Name: ATAC-seq test ADN Mitochondrial faible contamination de primaires humaines CD4 + Lymphocytes T (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Découvrez un protocole ATAC-seq optimisé pour réduire la contamination mitochondriale de 50% à moins de 3% dans les lymphocytes T CD4+ humains. Cette méthode diminue les coûts de séquençage de 50% et améliore la qualité des données.

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Nous remercions Atsede Siba pour le support technique. C.S.C. est pris en charge par les NIH grant 1R61DA047032.

Ce protocole amélioré fournit des instructions détaillées pour l’exécution de ATAC-seq des lymphocytes CD4 +, de la matière première de sang grâce à l’analyse de données (Figure 1).
1. isolement des cellules de T CD4 + du sang total
Remarque : Le produit de départ pour ce protocole est de 15 mL de sang total frais prélevé à l’aide de procédures standards, permettant à la source des matières premières à être sélectionné issu des besoins de recherche. L’échelle du protocole selon les besoins. Réchauffez en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + sérum de veau foetal de 2 % (FCS) à température ambiante (RT) et ajustez la centrifugeuse pour RT avant de commencer la procédure d’enrichissement de cellules T CD4 +.
<ol><li>Ajouter 750 µL de CD4 + lymphocytes T enrichissement humain cocktail à 15 mL de sang dans un tube conique de 50 mL et mélanger doucement à l’inversion. Incuber 20 min à RT. Lors de l’incubation est terminée, ajouter 15 mL de PBS + 2 % FCS dans le tube et mélanger doucement à l’inversion.</li>
	<li>Préparer un tube conique frais 50 mL 15 ml de milieu de densité. Soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le dessus de la moyenne densité, étant sûr de ne pas perturber l’interface de support/sang de densité qui forme la couche. Centrifuger pendant 20 min à 1 200 x RT et g l’accélération de la valeur 1 et le frein décroissant au large. Remarque : Il est essentiel de définir l’accélération 1 et descendant de frein OFF sur la centrifugeuse à éviter des perturbations de la couche de cellules dans le milieu de la densité.</li>
	<li>Recueillir les cellules T CD4 + enrichis depuis l’interface de support/plasma de densité à l’aide d’une pipette de transfert tige étroite. Transférer les cellules recueillies dans un tube conique frais 50 mL. Centrifuger les cellules T CD4 + collectées pendant 8 min à 423 x g et RT. Remarque : Assurez-vous de revenir l’accélération centrifuge frein 9 et descendant sur ON pour l’étape 1.3 et toutes les étapes suivantes.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver le culot cellulaire deux fois avec 50 mL de PBS + 2 % FCS, centrifugation pendant 8 min à 423 x g et RT. jeter le surnageant final lavez et suspendre le culot cellulaire lavées dans 2 mL de PBS + 2 % FCS.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Pour continuer avec ATAC-seq, passez à l’étape 2.3. Pour congeler les cellules pour un traitement ultérieur, passer au point 1.6.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu frais glacial (FCS 90 % + 10 % de diméthyl sulfoxide) par 1 million de cellules. Aliquote 1 mL de cellules en gel en tubes sécurités cryogéniques. Placer les tubes à-80 ° C durant la nuit dans un récipient de ralentir au point de congélation. Le lendemain, transfert en tubes à l’azote liquide pour le stockage à long terme. Remarque : 1 million de cellules T CD4 + sera isolé par 2 mL de volume de sang d’origine. Congelez 500 000 cellules dans 1 ml de milieu de congélation. Faire un milieu gel frais à chaque utilisation.</li>
</ol>2. activer et purifier les cellules T CD4 +
Remarque : Ce protocole rapid pour l’activation et la purification de cellules T CD4 + seulement requiert 48 h et les résultats dans 95 % viable, activé les cellules T CD4 +. Cool le centrifuger à 4 ° C avant de commencer le protocole.
<ol><li>Décongeler 1 flacon (500 000) des cellules T CD4 + dans un bain-marie à 37 ° C jusqu'à ce que la glace a fondu juste. Cellules de transfert doucement dans un tube conique 15 mL contenant 9 mL de médias de Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) pré chauffé additionné de 10 % de FCS, ci-après dénommé RPMI complet. Remarque : Ne laissez pas les cellules décongeler complètement pour éviter l’exposition au DMSO.</li>
	<li>Centrifuger pendant 6 min à 1500 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant et suspendez doucement le culot dans 2 mL de RPMI complet. Répéter le spin down, éliminer le surnageant et suspendez doucement les cellules dans 0,5 mL de RPMI complet.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Ajuster la densité de la suspension cellulaire avec RPMI complet à 50 000 cellules dans 200 µL / puits d’une plaque de fond rond 96 puits de la plaque. Remarque : D’un tube congelé des cellules T CD4 + de 500K, puits de la plaque 10 des 50 000 cellules T CD4 + dans 200 µL / puits.</li>
	<li>
Préparer des billes magnétiques conjugués avec anticorps anti-CD3 et anti-CD28 humains de T-activator.
	<ol>
<li>Aliquote 12,5 µL d’humain T-activateur CD3/CD28 perles par ATAC-seq échantillon dans un tube de 1,5 mL. Laver les billes avec 1 mL de solution 1 PBS x et placer le tube sur un aimant pendant 1 min.</li>
		<li>Retirer et jeter le surnageant clair, retirez délicatement le tube d’aimant et suspendre les perles dans 13 µL terminer RPMI par échantillon ATAC-seq. Remarque : Calculer le montant de perles nécessaires selon le nombre d’échantillons de ATAC-seq en cours de traitement. Ce protocole requiert 12,5 µL de billes CD3/CD28 par 500 000 cellules, constituant un échantillon de ATAC-seq.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Activer les cellules T CD4 +. Prélever des 500 000 cellules en 2,1 mL du milieu RPMI complet dans un tube conique de 15 mL et ajouter 12,5 µL de perles de T-activateur humaines déjà lavées. Mélanger doucement en retournant le tube.</li>
	<li>Transférer doucement les cellules avec des perles à une stérile réservoir et plaque 200 µL de cellules avec des perles / puits de la plaque à 96 puits fond rond à l’aide d’une pipette multi-canaux. Incuber pendant 48 h dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.</li>
	<li>Après incubation, centrifuger la plaque 96 puits pendant 8 min à 423 x g et RT. enlever 100 µL de milieu / puits de la plaque à 96 puits, il collecte dans un tube conique avant de le jeter pour assurer sans perte de perle. Resuspendre le culot dans les derniers 100 µL et recueillir tous dans un tube de 1,5 mL. Remarque : 10 puits de lymphocytes T activés seront rassemblées dans un volume de 1 mL.</li>
	<li>Effectuer des CD4 + isolation. Ajouter 50 µL de Prélavée perles CD4 conjugué aux 500 000 cellules dans 1 mL de milieu RPMI complet. Combiner les perles et les cellules la pipette. Incuber pendant 20 min à 4 ° C dans le réfrigérateur. Agiter les perles et mélange toutes les 6 minutes de la cellule. Remarque : Ce protocole doit être utilisé que pour un échantillon de 500 000 cellules. Ajustez si nécessaire pour deux ou plusieurs échantillons de 500 000.</li>
	<li>Lorsque l’incubation est terminée, placer le tube sur l’aimant pour 2 min. retirer et jeter le surnageant lorsque claire. Laver les cellules perle-bondissent en enlevant le tube de l’aimant, suspendant les cellules perle-bondissent dans 1 mL de PBS + 2 % FCS, remplaçant le tube sur l’aimant pendant 1 min et jeter le surnageant clair. Répétez ce processus pour un total de 3 lavages. Remarque : Veillez à ne pas jeter des perles lors de lavages.</li>
	<li>Après le lavage final, placer le tube sur l’aimant pour 1 min. retirer et jeter le surnageant et placez la sur la glace. Passez à la section 3 (ATAC-seq).</li>
</ol>3. ATAC-seq
Remarque : Dans cette étape, les noyaux sont isolés de lymphocytes T CD4 + activés pour ATAC-suiv. Le tampon de lyse utilisé dans le présent protocole a été amélioré pour être plus doux sur les noyaux, ce qui entraîne une digestion plus efficace et des résultats de qualité supérieures. Toutes les étapes de centrifugation à l’article 3 sont effectuées avec une centrifugeuse à angle fixe maintenue à 4 ° C. Cool la centrifugeuse avant de commencer le protocole.
<ol><li>Effectuer l’isolation de noyaux. Remettre en suspension les cellules avec le tampon de lyse froid (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 10 mM NaCl, MgCl2, 0,03 % polysorbate 20 3 mM) et perles. Centrifuger immédiatement à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C. Retirer et jeter le surnageant.</li>
	<li>Effectuer la réaction de la transposase. Suspendre le culot de noyaux isolés avec 50 µL de Tn5 transposase mix (tableau 1). Incuber dans un thermocycleur pendant 30 min à 37 ° C, avec un couvercle de 40 ° C, tenant à 4 ° C lorsque vous avez terminé.</li>
	<li>Après cyclage thermique, immédiatement effectuer une rotation de centrifugeuse de paillasse rapide vers le bas et placer le tube sur l’aimant pendant 1 min retirer les billes du produit.</li>
	<li>Transférer le surnageant clair du tube sur l’aimant à une colonne de purification de l’ADN. Laver la colonne avec 250 µL de tampon de PB et deux fois avec 750 µL de tampon de PE. Éluer l’échantillon de 10 µL de tampon d’élution. Passer directement au point 3.5. Remarque : Cette étape amplifie les fragments d’ADN avec les adaptateurs ligaturés, dénommés ici la bibliothèque ATAC-seq. Pour multiplexer plusieurs bibliothèques ATAC-seq pour être exécuté sur une seule voie NGS, utilisez non indexées Primer 1 pour tous les échantillons et un 2 de Primer indexée différents pour des échantillons individuels (tableau 2). Amorces servent à travailler les concentrations de 1,25 µM.</li>
	<li>Mettre en place la réaction d’amplification PCR initiale dans un tube PCR exempte de nucléase, combinant les composants dans l’ordre et le volume spécifié dans tableau 3. Placer le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR avec cyclisme conditions spécifiées dans le tableau 4.</li>
	<li>
Surveiller la réaction de qPCR. Mettre en place la réaction de qPCR dans un tube PCR exempte de nucléase, combinant les composants dans l’ordre et de la quantité spécifiée dans le tableau 5. Place dans la machine de qPCR et cycle comme spécifié au tableau 6.
	<ol>
<li>Pour déterminer que le nombre optimal d’amplification supplémentaire des cycles pour la réaction de 45 µL restants, créer un terrain avec le nombre de cycles sur l’axe des abscisses et la fluorescence relative (RFU) sur l’axe y. Le nombre optimal de cycles d’amplification supplémentaire est un tiers le nombre de cycles qu’il faut pour la réaction de qPCR atteindre le plateau. NOTE : Suivi de la réaction de qPCR permet pour déterminer le nombre optimal de cycles PCR désiré obtenir l’amplification de fragment de bibliothèque optimale tout en minimisant les GC contenu et biais de taille.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Compléter l’amplification PCR finale le µl 45 restantes de la réaction PCR. Replacez le tube PCR avec la réaction d’amplification de l’étape 3.5 dans le thermocycleur et exécuter le programme, tel que décrit dans le tableau 7. Remarque : Pour les échantillons traités tel que décrit dans le présent protocole, le nombre optimal de cycles d’amplification PCR a été déterminé à 12.</li>
	<li>Une fois terminée l’amplification, purifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de nettoyage PCR suivant le protocole du fabricant, à élution de 25 µL du tampon d’élution. Remarque : Amplifié bibliothèques peuvent être conservés à 4 ° C pendant 48 h ou congelés à-20 ° C pour le stockage à long terme.</li>
</ol>4. ATAC-seq bibliothèque analyse de la qualité
Remarque : Il est important de valider la qualité et la quantité des bibliothèques ATAC-seq avant séquençage nouvelle génération. La qualité et la quantité des bibliothèques devraient être évalués à l’aide de trousses disponibles dans le commerce (voir Table des matières).
<ol><li>Évaluer la qualité et la quantité des bibliothèques ATAC-seq en utilisant une plate-forme microfluidique de dimensionnement, de quantification et de contrôle de la qualité de l’ADN. Voir la Figure 2 pour les résultats de l’évaluation qualité représentatif. Remarque : La concentration des bibliothèques ATAC-seq doit être > 1 ng/µL à obtenir des résultats de séquençage de qualité. Le moyen, 30 nM à 25 µL ont été obtenus.</li>
</ol>5. le séquençage et l’analyse des données
Remarque : Ce pipeline analyse permet aux utilisateurs de contrôler la qualité des lectures mappage de procédure, ajuster les coordonnées pour la conception expérimentale et appeler les pics pour l’analyse en aval. Voici les lignes de commandes et l’explication de l’exécution. Le package d’analyse de données est disponible à (https://github.com/s18692001/bulk_ATAC_seq).
<ol><li>Séquencer les bibliothèques de prêts sur un séquenceur de prochaine génération à une profondeur moyenne de 42 millions de lectures par exemple.</li>
	<li>Estimer la qualité des lectures de séquençage en vérifiant les fichiers générés par FastQC12 progiciel à l’aide de la commande : fastqc -o < output_directory >< fastq_file ></li>
	<li>Couper les bases des lectures par Trimmomatic13 logiciel, le cas échéant, tel que déterminé par le contrôle de qualité de FastQC, à l’aide de la commande (à paire asymétrique) : Java-jar < chemin d’accès au fichier jar trimmomatic > PE < input1 >< input2 >< appariés output1 >< non apparié output1 >< appariés output2 >< non apparié output2 > HEADCROP : < recadrer les bases ></li>
	<li>Aligner les lectures au génome humain de référence (hg38) par Bowtie214 software : bowtie2 - x < génome de référence > -1 < paire d’entrée 1 >< paire d’entrée 2 > -S < fichier de sortie SAM > Remarque : L’argument - x est pour le nom de la base de l’indice pour le génome de référence, et est -S pour la sortie de format SAM.</li>
	<li>Vérifiez telsqueles mappé se lit à l’aide de Samtools15 flagstat package : SamTools flagstat < fichier BAM ></li>
	<li>Trier le fichier mappé lectures et supprimer les doublons en utilisant outil16 Picard : Java-jar picard.jar d’entrée SortSam = < nom du fichier d’entrée SAM > sortie = < nom du fichier sortie tri BAM > SORT_ORDER = coordonnée » et « java-jar picard.jar MarkDuplicates entrée = < fichier trié de BAM > sortie = < fichier de sortie BAM sans doublons > REMOVE_DUPLICATES = TRUE</li>
	<li>Fichier index BAM, tailler les lectures de chromosome inutilisés et passer les coordonnées pour la raison expérimentale de ATAC-seq17: Java-jar picard.jar BuildBamIndex entrée = < fichier BAM > SamTools idxstats < fichier entrée BAM > | couper -f 1 | grep - v chrY | grep - v chrM | grep - v chrUn | xargs samtools découvre -b < fichier entrée BAM >>< garnis de sortie fichier BAM > BEDTools bamtobed -i < Input garnis de fichier BAM >>< garnis de sortie fichier lit > awk ' BEGIN {OFS = « \t »} ; {Si (6 $ == « + ») print $1, $2 + 4, 3 + 4 $, 4 $, 5 $, 6 $; else print $1, $2-5, 3-5 $, 4 $, 5 $, 6 $} ' < Input garnis de fichier lit >< boîte décalé fichier lit ></li>
	<li>Supprimez les lectures qui sont décalés vers la coordination négative : awk « {if ($2 > 0) print $1 « \t » $2 « \t » $3 « \t » $4 « \t » $5 « \t » $6} » < fichier entrée lit >< fichier de sortie non négatif coordination lit >.</li>
	<li>Convertir le fichier lit vers BAM pour analyse de18 DiffBind suivante : BEDTools bedtobam -i < Input lit dossier > -g < référence génome >< fichier de sortie BAM ></li>
	<li>Effectuer des appels de crête par DiffBind18 progiciel : macs2 callpeak -t < fichier entrée BAM > f - BAM -g hs - nomodel--nolambda--keep-dup tous--appel-sommets--outdir < chemin de répertoire de sortie > - n < nom de sortie > -B - q 0,01--bdg--Maj -100--extsize 200 Remarque : Après filtrage, s’attendre à une moyenne de 37 millions de lectures par exemple. Contamination de l’ADN mitochondriale variera de 0,30 % à 5,39 % (1,96 % en moyenne). Il y aura un faible taux de multiplier mappés lectures (6,7 % à 56 %, 19 % en moyenne) et un pourcentage relativement élevé d’utilisables nucléaire lit (60 % à 92 %, 79 % en moyenne).</li>
</ol>

<ol><li>Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+native+chromatin+for+fast+and+sensitive+epigenomic+profiling+of+open+chromatin%2C+DNA-binding+proteins+and+nucleosome+position%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position.</a> Nature Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).</li>
<li>Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATAC-seq%3A+A+Method+for+Assaying+Chromatin+Accessibility+Genome-Wide%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 21, 1-29 (2015).</li>
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<li>Rosenberg, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+profiling+of+the+developing+mouse+brain+and+spinal+cord+with+split-pool+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell profiling of the developing mouse brain and spinal cord with split-pool barcoding.</a> Science. 360 (6385), 176-182 (2018).</li>
<li>Corces, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage-specific+and+single-cell+chromatin+accessibility+charts+human+hematopoiesis+and+leukemia+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution.</a> Nature Genetics. 48 (10), 1193-1203 (2016).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

ATAC-seq mis à jour le protocole présenté dans cet article fournit des résultats reproductibles avec une contamination ADN mitochondriale minimale. Le protocole a été avec succès utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine des humains primaires PBMC10, des monocytes, cellules dendritiques de souris (non publiées) et cellules de mélanome cultivées les lignes11. Nous prévoyons que cette amélioration lyse condition a la possibilité de travailler pour les autres t...

Le dosage pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) est rapidement devenu la principale méthode pour interroger l’architecture de la chromatine. ATAC-seq peut identifier les régions de chromatine accessible à travers le processus de tagmentation, la fragmentation et le marquage de l’ADN par la même enzyme, pour produire des bibliothèques avec laquelle séquençage peut déterminer l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier. Ce processus de tagmentation est médié par la transposase Tn5 hyperactif, qui ne coupe que les régions ouvertes de la chromatine en raison de l’encombrement stérique nucleosomic. Qui le touche, la transposase Tn5 insère également des adaptateurs de séquençage qui permettent la construction rapide de bibliothèque par PCR et génération séquençage du génome de chromatine accessible1,2.
ATAC-seq est devenue la méthode préférée pour déterminer les régions de l’accessibilité de la chromatine en raison du protocole relativement simple et rapide, la qualité et la quantité d’information qui peut être déterminée de ses résultats et une petite quantité de matériel requis de départ. Par rapport à DNase-seq3 (qui mesure également l’accessibilité de la chromatine génome-large), MNase-seq4 (qui détermine les positions des nucléosomes dans régions génomiques ouvert), et le formaldéhyde-mediated FAIRE-seq5, ATAC-seq est plus rapide, moins cher et plus reproductible1. Il est aussi plus sensible, avec matériel d’aussi peu que 500 noyaux, par rapport aux 50 millions requis pour DNase-seq3noyaux de départ. ATAC-seq a également la possibilité de fournir plus d’informations sur l’architecture de la chromatine que d’autres méthodes, y compris les régions de liaison de facteur de transcription, positionnement des nucléosomes et régions de chromatine ouverte1. Efficaces, monocellulaires ATAC-seq protocoles ont été validés, fournissant des informations sur l’architecture de la chromatine à la cellule unique niveau6,7.
ATAC-seq a été utilisé pour caractériser l’architecture de la chromatine dans un large éventail de types de cellules et de la recherche, y compris les plantes8humains9et beaucoup d’autres organismes. Il a également été essentiel dans l’identification de régulation épigénétique de la maladie États7. Cependant, le plus largement utilisé du protocole ATAC-seq inclut l’inconvénient majeur de contamination lectures de séquençage de l’ADN mitochondrial. Dans certaines bases de données, ce niveau de contamination peut être aussi haut que 60 % de séquencer les résultats1. Il y a un effort concerté dans le domaine de réduire ces contaminants lectures mitochondriales afin de permettre l’application plus efficace de ATAC-seq7,10,11. Nous présentons ici un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit le taux de contamination de l’ADN mitochondrial, à seulement 3 %, permettant de réduire d’environ 50 % de coûts de séquençage10. Ceci est rendu possible par un processus simplifié de CD4 + lymphocytes d’isolement et d’activation et un tampon de lyse améliorée qui est essentielle pour réduire au minimum la contamination de l’ADN mitochondriale.
Ce protocole modifiedATAC-seq a été validé avec une large gamme de cellules primaires, y compris le sang périphérique primaire humain cellules mononucléaires (PBMC)10, des monocytes humains primaires et les cellules dendritiques de souris (non publiées). Il a également été utilisé avec succès pour interroger des lignées de cellules de mélanome dans un écran régulièrement dois‑je courts palindromes répétitions (CRISPR) en cluster de non-codage éléments11. En outre, le progiciel d’analyse de données décrites dans le présent protocole et fourni sur GitHub fournit des chercheurs débutants et expérimentés avec des outils pour analyser les données de l’ATAC-seq. ATAC-seq est le dosage plus efficace pour cartographier l’accessibilité de la chromatine dans un génome entier, et les modifications au protocole existant qui sont introduites ici permettra aux chercheurs de produire des données de haute qualité avec une faible contamination de l’ADN mitochondriale, réduction des coûts de séquençage et améliorant le débit ATAC-seq.

<table><tbody><tr><td>1x PBS, Gibco stérile</td><td></td><td>10010023</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>5810/5810&nbsp ; Centrifugeuse réfrigérée à godets oscillants R avec godets tubulaires de 50 ml, 15 ml et 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22625501</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>96 Plaque à fond rond bien</td><td>Thermo Scientific</td><td>163320</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>Système de station de bande Agilent 4200</td><td>Agilent</td><td>G2991AA</td><td>suggéré pour l’évaluation de la qualité.</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Thermo Scientific</td><td>374081</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11131D</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Dynabeads Untouched Human CD4 T Cells Kit</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11346D</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Dynamagnet</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>12321D</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini Bio Products</td><td>100-500</td><td>Peut utiliser d’autres comparables Produits.</td></tr><tr><td>Kit ADN haute sensibilité</td><td>Agilent</td><td>50674626</td><td>suggéré pour l’évaluation de la qualité.</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium, hexahydraté, biologie moléculaire</td><td>Sigma</td><td>M2393</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>MinElute PCR Purification Kit (Tampon PB, Tampon PE, Tampon d’élution)</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>Composant critique</td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>NaCl, Biologie moléculaire Grade</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>NEBNext High Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0541</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Nextera DNA Library Preparation Kit (2x tampon TD, enzyme Tn5)</td><td>Illumina</td><td>FC1211030</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Nuclease Free Stérile dH20</td><td>Gibco</td><td>10977015</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>Polysorbate 20 (Tween20)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>A25780</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Precision Water Bath</td><td>Thermo Scientific</td><td>TSGP02</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Composant critique</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Kit de dosage</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q32851</td><td>Suggéré pour l’évaluation de la qualité.</td></tr><tr><td>Qubit FlouroMeter</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>Q33226</td><td>Suggéré pour l’évaluation de la qualité.</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Density Medium Stem</td><td>Cell Technologies</td><td>15705</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>Rosette Sep Human CD4+ Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15022</td><td>Critical Component</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>Réservoir stérile</td><td>Thermo Scientific</td><td>8096-11</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>Thermocycleur T100 avec couvercle chauffant</td><td>BioRad</td><td>1861096</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr><tr><td>Tris-HCL</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Peut utiliser d’autres produits comparables.</td></tr></tbody></table>

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ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes

ATAC-seq est devenu une méthode largement utilisée dans l’étude de l’épigénétique en raison de son approche simple et rapide à la cartographie de la chromatine accessible de tout le génome. Dans cet article, nous présentons un protocole ATAC-seq amélioré qui réduit la contamination lectures d’ADN mitochondriales. Alors que les précédents protocoles ATAC-seq ont lutté avec une moyenne de 50 % la contamination de l’ADN mitochondrial se lit, le tampon de lyse optimisé présenté dans le présent protocole réduit la contamination d’ADN mitochondriale à une moyenne de 3 %. Ce protocole de ATAC-seq amélioré permet de presque 50 % de réduction dans le coût du séquençage. Nous démontrons comment ces bibliothèques ATAC-seq de haute qualité peuvent être préparés de lymphocytes CD4 + activés, fournissant des instructions étape par étape de CD4 + isolation de lymphocytes du sang total par le biais de l’analyse des données. Ce protocole ATAC-seq amélioré a été validé dans un large éventail de types de cellules et sera d’une utilité immédiate aux chercheurs qui étudient l’accessibilité de la chromatine.

A partir de 15 mL de sang total frais, ce protocole génère une moyenne de 1 million de cellules T CD4 +. Ceux-ci peuvent être congelés pour un traitement ultérieur ou utilisés immédiatement. La viabilité des cellules T CD4 +, fraîches ou décongelées, était systématiquement &gt; 95 %. Cette méthode d’isolement de cellules T CD4 + permet une flexibilité dans le temps de matériel et de la collection source. Ce protocole ATAC-seq amélioré produit une bibliothèque finale supérieure à 1 ng/µL p...

Nous présentons ici un protocole pour effectuer un test pour la transposase accessible chromatine séquençage (ATAC-seq) sur activé CD4 + lymphocytes humains. Le protocole a été modifié pour réduire au minimum la contamination mitochondrial DNA lectures de 50 % à 3 % grâce à l’introduction d’une nouvelle mémoire tampon de lyse.

ATAC-seq test ADN Mitochondrial faible contamination de primaires humaines CD4 + Lymphocytes T

ATAC-seq has become a widely used methodology in the study of epigenetics due to its rapid and simple approach to mapping genome-wide accessible ...

Ce protocole ATAC-seq modifié introduit un nouveau tampon de lyse qui diminue la contamination des lis mitochondriales de 50% à moins de 3%La diminution de la contamination mitochondriale permettra aux chercheurs d’effectuer un ATAC-seq plus efficace avec une diminution de 50% des coûts de séquençage. Nous avons validé ce nouveau protocole ATAC-seq chez les PBMCs primaires humains, les monocytes primaires humains, les cellules dendritiques de souris et les lignées cellulaires du mélanome. Nous croyons qu’il sera efficace dans un large éventail de types de cellules.Il est essentiel de minimiser la perte d’échantillon pendant le processus d’activation et de sélection des cellules pour obtenir des résultats de haute qualité avec ATAC-seq. Nous démontrerons comment manipuler un petit nombre de cellules à partir d’échantillons précieux à l’aide d’équipement de laboratoire de base. Pour commencer, décongelez un flacon de cellules CD4+T précédemment isolées dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius jusqu’à ce que la glace ait fondu.Ensuite, transférez doucement les cellules dans un tube conique de 15 millilitres contenant neuf millilitres de RPMI complet préchauffé. Centrifuger les cellules à 1500 fois G, et quatre degrés Celsius, pendant six minutes. Puis jetez le supernatant, et resuspendez doucement la pastille en deux millilitres de RPMI complet.Après avoir répété la centrifugation, jeter le supernatant, et doucement resuspendre les cellules en 0,5 millilitres de RPMI complet. Utilisez un hémocytomètre pour compter les cellules. À l’aide d’un RPMI complet, réglez la densité de la suspension cellulaire à la plaque 50 000 cellules CD4+, en 200 microlitres par puits d’une plaque à fond rond de 96 puits.Ensuite, pour préparer des perles magnétiques, aliquot 12,5 microlitres de perles humaines T-Activateur CD3/CD28 par échantillon ATAC-seq à un tube de 1,5 millilitre. Ajouter un millilitre de 1x PBS au tube, et le placer sur un aimant pendant une minute pour laver les perles. Retirez et jetez soigneusement le surnatant clair et retirez le tube de l’aimant.Resuspendez les perles dans 13 microlitres de RPMI complet par échantillon ATAC-seq. Pour activer les cellules CD4+T avec la concentration ajustée, recueillir 500 000 cellules dans 2,1 millilitres de milieu RPMI complet dans un tube conique de 15 millilitres. Ajouter 12,5 microlitres de perles human t-activateur, préparées et lavées dans les étapes précédentes, et mélanger délicatement en inversant le tube.Ensuite, transférez doucement les cellules, avec des perles, dans un réservoir stérile. À l’aide d’une pipette multicanal, plaquez 200 microlitres de cellules avec des perles par puits d’une plaque ronde de 96 puits et incubez dans un incubateur de 37 degrés Celsius et de CO2 à 5 % pendant 48 heures. Après incubation complète, centrifuger la plaque à 423 fois G, et température ambiante, pendant huit minutes.Retirer 100 microlitres de milieu de chaque puits et les recueillir dans un tube conique avant de les jeter, afin de confirmer qu’il n’y a pas de perte de perles. Puis résuspendez la pastille cellulaire dans les 100 microlitres restants de milieu, et de recueillir tout dans un tube de 1,5 millilitre. Pour isoler les cellules CD4+, ajouter 50 microlitres de perles conjuguées CD4 prélavées à 500 000 cellules dans un millilitre de RPMI complet, et inverser pour mélanger.Incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius, tout en feuilletant à la main toutes les six minutes pour mélanger. Placez le tube sur l’aimant pendant deux minutes, jusqu’à ce que le surnatant soit clair, puis retirez et jetez. Retirez le tube de l’aimant.Lavez les cellules liées aux perles en les réutilisant dans un millilitre de PBS, plus 2% FCS, et placez le tube sur l’aimant pendant une minute. Jetez le supernatant clair, et répétez ce processus pour un total de trois lavages. Après le lavage final, placez le tube sur l’aimant pendant une minute.Retirez-le, jetez le surnatant et placez la pastille sur la glace. Ensuite, pour effectuer l’isolement des noyaux, résuspendez les perles et les cellules dans 50 microlitres de tampon de lyse froide, et centrifugeuse immédiatement à 500 G, quatre degrés Celsius, pendant 10 minutes. Retirer et jeter le surnatant.Pour effectuer la réaction de transposase, resuspendez la pastille de noyaux isolée avec 50 microlitres de mélange de transposase Tn5. Incuber dans un thermocyclre pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, avec le couvercle réglé à 40 degrés Celsius, puis tenir à quatre degrés Celsius une fois terminé. Immédiatement après le thermocyclisme, effectuez une centrifugeuse rapide.Placez le tube sur l’aimant pendant une minute pour enlever les perles du produit. Sans enlever le tube de l’aimant, transférez le supernatant clair dans une colonne de purification de l’ADN. Lavez la colonne une fois avec 250 microlitres de tampon PB, et deux fois avec 750 microlitres de tampon PE.Ajouter ensuite 10 microlitres de tampon d’élitution pour élucider l’échantillon. Configurer la réaction initiale d’amplification pcr dans un tube PCR sans nucléase. Placez le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme d’amplification PCR.Ensuite, complétez l’amplification pcr finale des 45 microlitres restants de réaction PCR, tel que décrit dans le manuscrit. Placez le tube PCR dans le thermocycleur et exécutez le programme. Après amplification complète, purifier les bibliothèques à l’aide d’un kit de nettoyage PCR, suivant le protocole du fabricant, en 25 microlitres du tampon d’élitution.Séquencez les bibliothèques préparées sur un séquenceur de nouvelle génération à une profondeur de lecture moyenne de 42 millions de lecture par échantillon. Ce protocole ATAC-seq amélioré a produit une bibliothèque finale de plus d’un nanogramme par microlitre pour le séquençage. Le contrôle de la qualité a montré des fragments d’ADN entre 200 et 1000 paires de base, et d’autres séquençages ont été effectués avec ces bibliothèques de haute qualité.Les bibliothèques préparées à la suite de ce protocole n’ont montré qu’une contamination mitochondrique de 3 %. Le pourcentage élevé de lectures utilisables est suffisamment constant entre les répliques biologiques. Ce protocole a fourni des résultats hautement reproductibles à travers des répliques techniques, ainsi que des répliques biologiques.En outre, ce protocole a pris 48 heures, plutôt qu’une semaine ou plus comme décrit précédemment, ayant pour résultat l’activation cohérente et efficace, comme démontré par des résultats reproductibles de séquençage. De plus, le pipeline d’analyse a appelé avec précision les pics prévus d’ATAC-seq. L’analyse des résultats de séquençage a révélé des changements clairs dans l’état de chromatine pendant l’activation humaine des cellules T.Des régions différemment accessibles de chromatine ouverte ont été identifiées entre six échantillons avant et 48 heures après l’activation. Assurez-vous que la réaction de lyse des noyaux est effectuée avec des reagents et des matériaux réfrigérés, afin de maximiser la récupération des noyaux intacts. Notre tampon de lyse de noyaux modifiés est plus doux sur les cellules, et minimise la contamination de l’ADN mitochondrial.Nous attendons avec intérêt que ce tampon modifié de lyse soit appliqué aux noyaux simples ATAC-seq aussi bien. Nous savons que ce protocole permettra aux chercheurs de produire des données ATAC-seq de meilleure qualité à un coût réduit, ce qui aidera à faire avancer le champ épigénétique. Le protocole est simple, rapide et ne nécessite aucun réaccélément ou instrument dangereux, ce qui le rend facilement accessible aux nouveaux atac-seq.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Dosage pour la Transposase Accessible chromatine couplé avec le séquençage haut-débit (ATAC-seq) est une méthode de Génome-large pour découvrir la chromatine accessible. Il s’agit d’un protocole étape par étape de ATAC-seq, du moléculaire à la dernière analyse computationnelle, optimisé pour les lymphocytes humains (Th1/Th2). Ce protocole peut être adopté par les chercheurs sans expérience préalable dans les méthodes de séquençage de prochaine génération.

Cartographie de tout le génome de chromatine Accessible dans les Lymphocytes T humains primaires par ATAC-Seq

Nous décrivons ici une méthode se prête pour doser simultanément et ribonucléotides pangénomique carte en ADN hautement intact à résolution mononucléotidiques, combinant un clivage enzymatique de l’ADN génomique avec son hydrolyse alcaline et ultérieur 5´-fin séquençage.

La cartographie simultanée et au dosage des ribonucléotides dans l’ADN Mitochondrial humain

L’adaptation métabolique est fondamentale pour les lymphocytes T car elle dicte la différenciation, la persistance et la cytotoxicité. Ici, un protocole optimisé pour surveiller la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines ex vivo est présenté.

Surveillance en temps réel de la respiration mitochondriale dans les cellules T primaires humaines différenciées par cytokines

Nous présentons ici un protocole pour mesurer le nombre absolu de copies d’ADN mitochondrial (mt) et les niveaux d’hétéroplasmie de délétion de l’ADNmt dans des cellules individuelles.

Mesure du nombre de copies d’ADN mitochondrial unicellulaire et de l’hétéroplasmie à l’aide d’une réaction en chaîne par gouttelettes numériques par polymérase

ATAC-seq est une méthode de séquençage de l’ADN qui utilise la transposase mutante hyperactive, Tn5, pour cartographier les changements dans l’accessibilité de la chromatine médiés par des facteurs de transcription. ATAC-seq permet la découverte des mécanismes moléculaires sous-jacents aux altérations phénotypiques dans les cellules cancéreuses. Ce protocole décrit les procédures d’optimisation pour ATAC-seq dans les types de cellules épithéliales, y compris les cellules cancéreuses.

Optimisation ATAC-Seq pour la recherche en épigénétique du cancer

Les tests de pyroséquençage permettent le génotypage robuste et rapide des polymorphismes mononucléotidiques de l’ADN mitochondrial dans des cellules ou des tissus hétéroplasmiques.

Génotypage de polymorphismes mononucléotidiques dans le génome mitochondrial par pyroséquençage

Ce protocole décrit une technique de génération de cybrides à partir de cellules cancéreuses en suspension comme outil pour étudier le rôle des mitochondries dans le processus tumorigénique.

Génération transmitochondriale de Cybrides à l’aide de lignées cellulaires cancéreuses

Une procédure d’étude de la dynamique du métabolisme de l’ADN mitochondrial (ADNmt) dans les cellules à l’aide d’un format de plaque multipuits et d’une imagerie automatisée par immunofluorescence pour détecter et quantifier la synthèse et la distribution de l’ADNmt est décrite. Cela peut être utilisé pour étudier les effets de divers inhibiteurs, stress cellulaires et silençage génique sur le métabolisme de l’ADNmt.

Quantification à haut débit basée sur l’image de la synthèse et de la distribution de l’ADN mitochondrial

La bioénergie des lymphocytes T CD8 peut être interrogée à l’aide du test de stress Mito. Cette méthodologie peut être utilisée pour étudier la programmation métabolique aiguë et chronique. Ce protocole décrit des approches pour examiner les relations entre la biologie des récepteurs des lymphocytes T et l’analyse bioénergétique.

Mesure de la fonction mitochondriale des lymphocytes T CD8 naïfs et effecteurs

Les méthodes d’étude de la bioénergétique mitochondriale sous des concentrations de substrat physiologiquement pertinentes dans les cellules immunitaires sont limitées. Nous fournissons un protocole détaillé qui utilise la fluorespirométrie à haute résolution pour évaluer les changements dans la réponse du potentiel de la membrane mitochondriale à la demande d’énergie dans les cellules T humaines, les monocytes et les cellules mononucléées périphériques.

Fluorespirométrie à haute résolution pour évaluer les changements dynamiques du potentiel de la membrane mitochondriale dans les cellules immunitaires humaines

Ce manuscrit décrit un protocole pour la préparation d’une banque ATAC-seq de neutrophiles à partir de moelle osseuse murine, visant à garantir une viabilité optimale des neutrophiles et une qualité de bibliothèque élevée. Il offre des instructions étape par étape sur la préparation des BMC, le tri immunomagnétique et la construction de bibliothèques, servant de guide précieux, en particulier pour les nouveaux venus dans l’étude des neutrophiles.

Bibliothèque ATAC-Seq Préparation de neutrophiles dérivés de la moelle osseuse murine

Découvrez un protocole ATAC-seq optimisé pour réduire la contamination mitochondriale de 50% à moins de 3% dans les lymphocytes T CD4+ humains. Cette méthode diminue les coûts de séquençage de 50% et améliore la qualité des données.

ATAC-seq test ADN Mitochondrial faible contamination de primaires humaines CD4 + Lymphocytes T

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