Isolement et transfert adoptif de sel élevé traités des cellules dendritiques présentatrices d’antigène

Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines de l’hypertension et des maladies cardiovasculaires, y compris l’étude des cellules dendritiques positives CD11c et comment elles potentialisent le rôle des lésions hypertensives. Le principal avantage de cette technique est l’isolement des cellules dendritiques cd11c positives des organes solides et l’étude de leur rôle physiologique dans divers états de la maladie. Ainsi, ce processus peut être appliqué à plusieurs types de cellules immunitaires, y compris les lymphocytes B, lymphocytes T, monocytes et macrophages.

La visualisation de la technique est essentielle pour comprendre l’isolement cellulaire dendritique, en particulier le processus de transfert adoptif chez les souris receveurs. Pour commencer, vaporiser la poitrine et les côtés de la souris euthanasié avec 70% d’éthanol. Sur le côté gauche, ouvrez soigneusement la peau et la cavité péritonéale pour exposer la rate.

À l’aide de petits forceps, déplacez prudemment les intestins et le foie sur le côté gauche de la souris. Ensuite, utilisez de petits ciseaux pour exciser doucement la rate. Placer chaque rate excisée dans un tube C étiqueté contenant trois millilitres de RPMI 1640 moyen.

Ajouter d’abord collagène D et DNase à préparé RPMI 1640 moyen pour préparer la solution de digestion de la rate. Placez le tube C sur un homogénéiseur semi-automatisé et assurez-vous que le tube est bien placé sur le bras rotatif. Appuyez sur le bouton de démarrage sur l’homogénéiseur pour exécuter le protocole rate 04.01 pendant 60 secondes.

Après cela, détachez la tube de l’homogénéiseur et incuber les échantillons à 37 degrés Celsius sous continu à 20 rpm pendant 15 minutes. Ensuite, utilisez une pipette pour transférer la solution dans un tube conique de 50 millilitres après l’avoir filtrée à travers une passoire de 40 micromètres. Laver la passoire avec 10 millilitres de dPBS.

Centrifuger les cellules à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, aspirez complètement le supernatant et lavez la pastille en la suspendant de nouveau en 10 millilitres de dPBS. Centrifuger la suspension à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes.

Suspendre à nouveau la pastille cellulaire en cinq millilitres de dPBS. Utilisez un hémocytomètre et trypan exclusion bleue pour compter le nombre de cellules. Centrifugeuse suivante à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter les cellules.

Aspirez complètement le supernatant et suspendez complètement la pastille en 400 millilitres de tampon de tri cellulaire activé magnétiquement. Ajoutez ensuite 100 millilitres de microbilles CD11c par 100 millions de cellules. Vortex la suspension cellulaire et incuber pendant 10 minutes dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius.

Après cela, ajouter 10 millilitres de tampon MACs pour laver les cellules et la centrifugeuse à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez complètement le supernatant et suspendez les cellules en 500 millilitres de tampon MACs. Placez la colonne LS dans le champ magnétique du séparateur de mag et placez un tube conique de 15 millilitres sous chaque colonne pour recueillir le flux à travers.

Ensuite, rincez les colonnes avec trois millilitres de tampon. Placez la suspension cellulaire sur chaque colonne et recueillez le flux à travers lequel contient des cellules non étiquetées. Lavez les colonnes avec trois millilitres de tampon MACs et de recueillir les cellules non étiquetées qui passent à travers.

Lavez les colonnes LS deux fois de plus à l’aide de trois millilitres de tampon MACs par lavage. Après cela, retirez les colonnes LS du séparateur magnétique. Ajoutez cinq millilitres de tampon MACs à chaque colonne et plongez immédiatement chaque colonne dans un tube conique clair de 15 millilitres pour éliminer les cellules étiquetées magnétiquement.

Utilisez un hémocytomètre et une exclusion bleue Trypan pour déterminer le numéro CD11c cd positif tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Ensuite, diluer l’échantillon cellulaire à une dilution un à un dans 0,4%Trypan solution bleue. Tout d’abord, préparer les granulés cellulaires dans les médias de culture DC tels que décrits dans le protocole de texte.

Pipette 900 microlitres de la suspension DC en plaque de faucon à fond plat de 24 puits. Ajouter 100 microlitres des médias de culture dc à haute teneur en sel à chaque puits, pour une concentration finale de sodium de 190 millimolaires. Étiquetez la plaque et placez-la dans un incubateur humidifié de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant 48 heures.

Après 48 heures, retirer la plaque de l’incubateur. Pipette les supports de culture cellulaire dans un seul puits de haut en bas pour suspendre à nouveau le CD11c DCs positifs. Transférer toute cette suspension dans un tube correspondant étiqueté 1,6 millilitre.

Répétez cela pour chaque puits individuel qui a été plaqué. Centrifugeuse tous les tubes à 300 fois g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez le supernatant et suspendez la pastille DC avec 100 microlitres de dPBS stérile.

Ensuite, dessinez la solution DC de l’un des tubes dans une seringue d’un millilitre, équipée d’une aiguille d’un demi-pouce de calibre 27. Placez le mâle naïf de 10 semaines C57-black-6 souris sous 2%isoflurane pour atteindre un plan chirurgical stable. Vérifiez le niveau d’anesthésie avec un manque de réflexe de pédale.

Une fois qu’un plan chirurgical stable est atteint, introduisez lentement et soigneusement l’aiguille dans l’espace rétro-orbital à un angle d’environ 30 degrés. Injectez lentement et en douceur la suspension CD11c positive DC. Une fois l’injection terminée, retirez soigneusement l’aiguille pour l’espace rétro-orbital, en vous assurant de ne pas endommager l’œil.

Retirez ensuite les souris du cône nasal et surveillez-les pendant environ 30 minutes pendant la récupération de l’anesthésie. Une analyse typique de la pression artérielle est montrée ici après le transfert adoptif de CD et de mini pompes osmotiques qui ont été implantées pour l’infusion d’angiotensine II à faible dose. Il convient de noter que cette faible dose d’angiotensine II est une dose suppressrice qui n’augmente pas la pression artérielle chez une souris normale.

Les souris qui reçoivent des CD11c positifs CD11c traités normalement maintiennent une pression artérielle normale pendant l’infusion, tandis que les souris qui reçoivent des CD11c positifs CD11c traités à haute teneur en sel présentent une augmentation de la pression artérielle systolique. L’analyse de cytométrie de flux est alors effectuée en utilisant la stratégie de gating montrée ici pour déterminer la pureté des cellules positives isolées de CD11c. Un enrichissement accru des cellules positives CD11c est vu comparé aux splenocytes totaux.

Différentes concentrations de Microbilles CD11c sont utilisées pour dépanner le protocole du fabricant. Magnétique séparé des splenocytes à l’aide de 100 microlitres de Microbilles donne environ 65% des cellules cd11c positives, tout en utilisant 200 microlitres donne 55%et en utilisant 300 microlitres donne 50%An FcR bloqueur est inclus avec 100 microlitres de Microlitres. Après la séparation magnétique, le blocus du FcR donne environ 65% de cellules positives CD11c.

Certains splenocytes sont ensuite incubés avec 100 microlitres de Microlitres et séparés magnétiquement par une colonne LS. Les cellules séparées sont incubées avec 100 microlitres supplémentaires de CD11c et séparées à nouveau par une colonne LS. Ce double processus d’isolement a donné 92%CD11c cellules positives.

Lorsque vous essayez cette procédure, il est important de confirmer la pureté des cellules isolées par cytométrie d’écoulement. Après l’isolement magnétique des cellules dendritiques, ils peuvent être cultivés pour déterminer leur statut d’activation par des techniques moléculaires, y compris la protéomique et le séquençage à cellules simples. Depuis son développement, il est maintenant possible d’étudier la fonction et le rôle spécifique des cellules dendritiques dans l’hypertension.

Les chercheurs explorent maintenant les antigènes spécifiques dans l’hypertension.