorporés dans OCT et coronally cryosectionné. Les sections obtenues étaient immunostained avec des anticorps contre ...

Ici, nous présentons un protocole détaillé pour détecter et quantifier des niveaux de protéine pendant la morphogénèse/pathogénie craniofacial par immunostaining utilisant des tissus craniofacial de souris comme exemples. En outre, nous décrivons une méthode pour la préparation et la cryosectioning des tissus durs non décalcifiés des jeunes souris pour immunostaining.

Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

Tissue immunostaining provides highly specific and reliable detection of proteins of interest within a given tissue. Here we describe a complete and ...

Ici, nous présentons notre protocole simple pour la détection de l’immunofluorescence sur les protéines sur les matériaux sectionnés. Cette méthode ne nécessite pas de récupération d’antigènes. Nous utiliserons des têtes de souris, y compris des tissus durs non décalcifiés.Le principal avantage de cette technique est de sauter la récupération des antigènes et la décalcification des tissus durs. Ceux-ci conduisent à une bonne qualité des résultats d’immunostaining. Cette méthode permet également d’économiser du temps et du travail.Cette méthode s’applique également à d’autres tissus avec des modifications appropriées. Pour faire de belles sections à partir de tissus non décalcifiés, disséquer votre tissu cible plus loin pour couper les tissus environnants, et si nécessaire traiter les échantillons avec 10%EDTA à quatre degrés Celsius pendant deux jours avant la cryoprotection. La démonstration visuelle fournit une explication détaillée et claire de la procédure de cette méthode.Pour commencer, préparez un plat de 10 centimètres et plusieurs plats de 3,5 centimètres contenant du PBS et une assiette de culture de 12 puits contenant deux millilitres de 4 % de PFA en PBS dans chaque puits pour chaque souris enceinte, et placez-les tous sur la glace. Pour disséquer les embryons des souris enceintes, saisir la peau au-dessous du centre du ventre d’une souris euthanasiée avec des forceps, couper à travers la peau seulement, puis tirer doucement sur la peau pour la séparer de la paroi musculaire abdominale sous-jacente. Suivant la même ligne de l’incision cutanée, couper dans la cavité abdominale.Retirer l’utérus contenant une chaîne d’embryons. Ensuite, retirez les embryons en coupant doucement la paroi utérine, ce qui enlèvera les tissus extraembryoniques tels que le sac jaune et l’amnion. Couper et isoler la tête de chaque embryon, et avec des forceps transférer chaque tête dans un puits séparé d’une plaque de 12 puits contenant 4%PFA.Incuber à quatre degrés Celsius pendant quatre heures pour réparer. Rincer les têtes en PBS à quatre degrés Celsius avec des secousses douces pendant 12 heures. Pour cryoprotect les têtes, transférez-les à l’aide de forceps dans une nouvelle plaque de 12 puits contenant deux millilitres de saccharose de 30% en PBS.Incuber avec une légère agitation à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les têtes descendent au fond du plat. Pour intégrer les têtes cryoprotected, transférez-les dans un moule contenant le composé optimal de température de coupe, et équilibrez pendant plusieurs minutes. À l’aide de forceps, ajuster l’emplacement et la direction des échantillons de sorte que le côté taillé des échantillons fait face au fond du moule d’intégration.Ensuite, placez le moule sur de la glace sèche pour congeler et conservez-le dans un sac en plastique à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la cryosection. Pour le tissu postnatal, après avoir enlevé la peau et les tissus adipeux d’une souris euthanasiée, de trois semaines à trois mois, couper et isoler la tête et enlever la mandibule. Ensuite, fixez et cryoprotect la tête comme fait avec des têtes d’embryon.Intégrir dans 8% de gélatine de la même manière que les têtes d’embryon en OCT, et garder les Cryomolds dans un sac en plastique à moins 80 degrés Celsius jusqu’à cryosection. Réglez la température appropriée du cryostat. Placer les échantillons dans la chambre cryostat pendant environ 30 minutes pour les équilibrer à la température du cryostat.Retirez le bloc avec l’échantillon du Cryomold et montez-le avec une goutte d’OCT sur le mandrin du spécimen et congelez-le, en vous assurant de garder le côté coupé de l’échantillon le plus éloigné du mandrin et face à l’opérateur. Chargez le mandrin monté sur le support de l’objet cryostat. Ajustez le support de la lame de sorte que l’angle de la lame soit de trois à cinq degrés par rapport à l’échantillon.Recueillir des sections de 10 micromètres sur des diapositives de microscope enduites. Laissez les sections à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches, puis conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer avec la coloration, sortez les toboggans de moins 80 degrés Celsius, et gardez-les à température ambiante pendant une heure pour sécher à l’air les sections.Rincez les glissières en 0,1 %PBST trois fois pendant cinq minutes chacune pour laver l’OCT et perméabiliser les sections. Ajouter 200 microlitres de solution de blocage à chaque glissière et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirez la solution de blocage sans rincer la lame.Ajouter 100 microlitres d’anticorps primaires dilués dans la solution de blocage à chaque glissière, et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Rincer les diapositives avec du PBS trois fois pendant 10 minutes chacune à température ambiante. Ajouter 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage, et incuber pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.Rincer en PBS trois fois pendant 10 minutes chacun à température ambiante, toujours à l’abri de la lumière. Pour monter les diapositives, ajoutez deux gouttes de milieu anti-fondu avec dapi sur chaque diapositive, couvrez avec un coverslip, et stockez à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que prêt à l’image. Les os frontaux des embryons de contrôle étaient positifs pour pSmad1/5/9, les facteurs de signalisation en aval de BMP, et Ki67, un marqueur de prolifération cellulaire.Dans les embryons mutants BMPR1A spécifiques à la crête neurale et activés de façon constitutive, cependant, les niveaux de pSmad1/5/9 ont été augmentés tandis que les niveaux de Ki67 ont été diminués. En outre, plus de cellules apoptotiques ont été observées dans les os frontaux des embryons mutants que ceux des embryons témoins. Les cryosections coronaires des têtes gélatine-incorporées montrent clairement le signal de GFP et le signal de DP d’une cassette de tdTomato dans l’os nasal et les tissus nasaux, démontrant que la gélatine n’interfère pas avec des signaux fluorescents.Lorsque ces sections ont été immunotachées pour SOX9 ou Astérix et E11/Podoplanine, des sections de bonne qualité ont été obtenues à partir de la plupart des tissus durs de trois semaines. D’autre part, avec des échantillons de trois mois, des sections de bonne qualité n’ont été obtenues que dans certains tissus durs, y compris les compartiments trabecular du fémur, les tissus nasaux, et le crâne, y compris la suture nasale-prémaxilla et les os environnants de la tête. Des cellules SOX9-positives ont été détectées spécifiquement dans les chondrocytes de la plaque de croissance et de l’articulation du fémur et du septum nasal.Dans l’incisive de trois semaines, SOX9 a été détecté dans les cellules mésenchymales. Les résultats de double coloration d’Astérix et d’E11 montrent qu’Astérix a été détecté dans les ostéoblastes, tandis que l’E11 a été détecté dans les ostéocytes des os du fémur et de la tête. Dans l’incisive de trois semaines, Astérix était positif dans les odontoblastes, tandis que E11 était positif dans les cellules mésenchymales de follicule.S’il vous plaît ne pas surfixer les échantillons avec 4%PFA. Pour la section des tissus durs non décalcifiés dans la gélatine, la meilleure température est moins 25 degrés Celsius et plus bas. Après cette procédure, les niveaux de fluorescence peuvent être quantifiés comme décrit dans notre protocole.Ces mesures fourniront des données informatives pour montrer la différence du niveau relatif de protéines entre les différents groupes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la double ou triple coloration pour obtenir des modèles de co-expression de différentes protéines. 4%PFA est dangereux.Il peut causer des allergies cutanées, des lésions oculaires graves, des dommages aux organes ou un cancer. S’il vous plaît utiliser de l’équipement de protection individuelle, et laver la peau à fond après la manipulation.

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