Préparation des tissus et immunostaining des tissus craniofacial de souris et de l'os non décalcifié

Ici, nous présentons notre protocole simple pour la détection de l’immunofluorescence sur les protéines sur les matériaux sectionnés. Cette méthode ne nécessite pas de récupération d’antigènes. Nous utiliserons des têtes de souris, y compris des tissus durs non décalcifiés.

Le principal avantage de cette technique est de sauter la récupération des antigènes et la décalcification des tissus durs. Ceux-ci conduisent à une bonne qualité des résultats d’immunostaining. Cette méthode permet également d’économiser du temps et du travail.

Cette méthode s’applique également à d’autres tissus avec des modifications appropriées. Pour faire de belles sections à partir de tissus non décalcifiés, disséquer votre tissu cible plus loin pour couper les tissus environnants, et si nécessaire traiter les échantillons avec 10%EDTA à quatre degrés Celsius pendant deux jours avant la cryoprotection. La démonstration visuelle fournit une explication détaillée et claire de la procédure de cette méthode.

Pour commencer, préparez un plat de 10 centimètres et plusieurs plats de 3,5 centimètres contenant du PBS et une assiette de culture de 12 puits contenant deux millilitres de 4 % de PFA en PBS dans chaque puits pour chaque souris enceinte, et placez-les tous sur la glace. Pour disséquer les embryons des souris enceintes, saisir la peau au-dessous du centre du ventre d’une souris euthanasiée avec des forceps, couper à travers la peau seulement, puis tirer doucement sur la peau pour la séparer de la paroi musculaire abdominale sous-jacente. Suivant la même ligne de l’incision cutanée, couper dans la cavité abdominale.

Retirer l’utérus contenant une chaîne d’embryons. Ensuite, retirez les embryons en coupant doucement la paroi utérine, ce qui enlèvera les tissus extraembryoniques tels que le sac jaune et l’amnion. Couper et isoler la tête de chaque embryon, et avec des forceps transférer chaque tête dans un puits séparé d’une plaque de 12 puits contenant 4%PFA.

Incuber à quatre degrés Celsius pendant quatre heures pour réparer. Rincer les têtes en PBS à quatre degrés Celsius avec des secousses douces pendant 12 heures. Pour cryoprotect les têtes, transférez-les à l’aide de forceps dans une nouvelle plaque de 12 puits contenant deux millilitres de saccharose de 30% en PBS.

Incuber avec une légère agitation à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les têtes descendent au fond du plat. Pour intégrer les têtes cryoprotected, transférez-les dans un moule contenant le composé optimal de température de coupe, et équilibrez pendant plusieurs minutes. À l’aide de forceps, ajuster l’emplacement et la direction des échantillons de sorte que le côté taillé des échantillons fait face au fond du moule d’intégration.

Ensuite, placez le moule sur de la glace sèche pour congeler et conservez-le dans un sac en plastique à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour la cryosection. Pour le tissu postnatal, après avoir enlevé la peau et les tissus adipeux d’une souris euthanasiée, de trois semaines à trois mois, couper et isoler la tête et enlever la mandibule. Ensuite, fixez et cryoprotect la tête comme fait avec des têtes d’embryon.

Intégrir dans 8% de gélatine de la même manière que les têtes d’embryon en OCT, et garder les Cryomolds dans un sac en plastique à moins 80 degrés Celsius jusqu’à cryosection. Réglez la température appropriée du cryostat. Placer les échantillons dans la chambre cryostat pendant environ 30 minutes pour les équilibrer à la température du cryostat.

Retirez le bloc avec l’échantillon du Cryomold et montez-le avec une goutte d’OCT sur le mandrin du spécimen et congelez-le, en vous assurant de garder le côté coupé de l’échantillon le plus éloigné du mandrin et face à l’opérateur. Chargez le mandrin monté sur le support de l’objet cryostat. Ajustez le support de la lame de sorte que l’angle de la lame soit de trois à cinq degrés par rapport à l’échantillon.

Recueillir des sections de 10 micromètres sur des diapositives de microscope enduites. Laissez les sections à température ambiante jusqu’à ce qu’elles soient complètement sèches, puis conservez-les à moins 80 degrés Celsius. Pour commencer avec la coloration, sortez les toboggans de moins 80 degrés Celsius, et gardez-les à température ambiante pendant une heure pour sécher à l’air les sections.

Rincez les glissières en 0,1 %PBST trois fois pendant cinq minutes chacune pour laver l’OCT et perméabiliser les sections. Ajouter 200 microlitres de solution de blocage à chaque glissière et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, retirez la solution de blocage sans rincer la lame.

Ajouter 100 microlitres d’anticorps primaires dilués dans la solution de blocage à chaque glissière, et incuber pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Rincer les diapositives avec du PBS trois fois pendant 10 minutes chacune à température ambiante. Ajouter 100 microlitres d’anticorps secondaires dilués dans la solution de blocage, et incuber pendant une heure à température ambiante, à l’abri de la lumière.

Rincer en PBS trois fois pendant 10 minutes chacun à température ambiante, toujours à l’abri de la lumière. Pour monter les diapositives, ajoutez deux gouttes de milieu anti-fondu avec dapi sur chaque diapositive, couvrez avec un coverslip, et stockez à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que prêt à l’image. Les os frontaux des embryons de contrôle étaient positifs pour pSmad1/5/9, les facteurs de signalisation en aval de BMP, et Ki67, un marqueur de prolifération cellulaire.

Dans les embryons mutants BMPR1A spécifiques à la crête neurale et activés de façon constitutive, cependant, les niveaux de pSmad1/5/9 ont été augmentés tandis que les niveaux de Ki67 ont été diminués. En outre, plus de cellules apoptotiques ont été observées dans les os frontaux des embryons mutants que ceux des embryons témoins. Les cryosections coronaires des têtes gélatine-incorporées montrent clairement le signal de GFP et le signal de DP d’une cassette de tdTomato dans l’os nasal et les tissus nasaux, démontrant que la gélatine n’interfère pas avec des signaux fluorescents.

Lorsque ces sections ont été immunotachées pour SOX9 ou Astérix et E11/Podoplanine, des sections de bonne qualité ont été obtenues à partir de la plupart des tissus durs de trois semaines. D’autre part, avec des échantillons de trois mois, des sections de bonne qualité n’ont été obtenues que dans certains tissus durs, y compris les compartiments trabecular du fémur, les tissus nasaux, et le crâne, y compris la suture nasale-prémaxilla et les os environnants de la tête. Des cellules SOX9-positives ont été détectées spécifiquement dans les chondrocytes de la plaque de croissance et de l’articulation du fémur et du septum nasal.

Dans l’incisive de trois semaines, SOX9 a été détecté dans les cellules mésenchymales. Les résultats de double coloration d’Astérix et d’E11 montrent qu’Astérix a été détecté dans les ostéoblastes, tandis que l’E11 a été détecté dans les ostéocytes des os du fémur et de la tête. Dans l’incisive de trois semaines, Astérix était positif dans les odontoblastes, tandis que E11 était positif dans les cellules mésenchymales de follicule.

S’il vous plaît ne pas surfixer les échantillons avec 4%PFA. Pour la section des tissus durs non décalcifiés dans la gélatine, la meilleure température est moins 25 degrés Celsius et plus bas. Après cette procédure, les niveaux de fluorescence peuvent être quantifiés comme décrit dans notre protocole.

Ces mesures fourniront des données informatives pour montrer la différence du niveau relatif de protéines entre les différents groupes. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à la double ou triple coloration pour obtenir des modèles de co-expression de différentes protéines. 4%PFA est dangereux.

Il peut causer des allergies cutanées, des lésions oculaires graves, des dommages aux organes ou un cancer. S’il vous plaît utiliser de l’équipement de protection individuelle, et laver la peau à fond après la manipulation.