Name: Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Découvrez une méthode d'hybridation in situ simplifiée pour visualiser l'expression génique chez les embryons d'Astyanax mexicanus avec un bruit de fond minimal. Ce protocole reproductible facilite les études en biologie du développement et en génétique évolutive.

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Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire brut des commentaires utiles sur ce manuscrit. Nous tenons à souligner quatre lycéens qui utilise ce protocole au cours de stages d’été en 2017 et 2018, dont Christine Cao, Michael Warden, Aki Li et David Nwankwo. HL était soutenue par une bourse de recherche de souches de biologie UC pendant l’été de 2017. Ce travail a été soutenu par des subventions de la National Science Foundation (DEB-1457630 de JBG) et le National Institutes of Dental and Craniofacial Research (NIH ; DE025033 à JBG).

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Cincinnati (protocole n° 10-01-21-01).
1. la fixation
<ol><li>Isoler le nombre désiré d’Astyanax mexicanus embryons provenant d’un réservoir d’élevage et difficulté ~ 50 embryons à la fois. Si les embryons sont grandes et anciennes, il peut être nécessaire de fixer les 25 à la fois pour assurer la fixation même.</li>
	<li>Selon l’âge de l’embryon, utiliser la méthode IACUC approuvée de l’anesthésie. Pour les plus vieux embryons avec le fonctionnement du système nerveux, sacrifier les embryons par surdosage anesthésique. Par conséquent, placez les embryons dans une solution d’environ 1 % de tricaïne (tamponnée à pH 7,4) pour minimiser la douleur et l’inconfort pour l’organisme.</li>
	<li>Une fois que les embryons ne répondent pas au toucher, remplacer l’eau du système contenant tricaïne et ajouter environ 1 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4).</li>
	<li>Enlever la solution de PBS et ajouter 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Difficulté des embryons pendant la nuit à 4 ° C. Attention : PFA est dangereux (c.-à-d. il est inflammable et est une peau et un irritant pulmonaire), manipuler avec précaution.</li>
</ol>2. la déshydratation
<ol><li>Pour déshydrater les embryons, supprimer la solution de fixation et rincer avec 1 mL de PBS. Placer les flacons contenant des embryons à un angle (entre 30° et 45°), sur un agitateur-secoueur pendant le rinçage. Continuer à laver les embryons à deux reprises, 5 min / cycle de lavage.</li>
	<li>Si des embryons ont toujours une chorion, placer tous les 50 embryons dans un 100 mm x 25 mm boîte de Pétri et isoler soigneusement des chorions à l’aide de deux paires de pinces d’horloger (p. ex., pinces à #5) sous un microscope. NOTE : Pendant les étapes décrites ci-dessous et pour le reste du protocole, retirer soigneusement tout le liquide de l’étape précédente à l’aide de nettoyer, de pipettes de verre Pasteur avant d’ajouter la solution suivante</li>
	<li>Déshydrater les embryons dans une série de plus en plus concentrés lavages de méthanol (MeOH) décrites ci-dessous. Les dilutions sont basées sur un volume total de 1 mL avec 500 µL de solution dans chaque flacon de verre de 4 mL. Exécutez toutes les étapes de déshydratation à la température ambiante (RT) sur agitateur-secoueur.<ol>
<li>Retirez soigneusement la solution de PBS. Ajouter une solution de MeOH de 25 % (250 µL de MeOH) + 750 µL de PBS. Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution de MeOH de 25 %. Ajouter une solution de MeOH de 50 % (500 µL de MeOH) + 500 µL de PBS. Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution de MeOH de 50 %. Ajouter une solution de MeOH de 75 % (750 µL de MeOH) + 250 µL de PBS. Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 minutes.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution de MeOH de 75 %. Ajouter une solution de MeOH de 100 % (1 mL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min. répéter cette étape 3 fois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À ce stade, conservation des embryons déshydratés, selon les besoins, dans leurs flacons en verre à-20 ° C (long terme). Vous pouvez également passer directement au jour 1 du protocole.</li>
</ol>3. jour 1 : réhydratation
<ol><li>Obtenir des embryons déshydratés du congélateur-20 ° C (ou passez directement à l’étape 2.5).</li>
	<li>Trier les embryons à l’aide d’une pipette Pasteur. On peut trier sur la base de morphotype (c.-à-d., la cave et/ou la surface), et le nombre de gènes évalués dans chaque expérience. Il n’y a généralement pas plus de 12 embryons par fiole une fois triés. Afin de maintenir l’organisation, utilisez ruban couleur lab pour désigner des flacons et des pipettes pour chaque gène. Embryons resteront dans le même flacon tout au long de l’ensemble du protocole. NOTE : Place l’embout de la pipette Pasteur dans 100 % EtOH à stériliser entre utilise.</li>
	<li>Définissez un secousse bain-marie à 70 ° C à utiliser dans une étape ultérieure. Avec précaution, faire ressortir le MeOH dans des flacons d’embryons triées et remplacer avec 500 µL de nouveau 100 % MeOH. Lavage brièvement (~ 1 min) sur l’agitateur-secoueur.</li>
	<li>Réhydrater les embryons dans une concentration croissante de 1 x PBS avec Tween 20 (PBT, voir ci-dessous) sur l’agitateur-secoueur. Les dilutions sont basées sur un volume de dilution finale de 1 mL avec 500 µL entrer dans chaque flacon.<ol>
<li>Ajouter une solution PBT 25 % (250 µL de PBT, 750 µL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution PBT 25 %. Ajouter une solution à 50 % PBT (500 µL de PBT, 500 µL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution à 50 % PBT. Ajouter une solution PBT 75 % (750 µL de PBT, 250 µL de MeOH). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min.</li>
		<li>Retirez soigneusement la solution PBT de 75 %. Ajouter une solution PBT 100 % (1 mL de PBT). Secouer doucement sur un agitateur-secoueur pendant 5 min. répéter cette étape 3 fois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. jour 1 : Digestion et fixation
<ol><li>Préparer une protéinase solution K (PK) en ajoutant 1 µL de PK (20 mg/mL) à 2 mL de PBT.</li>
	<li>En prévision des étapes subséquentes, obtenir des aliquotes congelés de tampons d’hybridation (Hyb - et Hyb + ; voir 2 fichier supplémentaire et complémentaire fichier 3) et PFA de stockage-20 ° C.<ol>
<li>Permettre la PFA décongeler à température ambiante.</li>
		<li>Placez des parties aliquotes de Hyb - et Hyb + dans un bain d’eau rotatif de 70 ° C. Placez tous les réactifs et les flacons à l’intérieur d’un petit « joint » avec un fond en filet, à l’intérieur de l’appareil flottant de bain l’eau. Cette mesure simple ajout et suppression des tubes et flacons du bain-marie tournante 70 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter doucement solution PK à la vial(s) des embryons assurant tous les tissus sont complètement recouvertes de solution. Digérer les embryons pendant environ 12 min dans la solution de travail PK sur l’agitateur-secoueur. Remarque : La durée de la digestion peut varier par l’enquêteur pour assurer des résultats optimaux.</li>
	<li>Retirer doucement la solution PK et brièvement inonder la cuvette de PBT pour diluer tout restant PK.</li>
	<li>Retirer la solution PBT et remplacer avec 500 µL de nouveau PBT. Laisser la solution se rincer sur l’agitateur-secoueur pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer les PBT et les remplacer par 500 µL de décongelés 4 % PFA. Permettre les embryons à incuber pendant 20 min sur l’agitateur-secoueur à température ambiante.</li>
	<li>Retirer les 4 % PFA et brièvement inonder la cuvette de PBT pour diluer tout PFA restant. Retirer le PBT et remplacez par 500 µL de PBT fraîche. Permettre aux embryons de rincer pendant 5 min sur l’agitateur-secoueur. Répétez cette opération 4 fois plus.</li>
</ol>5. jour 1 : Prehybridization
<ol><li>Place 500 µL de préchauffé Hyb-solution dans le flacon. Placez soigneusement le flacon dans les 70 ° C eau bain (à l’intérieur des joints) sans agitation, pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer la solution Hyb et inonder le flacon avec 500 µL de solution Hyb + préchauffée. Remettre le flacon dans le bain d’eau de 70 ° C sous agitation (40 t/mn). Incuber pendant ou 4 h, ou toute la nuit. Remarque : Un 4 h d’incubation permet d’obtenir un protocole complet sur place qui va durer pendant 4 jours au total. Ici, cette étape est présentée comme une incubation durant la nuit, ce qui produira un protocole durant 5 jours au total.</li>
</ol>6. jour 2 : hybridation
<ol><li>Placer une aliquote de Hyb + du congélateur-20 ° C en le secouant bain d’eau chaude pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer les Hyb + à partir du flacon et remplacer avec 500 µL de Hyb pré chauffé +. Pour cette solution, ajouter avec précaution 2 µL de sonde d’ARN dans chaque flacon. Doucement agiter le flacon pour assurer une répartition égale de la sonde.</li>
	<li>Incubez la solution Hyb + (avec sonde supplémentaire) dans le bain d’eau chaude 70 ° C durant la nuit et en agitant à 40 tr/min. Remarque : On peut re-utiliser solution Hyb + (avec sonde). Pour ce faire, prendre Hyb + avec sonde de la première exécution depuis le congélateur-20 ° C et les place dans un bain d’eau chaude pendant 5 min. remplacer Hyb + dès le jour 1 du protocole avec Hyb + avec sonde et laisser incuber pendant la nuit dans le bain d’eau chaude.</li>
</ol>7. jour 3 : Préparation de la Solution
<ol><li>Préparer les tubes de microcentrifuge étiquetés Hyb + avec la sonde d’ARN « gène d’intérêt ». Préparer la série de dilutions qui seront utilisées au cours de la journée 3.<ol>
<li>À partir de 6 tubes distincts, préparer la série de dilutions de Hyb - et citrate de sodium salin (SSC, 0 à 100 %) dans un volume de 1 mL et le lieu dans les 70 ° C secouant bainmarie : Tube 1 = 100 % Hyb-(1 mL de Hyb-) : Tube 2 = 25 % 2 x SSC (250 µL de 2 x SSC, 750 µL de Hyb-) ; Tube de SSC 2 x 3 = 50 % (500 µL de SSC 2 x, 500 µL de Hyb-) ; Tube de SSC 2 x 4 = 75 % (750 µL de SSC 2 x, 250 µL de Hyb-) ; Tube de SSC de 2 x 5 = 100 % (1 mL de SSC 2 x) ; Tube de 6 = 100 % x 0,2 SSC (2 mL de 0,2 x SSC). NOTE : Être vigilant de la concentration de la CSE, car il change de 2 x 0,2 x.</li>
		<li>À l’aide de 4 tubes de séparer, préparer la série de dilutions de PBT et SSC dans un volume de 1 mL et placez au RT : Tube 1 = 25 % PBT (250 µL de PBT, 750 µL de 0,2 x SSC) ; Tube 2 = 50 % PBT (500 µL de PBT, 500 µL de SSC x 0,2) ; Tube 3 = 75 % PBT (750 µL de PBT, 250 µL de SSC x 0,2) ; Tube 4 = 100 % PBT (1mL de PBT).</li>
		<li>Préparer un tube avec 2 mL de tampon de l’acide maléique contenant la solution de travail de Tween 20 (MABT).</li>
		<li>Préparer deux tubes coniques 15 mL de solution de blocage. Dans chaque tube, ajouter 0,2 g de réactif de blocage à 10 mL de MABT (voir 4 de fichier supplémentaire). Placer les deux tubes sur un mélangeur oscillant (ou agitateur-secoueur) jusqu'à complètement dissous dans la solution (jusqu'à 3 h).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. jour 3 : Sonde removal
<ol><li>Retirer la solution Hyb + (avec sonde) avec une pipette Pasteur en verre et placez-le dans une solution stérile, étiqueté tube microcentrifuge. Conserver ce tube dans le congélateur-20 ° C pour une utilisation ultérieure (si sonde-étiquetage est réussie).</li>
	<li>Ajouter 500 µL des SSC/Hyb-dilutions chauds (indiqué ci-dessous) avec précaution. Incuber dans chacune des solutions suivantes pendant 10 min chaque dans le bain d’eau secouer de 70 ° C.<ol>
<li>Incuber dans l’ordre avec 100 % Hyb-(1 mL de Hyb-), 25 % 2 x SSC (250 µL de 2 x SSC, 750 µL de Hyb-), 50 % 2 x SSC (500 µL de 2 x SSC, 500 µL de Hyb-), 75 % 2 x SSC (750 µL de 2 x SSC, 250 µL de Hyb-), 100 % 2 x SSC (1 mL de 2 x SSC) , 100 % 0,2 x SSC (2 mL de 0,2 x SSC).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suite à la dernière étape, incuber dans chacune des solutions suivantes pour chaque 10 min. Tous les incubations suivantes ont lieu à ta sur l’agitateur-secoueur : 25 % PBT (250 µL de PBT, 750 µL de 0,2 x SSC), 50 % PBT (500 µL de PBT, 500 µL de 0,2 x SSC), 75 % PBT (750 µL de PBT, 250 µL de 0,2 x SSC) , 100 % PBT (1 mL de PBT).</li>
	<li>Après une incubation de 10 min, enlever le 100 % PBT et ajouter 500 µL de MABT dans chaque flacon. Répétez cette étape deux fois pendant 5 min.</li>
</ol>9. jour 3 : blocage
<ol><li>MABT retirer de chaque flacon et inondations avec solution prémélangée de saturation d’un des tubes (préparés à l’étape 7.1.4). Placer le flacon dans un mélangeur oscillant pendant environ 4 heures à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 2 µL d’Anti-DIG-AP Fab des fragments de la deuxième fiole de 10 mL de solution (préparée à l’étape 7.1.4) et brièvement vortex de blocage.</li>
	<li>Remplir chaque flacon presque complètement avec bloquant la solution (~ 5 mL) et placer le mélangeur oscillant du jour au lendemain au réfrigérateur à 4 ° C.</li>
</ol>10. jour 4 : MABT rinçages
<ol><li>Préparer un flacon de stock de 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans MABT (ajouter 100 µL de NGS à 900 µL de MABT).</li>
	<li>Retirer la solution de saturation dans chaque flacon et ajouter 500 µL du mélange NGS/MABT dans chaque flacon. Laissez les embryons à incuber pendant 25 min à ta sur l’agitateur-secoueur.</li>
	<li>Remplacer le mélange NGS/MABT avec 500 µL de 100 % MABT. Incuber 30 min à ta sur l’agitateur-secoueur. Effectuez ce rinçage 11 fois plus tout au long de la journée toutes les 30 minutes.</li>
	<li>Remplir le flacon avec 100 % MABT et la place sur une table de mixage oscillant toute la nuit dans une chambre de réfrigérateur ou en personne à 4 ° C.</li>
</ol>11. jour 5 : Sonde de visualisation
<ol><li>Préparer une portion de 50 mL de tampon de la phosphatase alcaline (PA) (voir 5 de fichier supplémentaire). Combinez ce qui suit dans un tube conique de 50 mL, enveloppé dans du papier d’aluminium pour limiter l’exposition à la lumière : 5 mL de 1 M Tris (pH 9,5), 5 mL de 50 mM MgCl2, 5 mL de 1 % Tween 20, 5 mL de 1 NaCl M, 30 mL de ddH2O.</li>
	<li>Supprimez MABT et remplacez-les par 1 mL de tampon de AP (tube enveloppé dans du papier). Laissez-le se laver pendant 5 min. Faire cela deux fois pour assurer le retrait complet de MABT.</li>
	<li>Retirer le tampon de l’AP et les remplacer par 1 mL de tampon d’AP avec 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate 3,5 μL (CBPI) et 4.5 μL de nitro bleu de tétrazolium (NBT). Remplacez par AP tampon/NBT/BCIP fraîchement préparé une fois toutes les heures jusqu'à ce que la réaction est terminée. Suivre de près, vérifiant toutes les 15 min, afin de permettre la réaction de coloration se dérouler jusqu'à ce que le niveau de coloration désiré a été atteint. Si le précipité commence à se former, remplacer la solution plus tôt.</li>
	<li>Arrêter la réaction de coloration en rinçant les embryons dans la mémoire tampon AP 100 % fraîche (sans NBT/BCIP) pour 5 min. continuer rinçages en PBT jusqu'à ce qu’un niveau optimal de signal (avec des quantités minimes de la coloration de fond) est atteints. Continuer à rincer des spécimens avec l’augmentation des dilutions de PBT dans un tampon AP comme suit : 25 % PBT (250 μL de PBT, 750 μL de tampon de l’AP), rincer pendant 5 min ; 50 % PBT (500 μL de PBT, 500 μL de tampon de l’AP), rincer pendant 5 min ; 75 % PBT (750 μL de PBT, 250 μL de tampon de l’AP), rincer pendant 5 min.</li>
	<li>Rincer les embryons dans environ 5 mL de 100 % PBT sur oscillant mélangeur jusqu'à désiré la coloration de fond minimal est atteint. Commuter dehors avec PBT fraîche plusieurs fois. Cela pourrait prendre jusqu'à plusieurs jours.</li>
	<li>Lorsque le rinçage est complets, laver les embryons dans 500 μl de PBS stérile sur un agitateur-secoueur. Effectuez ce rincer deux fois pendant 5 min. Après lavages de PBS, fixer les spécimens dans 500 μL de 4 % PFA pendant 1 h à RT sur un secoueur. Alternativement, difficulté à passer la nuit dans 1 mL de 4 % PFA au réfrigérateur à 4 ° C.</li>
	<li>Remplacer le fixateur avec frais, PBS stérile. Effectuer ce rinçage au moins deux fois pendant 5 min Place les embryons dans ~ 4 mL de PBS stérile de 100 % et à long terme à 4 ° C.</li>
</ol>12. imagerie
<ol><li>Composent une plaque d’imagerie dans une boîte de pétri à l’aide de 3 % d’agarose et tampon TAE. Remarque : Les quantités dépendent combien de plaques sont nécessaires. Plaques peuvent être réutilisées plusieurs fois. Il est recommandé de place un moule rectangulaire peu profond dans la boîte de pétri tandis que le gel est de refroidissement afin de créer une dépression pour contenant les embryons sur la plaque.</li>
	<li>Placez les embryons sur la plaque dans du PBS. Remarque : Il est préférable de verser doucement sur la plaque au lieu de pipetage les sortir car il a été constaté qu’ils seront en tiendra à l’intérieur des pipettes en plastique, les embryons.</li>
	<li>Utiliser la microscopie photonique afin de visualiser chaque embryon. Utiliser une sonde émoussée à manœuvrer les embryons à la position désirée.</li>
	<li>Prendre une image lorsque l’embryon est dans la position souhaitée. Notez qu’il est important de prendre des images d’embryons dans quelques semaines de coloration terminée pour éviter une dégradation potentielle de tache.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

En raison de la vulnérabilité de l’ARN à la dégradation, une des étapes plus critiques dans le protocole porte sur la synthèse stérile de la sonde d’ARN. Toutefois, si une sonde est générée avec soin et donne de bons résultats, il peut être réutilisé dans des réactions subséquentes de coloration. Une seconde étape cruciale est la production minutieuse de tous les réactifs utilisés tout au long du protocole. Ce protocole implique plusieurs jours et nombreuses petites étapes, il est essentiel que tous les réactifs sont ave...

Hybridation in situ est une méthode commune pour la coloration des tissus fixés pour visualiser gene expression patterns1. Cette technique a été réalisée pour années dans d’autres traditionnels2 et systèmes de modèles non traditionnels3 , pour une variété d’études biologiques. Cependant, plusieurs étapes et les réactifs sont nécessaires pour réaliser avec succès cette procédure. Pour les enquêteurs qui n’ont jamais fait cette technique, il peut être intimidant en raison des nombreuses étapes d’amorcer le processus. En outre, la nature longue de cette procédure se prête à des fautes techniques, qui peuvent être difficile à résoudre.
L’objectif général du présent article est de présenter une méthode simple et directe qui rendra cette technique d’hybridation accessible à un large public. Afin de réduire l’introduction d’erreurs, nous présentons une approche simple qui donne expression de gène de haute qualité coloration et minimise le signal de fond non spécifique. Cette procédure est similaire aux autres approches développées dans les systèmes de modèle traditionnel, comme le Danio rerio4. Ici, nous visons à faciliter l’application minutieuse de chaque étape à l’aide d’une liste téléchargeable (fichier supplémentaire 1), à promouvoir l’application minutieuse du protocole. La raison d’être pour ce faire est de faciliter l’organisation à travers les nombreuses étapes dans cette procédure. Cet article est approprié pour les chercheurs intéressés dans l’accomplissement entier-montez l’hybridation in situ dans le développement des embryons, mais n’ont pas encore effectué la procédure. L’avantage de l’approche choisie pour Astyanax chercheurs est qu’il a été testé et prouvé en agassizii et morphes de poissons de surface, ce qui facilite les analyses comparatives d’expression. La méthode présentée peut être utilisée par des chercheurs en études sur les autres systèmes et Astyanax .

<table><tbody><tr><td>Pipette sérologique 10 mL</td><td>VWR</td><td>89130-888</td><td></td></tr><tr><td>Unité de filtration 1000 mL</td><td>VWR</td><td>89220-698</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Conique</td><td>VWR-Greiner</td><td>82050-278</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Pipette sérologique</td><td>VWR</td><td>89130-890</td><td></td></tr><tr><td>250 mL Unité de filtration</td><td>VWR</td><td>89220-694</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipette sérologique</td><td>VWR</td><td>89130-886</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Conique</td><td>VWR-Falcon</td><td>21008-940</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Unité de filtration</td><td>VWR</td><td>89220-696</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Digoxigénine-AP, Fab fragments</td><td>Sigma-Roche</td><td>11093274910</td><td></td></tr><tr><td>BCIP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8503-1G</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Solution bloquante</td><td>Sigma-Roche</td><td>11 096 176 001</td><td>50 g</td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A104-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Kit de marquage de l’ARN DIG (SP6/T7)</td><td>Sigma-Roche</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes</td><td>VWR</td><td>20170-577</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher-Decon</td><td>04-355-223</td><td>1 Gal</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17899</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Flacons en verre</td><td>VWR</td><td>66011-041</td><td>1 Pipettes en</td></tr><tr><td>verre</td> Dr <td>Fisher Scientific</td><td>13-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Thermal-ScientificPharmco-AAPER</td><td>284000ACS</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma</td><td>H3393-25KU</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium cristallin</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Acide maléique</td><td>Sigma</td><td>M0375-100g</td><td>100g</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td>4L</td></tr><tr><td>Eau de qualité moléculaire (sans RNase)</td><td>VWR</td><td>7732-18-5</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-3</td><td>3 kg</td></tr><tr><td>Granulés de NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318-500</td><td>500 g</td></tr><tr><td>NBT Poudre de substrat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34035</td><td>1 g</td></tr><tr><td>Sérum de chèvre normal</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>31873</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur à Nutating</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma</td><td>158127-500g</td><td>500 g</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399-20</td><td>20L</td></tr><tr><td>Proteinase K (200mg/10ml)</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Pipettes en plastique</td><td>VWR-Samco</td><td>14670-147</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Sigma</td><td>R2020-250mL</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>Bain-marie agitant 12 L</td><td>VWR</td><td>10128-126</td><td>12 L</td></tr><tr><td>Agitateur analogique standard</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Millipore-OmniPur</td><td>9210-500GM</td><td>500 g</td></tr><tr><td>ARNt Levure</td><td>Fisher-Invitrogen</td><td>15401011</td><td>25 mg</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50mL</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Fisher Scientific-Scientific Industries, Inc</td><td>50-728-002</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de lithium (LiCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>203637-10G</td><td>10 g</td></tr></tbody></table>

wholemount, hybridation in situ pour astyanax embryons

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Ces dernières années, un génome de projet pour les aveugles agassizii mexicain (Astyanax mexicanus) a été libéré, révéler l’identité de séquence pour des milliers de gènes. Des recherches antérieures dans ce nouveau système de modèle capitalisé sur les enquêtes de génome complets qui ont identifié plusieurs QTL (QTL) associé à divers phénotypes associés à la grotte. Toutefois, la possibilité de connecter des gènes d’intérêt à la base héréditaire de changement phénotypique demeure un défi important. Une technique qui peut faciliter une compréhension plus profonde du rôle du développement dans l’évolution de la troglomorphic est entier-montez l’hybridation in situ. Cette technique peut être implémentée pour directement comparer l’expression des gènes entre les formes vivant dans les grottes et surface, désigner candidat gènes qui sous-tendent les QTL établie, identifier des gènes d’intérêt provenant d’études de la nouvelle génération de séquençage ou développer autre approches axées sur la découverte. Dans ce rapport, nous présentons un protocole simple, accompagné d’une liste de contrôle flexible, qui peut être largement adapté pour une utilisation bien au-delà du système de l’étude présentée. Il est à espérer que ce protocole peut servir comme une grande ressource pour la communauté Astyanax et au-delà.

Dans ce rapport, nous proposons une approche simple et directe pour effectuer le marquage des spécimens d’Astyanax embryonnaires pour l’analyse de l’expression génique de haute qualité. Cette technique peut être effectuée dans les quatre ou cinq jours, et chaque étape principale de la procédure est représenté dans un diagramme de flux codés par couleur (Figure 1). Une fois terminé, embryons colorés devraient abriter une étiquette chromatique violette...

Ce protocole permet la visualisation de l’expression génique dans embryonnaires agassizii Astyanax . Cette approche a été développée avec l’objectif de maximiser le signal d’expression de gène, tout en minimisant la coloration de fond non spécifique.

Wholemount, hybridation In Situ pour Astyanax embryons

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...

Notre protocole in situ est significatif parce qu’il fournit un moyen simple de visualiser les modèles d’expression des gènes avec un minimum de taches de fond. Cette technique rend un protocole compliqué et long relativement facile à exécuter. Benchtop a mis en place des suggestions et des listes de contrôle fournies rendre ce protocole encore plus facile à exécuter correctement et à reproduire.Bien que les techniques présentées ici soient spécifiques à Astyanax mexicanus, elles pourraient probablement être adaptées à d’autres systèmes d’individus de taille comparable avec de petits ajustements au protocole. Tout d’abord, utilisez du ruban de laboratoire coloré pour désigner des flacons et des pipettes pour chaque gène. À l’aide d’une pipette Pasteur, trier les embryons.Il n’y a généralement pas plus de 12 embryons par flacon, une fois triés. Ensuite, réglez un bain d’eau secouant à 70 degrés Celsius. Dessinez soigneusement le méthanol dans les flacons d’embryons triés et remplacez-le par 500 microlitres de méthanol frais à 100 %.Lavez brièvement les embryons pendant environ une minute sur un shaker de plate-forme. Après cela, réhydrater les embryons dans une concentration croissa

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Cette vidéo montre deux couleurs monter toute l'hybridation in situ, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle des deux gènes différents peuvent être visualisées dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil et David Ingham Ish-Horowicz.

Double Mont entier hybridation in situ d&#39;embryons de poulet début

Cette vidéo montre tout le mont immunohistochimie, une méthode par laquelle le profil d'expression spatiale et temporelle d'un antigène peut être visualisé dans des embryons de poulet jeunes. Cette méthode a été initialement présenté par Jane et Tom Dodd Jessell.

Méthode de coloration Mont anticorps entier de Chick

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

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ARN<em&gt; In situ</emHybridation&gt; en embryons entiers de montage et histologie Adapté pour les élasmobranches marins

Le poisson zèbre, un petit poisson tropical, est devenu un modèle populaire pour étudier la fonction des gènes au cours du développement des vertébrés et de la maladie. L'expression spatiale et temporelle des gènes cibles peut être déterminée...

Haute Résolution Mont entier<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridation dans les embryons de poisson zèbre pour étudier l&#39;expression des gènes et la fonction

L’embryon de Xenopus laevis continue d’être exceptionnellement utile dans l’étude du développement précoce en raison de sa grande taille et de sa facilité de manipulation.   Un protocole simplifié pour l’hybridation in situ de l’ensemble du mont est fourni qui peut être utilisé dans l’identification d’organes spécifiques dans ce système modèle.

Comprendre organogenèse précoce aide d&#39;un simplifié<em&gt; In Situ</em&gt; Protocole hybridation in<em&gt; Xenopus</em

L'embryon de poisson zèbre est un excellent modèle pour la recherche sur la biologie du développement. Au cours de l'embryogenèse, le poisson-zèbre se développer avec une masse jaune, qui pose des problèmes en trois dimensions pour l'observation et l'analyse des échantillons. Ce protocole décrit comment créer deux dimensions planes monter préparatifs de la montagne toute in situ (WISH) colorées de spécimens d'embryons de poisson zèbre.

Appartement Mont Préparation pour l&#39;observation et l&#39;analyse des échantillons embryon de poisson zèbre souillé par toute la montagne<em&gt; In situ</em&gt; Hybridation

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Découvrez une méthode d'hybridation in situ simplifiée pour visualiser l'expression génique chez les embryons d'Astyanax mexicanus avec un bruit de fond minimal. Ce protocole reproductible facilite les études en biologie du développement et en génétique évolutive.

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