Agrobacterium tumefaciens et Agrobacterium rhizogenes-Mediated Transformation des pommes de terre et de l’activité du promoteur d’un gène de subérine par GUS Staining

La transformation à base d’agrobactéries est une méthode facile pour produire des plants de pommes de terre génétiquement modifiés. Afin de comprendre les fonctions génétiques spécifiques et leur contribution à la physiologie des organes. La transformation par agrobactérie rhizogenes est un outil robuste pour évaluer rapidement les racines du fonctionnement des gènes, car des résultats similaires peuvent être obtenus par la transformation des tuméfaciens agrobactériens.

Sandra Fernandez-Pinan, post-doc, et Jennifer Lopez, étudiante en maste5r de notre laboratoire, démontreront cette procédure. Commencez par cultiver une seule colonie d’agrobactéries pendant la nuit dans cinq millilitres de bouillon d’extrait de levure, ou milieu YEB, complété par des antibiotiques dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres à 28 degrés Celsius, à 200 rotations par minute. Pour une transformation a-tumefaciens, mesurer la densité optique le lendemain matin.

Lorsque la densité optique à 600 nanomètres, ou OD 600 atteint 0,6 pour un, centrifugeuse d’un millilitre de la culture agrobactérienne et de resuspendre la pastille dans un millilitre de milieu frais YEB sans antibiotiques. Après le deuxième lavage, resuspendez la pastille dans le milieu frais de YEB sans antibiotiques, à la concentration appropriée pour obtenir un OD final 600 de 0,8, et placez les cellules bactériennes sur la glace. Pour la transformation des plantes à l’aide d’A.rhizogenes, transférez soigneusement une plante donneuse d’une culture moyenne 2MS à une plaque carrée de 120 x 120 millimètres, et utilisez une aiguille chirurgicale pour injecter trois microlitres d’une culture A.rhyzogenes à différentes internodes souches que possible.

Ensuite, transférez immédiatement l’ensemble de la plante dans une nouvelle plaque carrée contenant du milieu solide de SP, complétée par de l’acétosyringone de 0,1 millimlaire. Après avoir placé une deuxième plante sur la même plaque, transformée de la même manière, sceller la plaque avec du ruban chirurgical, et placer la plaque verticalement à l’intérieur d’une armoire de croissance pendant quatre jours. Transférer la plante dans une plaque carrée avec un milieu de SP complété avec du sodium cefotaxime pour tuer les A.rhizogenes et placer la plaque scellée verticalement à l’intérieur d’une armoire de croissance pendant quatre jours.

Après 10 à 12 jours, de nouvelles racines poilues apparaîtront. Leur transformation peut être confirmée par microscope stéréo fluorescent. À cette époque, exciser les racines indigènes de chaque plante, et transférer les plantes dans une nouvelle plaque carrée avec milieu MS, complétée par du sodium cefotaxime pour tuer les A.rhizogenes.

Pour obtenir une plante composite, laissez pousser les racines poilues transgéniques pendant encore trois à quatre semaines dans le milieu de la SP, complétées par du sodium cefotaxime. Pour la transformation des plantes à l’aide d’A.tumefaciens. Couper et placer une feuille d’une plante de trois à quatre semaines dans une boîte de Pétri, et utiliser un scalpel pour faire une à trois coupes transversales du centre de la feuille aux bords sans couper les morceaux de la feuille.

et d’exclure le pétiole. Placez immédiatement la feuille dans une boîte de Pétri contenant 10 millilitres de liquide frais 2MS moyen, côté abaxial vers le haut, et couvrir l’assiette. Ajouter rapidement 80 microlitres de la culture A.tumefaciens au milieu liquide et remuer doucement le milieu pendant une minute pour répartir homogènement la solution bactérienne.

Ensuite, sceller soigneusement et couvrir la plaque de papier d’aluminium pour une incubation de deux jours dans une chambre de 24 degrés Celsius. À la fin de la période de transformation, transférer les feuilles abaxial-côté vers le haut, vers le milieu induisant indifféreux, gratté avec des pinces pour une incubation d’une semaine dans l’armoire de croissance. À la fin de l’incubation, transférer les feuilles, côté abaxial vers le haut, sur un milieu induisant des pousses grattées à la pince à épiler, et incuber les feuilles dans une armoire de croissance.

Lorsque les chutes émergées sont d’environ deux centimètres de haut, couper trois chutes émergentes de chaque calleux. Placez jusqu’à cinq événements différents de transformation de chute en flacons de culture individuels contenant le milieu de MG complété avec le sodium de cefotaxime pour permettre l’enracinement, et étiquetez le sous-ensemble comme approprié pour une incubation de trois à quatre semaines dans l’armoire de croissance jusqu’à ce que les chutes soient vigoureuses. À la fin de l’incubation, sélectionnez la plante la plus vigoureuse de chaque événement et coupez les segments apicals de la goulotte de trois à quatre internodes de chaque plante.

Placez les segments dans un flacon de culture contenant 2MS moyen complété avec du sodium cefotaxime et faire pousser les plantes jusqu’à ce qu’ils développent des chutes vigoureuses et des racines. Pour effectuer un test génétique de journaliste histochimique bêta-glucuronidase ou GUS, fixez les racines d’une culture végétale in vitro de deux à trois semaines avec de l’acétone réfrigérée à 90 % pendant 20 minutes sur la glace. À la fin de la fixation, laver les racines deux fois dans de l’eau distillée et traiter les racines avec une solution de coloration gus fraîche sous vide pendant 20 minutes.

À la fin du traitement sous vide, placez les racines à 37 degrés Celsius dans l’obscurité pendant environ quatre heures. Lorsqu’une couleur bleue est visible, lavez les racines deux fois avec 70 % d’éthanol et visualisez la coloration sous un microscope à champ lumineux. Les racines poilues transformées présentent une florescence rouge lorsqu’elles sont éclairées par la lumière verte, tandis que l’agrobactérie non transformée de contrôle négatif ne démontre aucune florescence de ce genre, indiquant l’adéquation du marqueur de transformation rouge DS pour identifier les racines poilues transgéniques.

Ici, les taches gus dans les racines des plantes transgéniques obtenues par A.tumefaciens et les racines poilues transgéniques obtenues par A.rhizogenes sont montrées. Comme on l’a observé, les racines transformées avec A, tumefaciens et cultivées in vitro, démontrent la coloration bleue dans l’endoderme, une couche cellulaire entre le cortex et la stèle. Dans les racines plus développées, l’étiquetage bleu est inégal dans la couche externe, correspondant à l’exodermis.

Dans les racines poilues transformées obtenues par A.rhizogenes, et cultivées en culture hydroponique, le marqueur GUS est spécifiquement situé dans l’endoderme dans l’émergence de racines latérales dans les zones blessées et dans l’exodermis. En plus d’être une méthode rapide, les racines transgéniques obtenues avec l’agrobactérie rhizogenes ont également transporté l’ADN du plasmide induisant la racine, qui peut déréglementer certains processus directement contrôlés. Les racines poilues transgéniques obtenues avec des rhizogenes agrobactériens peuvent être maintenues pendant qu’elles tirent, mais peuvent alternativement être sur place jusqu’à ce qu’elles se propagent in vitro pour une production massive de transit.

La transformation de la pomme de terre fournit un bon outil pour vérifier la fonction génique et l’activation du promoteur, ainsi que pour produire des règles méthodologiques chez une espèce d’intérêt agronomique élevé. L’organisme génétiquement modifié doit être jeté en toute sécurité après utilisation pour éviter la contamination de l’environnement. En outre, la solution de gaz contient dérivé toxique de cyanure, ainsi portez la protection et jetez la solution sans risque.