Construction et utilisation d’une chambre de Stimulation électrique pour renforcer la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymateuses/stromales In Vitro

Ici, nous montrons comment construire une chambre de stimulation électrique en utilisant six plaques de culture murale commune, et comment l’utiliser afin de stimuler la différenciation ostéogénique dans les cellules souches mésenchymales. Cette chambre est facile et pas coûteuse à construire, et peut être réutilisée dans de multiples expériences. Après avoir été pré-traitées avec la stimulation électrique dans notre chambre, les cellules souches mésenchymales peuvent être employées pour améliorer des résultats dans des traitements d’ingénierie de tissu d’os.

Cette chambre peut également être utilisée pour étudier d’autres types de cellules et les comportements cellulaires électro-sensibles comme la migration, la prolifération, les changements dans le potentiel membranaire, l’apoptose et l’attachement soigneux. Dans un couvercle de six plaques de puits, marquer puis percer deux trous d’un millimètre de diamètre, à 25 millimètres l’un de l’autre, près du bord extérieur de chacun des six puits. Ensuite, couper un fil de platine en 12 sections de cinq centimètres de long.

Pliez manuellement chaque section de cinq centimètres en forme de L, laissant une extrémité de trois centimètres de long, et l’autre de deux centimètres de long. Ensuite, coupez le fil enduit d’argent en deux longueurs de 35 centimètres. Insérez l’extrémité plus longue et pliée d’un fil de platine dans le trou foré, laissant un à deux millimètres dépasser de l’extérieur du couvercle.

Pliez-le à l’aide de forceps. Par la suite, fixez les fils de platine dans les trous du couvercle avec de la colle super conductrice et laissez-les sécher pendant environ six heures. Pour préparer les cathodes, souder les extrémités des six fils de platine qui dépassent du couvercle à l’un des fils enduits d’argent.

Pour préparer les anodes, souder les six fils de platine restants à d’autres fils recouverts d’argent. Par la suite, ajoutez des LED dans le circuit entre chacune des six paires anode-cathode platine-électrode pour confirmer la fonctionnalité. Placez un morceau de ruban isolant noir sous chaque LED pour éviter d’exposer les cellules dans les plaques de culture à la lumière LED.

Ensuite, collez le connecteur de bloc terminal filaire au coin supérieur gauche du couvercle de la plaque de six puits et connectez les deux fils recouverts d’argent aux terminaux d’entrée. Ensuite, découpez une section carrée de 20 millimètres par 20 millimètres du coin supérieur gauche d’un deuxième couvercle de plaque de six puits, pour accueillir le connecteur de bloc terminal sur le premier couvercle. Couvrez le premier couvercle, équipé des électrodes, avec le deuxième couvercle, et collez-les avec du ruban adhésif.

Connectez une extrémité des deux fils de cuivre isolés standard aux terminaux de sortie du connecteur de fil, et l’autre extrémité aux connecteurs mâles de banane. Allumez l’alimentation électrique en appuyant sur le bouton ON-OFF sur le panneau avant. Activez le canal un en appuyant sur le bouton un.

Par la suite, appuyez sur le bouton quatre pour régler la tension. Réglez la puissance de charge à 2,5 volts. Appuyez ensuite sur Entrez.

Le jour où les cellules sont traitées avec la tige E, stériliser les électrodes dans la solution 70% éthanol pendant 30 minutes. Ensuite, séchez-les sous la lumière UV dans un coffret de sécurité pendant 30 minutes supplémentaires. Dans un capot d’écoulement laminaire, couvrir la plaque de six puits contenant les MSC cultivés avec le couvercle équipé des électrodes, en s’assurant que les électrodes sont complètement immergées dans le milieu.

Ensuite, transférez la plaque couverte de six puits avec des cellules à l’incubateur et connectez ses fils à l’alimentation électrique. Ensuite, réglez l’alimentation électrique à la sortie de charge de 2,5 volts et traitez les cellules avec la tige E pendant une heure. Après la stimulation, déconnecter l’alimentation électrique et retirer la chambre de tige E de l’incubateur.

Dans des conditions stériles, remplacer le couvercle, équipé d’électrodes, par un couvercle de plaque standard de six puits. Par la suite, retournez les cellules à l’incubateur et laissez-les toute la nuit. Nettoyez les électrodes, d’abord avec PBS, puis avec une solution 70% éthanol.

Ensuite, nettoyez les produits de corrosion accumulés de la surface de l’électrode avec du papier de verre fin. Répétez le traitement de la tige E pendant six jours consécutifs. Le quatrième jour, avant d’appliquer la stimulation électrique, et dans des conditions stériles, changer le milieu de culture en aspirant 1,5 millilitres de milieu et en le remplaçant par 1,5 millilitres de préchauffé, milieu de différenciation ostéogène fraîche.

Après avoir appliqué la stimulation électrique pendant sept jours consécutifs, maintenez les cellules en culture pendant sept jours supplémentaires, échangeant le milieu tous les trois à quatre jours. Lorsque le traitement est terminé, analyser les changements de morphologie cellulaire au microscope. Évaluer l’effet de la stimulation électrique sur la différenciation ostéogénique du MSC, mesurer le dépôt de calcium, l’activité alcaline de phosphatase et l’expression du gène marqueur ostéogénique, tel que décrit ailleurs.

Pour évaluer l’effet de 100 millivolts par millimètre de stimulation électrique sur la différenciation ostéogénique de MSC, des cellules traitées avec la stimulation électrique pendant trois, sept, et 14 jours et des cellules non traitées, ont été analysées au jour 14 de la culture en évaluant des changements morphologiques et des dépôts de calcium. Des changements significatifs dans la morphologie cellulaire et les dépôts de calcium étaient visibles dans les cellules traitées avec la stimulation électrique pendant sept et 14 jours. Une analyse détaillée des changements ostéogènes d’expression de gène de marqueur a été exécutée aux jours trois, sept, et 14 de la culture.

Au septième jour de la culture, l’expression de RunX2 était sensiblement plus élevée dans les cellules traitées avec la stimulation électrique pendant sept jours. Alors que l’expression colla1 était significativement plus élevée dans les cellules traitées pendant sept jours, mesurées au jour 14 de la culture. L’expression de l’osteopontin a été sensiblement augmentée dans les cellules électriquement stimulées aux jours trois, sept, et 14 de la culture.

L’expression d’Astérix était absente dans les cellules de contrôle à tous les points de temps, et a été vue seulement à sept et 14 jours de culture dans les cellules exposées à la stimulation électrique. La chambre de stimulation électrique est relativement facile à construire. Cependant, un soin particulier doit être pris lors de la manipulation des fils de platine, et aussi lors du nettoyage et la stérilisation des électrodes.

Les cellules prétraitées à l’électricité dans notre chambre, seules ou assises sur un échafaudage, pourraient être implantées dans des modèles animaux, afin d’étudier comment l’effet positif de la stimulation électrique persiste in vitro. Cette technique fournit un outil simple mais puissant pour étudier le mécanisme par lequel la stimulation électrique régule les fonctions cellulaires. Ces connaissances peuvent être disponibles dans les cellules de médecine régénérative.