Analyse par cytométrie en flux de vésicules extracellulaires de médias conditionné par cellule d’écoulement

Les vésicules extracellulaires sont de plus en plus utilisées comme biomarqueur diagnostique et outil thérapeutique potentiel dans de nombreux domaines. Flow Cytometric est la méthode analytique la plus simple pour caractériser par des marqueurs face à la combinaison ce protocole peut être utilisé dans l’analyse d’une particule assized, est rapide, et est applicable aux sismomètres conventionnels sans avoir besoin d’un réglage spécial ou l’instrument dédié. Bien que ce protocole soit utilisé pour catégoriser les vésicules extracellulaires à partir de cette condition et de ce milieu, il peut être élargi vers la catégorisation des VE arrivés dans le sang, pour remplacer les biopsies tissulaires invasives chez les patients.

Pour les chercheurs nouveaux au protocole, il est essentiel d’effectuer des étapes décrites dans la section méthode de mise en place, et de suivre de près les stratégies d’obtention démontrées Commencer par enduire 55 centimètres carrés Petri-plats avec 02% de gélatine de peau porcine, en PBS. Après 15 minutes, laver le plat et l’assiette 4,4 fois 10 à la cinquième cellule progénitrice cardiaque sur chaque plat en 7 millilitres de Medium, ou IMDM du Dulbecco modifié d’Iscove, complété par 20% de sérum bovin fœtal, et 1% de pénicilline et de streptocotomycine pour leur incubation à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence, laver les cultures deux fois avec pbs dulbecco sans calcium et magnésium et nourrir les cellules avec 10 milileters de sérum sans milieu de production exosome.

Après 7 jours, mettre en commun le milieu conditionné de chaque plaque en un seul tube de centrifugeuse en polypropylène et centrifugeuse le milieu pour enlever les débris cellulaires. Transférer le supernatent dans un tube de filtre centrifugeuse de 100 kilodaltons, et concentrer le milieu défriché, conditionné, avec une centrifugation supplémentaire. Transférer le concentré dans un tube de micro centrifugeuse pour une centrifugation finale et ajouter le supernatent dans un tube de micro centrifugeuse murale épaisse en polycarbonate.

Remplissez le tube de PBS, jusqu’à un volume final de 3,2 milileters, et chargez l’échantillon dans un rotor angélique fixe en titane. Chargez ensuite le rotor dans une ultracentrifugeuse de table pour l’ultracentrifugation, et réutilisez la pastille dans 100 microlitres de PBS frais. Pour le suivi et l’analyse des nanoparticules, diluer 1 microlitre de l’échantillon ultracentrifugé, dans 999 microlitres de PBS, et charger l’échantillon dans une seringue de 1 milileter sans bulles.

Chargez la seringue dans le port d’entrée de la chambre d’examen et allumez le laser. Utilisez le bouton de capture pour ouvrir la caméra et ajuster la mise au point. Enregistrez ensuite au moins trois images différentes de 60 secondes chacune, et utilisez l’option de traitement par lots dans le logiciel, pour analyser les trois acquisitions différentes.

Pour préparer l’échantillon à l’acquisition, ajoutez d’abord les perles de capture conjuguées expérimentales appropriées à un rapport de capture conjuguées à un rapport de 1:1:1, dans un tube de micro centrifugeuse, et vortexez le pool de perles de capture qui en résulte. Ensuite, ajoutez le volume approprié de l’échantillon à 1 microlitre de piscine de perles de capture pour générer un 1 fois 10 aux 8 particules plus 1,2 fois 10 à la 5e perle par concentration d’essai. Ajouter 1 microlitre de perles à un tube étiqueté perles comme le contrôle négatif, et ajuster le volume dans chaque tube à 100 microlitres avec PBS frais.

Placez ensuite les tubes dans un thermo-mélangeur, avec secousses, à 400 rotations par minute, et 4 à 10 Degrés Celsius, pendant la nuit. Le lendemain, transférez les échantillons dans une plaque ronde de 96 puits et ajoutez les anticorps conjugués à chaque puits. Après une incubation d’une heure à 4 à 10 degrés Celsius, ajoutez 100 microlitres de PBS à chaque puits et ouvrez le logiciel d’acquisition.

Sélectionnez cytomètre et système de démarrage de programme, pour démarrer l’instrument et ouvrir une nouvelle expérience. Créez un modèle expérimental, sélectionnez la plaque et ajoutez la plaque. Sélectionnez la position des échantillons sur la plaque, et cliquez sur ensemble ainsi que l’échantillon.

Entrez le nom de l’échantillon dans les règles de nommage, ouvrez l’onglet canal et sélectionnez les canaux de signal de florescence appropriés. Maintenant, chargez la plaque dans l’instrument. Et cliquez sur l’intrigue de point, pour créer une nouvelle zone de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de point de zone de dispersion latérale.

Sélectionnez paraphé pour démarrer le laser et les fluides et cliquez sur exécuter pour commencer l’acquisition. Ajustez l’échelle pour montrer la population au milieu de la parcelle de dispersion avant par rapport à la parcelle de dispersion latérale, et dessinez une porte de perles autour de toute la population de l’échantillon pour exclure les débris. Cliquez sur l’arrêt et la parcelle de points pour créer une hauteur de dispersion vers l’avant par rapport à la parcelle de points de la zone de dispersion vers l’avant, et portez l’échantillon sur la population de perles.

Dessinez une nouvelle porte autour de la plus grande population et nommez-la Singlets, et cliquez sur la parcelle de point pour créer un signal fluorescent par rapport à la parcelle de point de zone de dispersion latérale, par fluorophore expérimental utilisé. Portez la nouvelle parcelle de points sur les Singlets. Sélectionnez ensuite le nombre d’événements à enregistrer et sélectionnez enregistrement pour commencer l’acquisition expérimentale.

À la fin de l’analyse, chargez les fichiers d’acquisition dans le logiciel d’analyse approprié et ouvrez un nouveau protocole. Créez des diagrammes à points pour chaque fichier comme il vient de le démontrer, et réglez tout l’axe de dispersion à l’échelle linéaire, et tout l’axe florescent pour enregistrer l’échelle. Montrez ensuite la moyenne géométrique de florescence dans les canaux de signaux pertinents, pour calculer le changement complet de l’intensité moyenne de florescence, dans les différentes préparations de vésicule extracellulaire.

Après avoir testé différentes conditions pour définir la plus petite quantité totale de vésicules extracellulaires pour atteindre la phase exponentielle précoce d’une courbe moyenne d’intensité de florescence, le nombre minimum de particules a été déterminé à être 1 fois 10 à 8 particules par coloration. La concentration optimale d’anticorps pendant 1 fois 10 à 8 particules pour atteindre le signal le plus élevé sans liaison anticorps non spécifique, a été déterminée à 10 microgrammes par millilitre pour les anticorps anti-CD9_FITC et anti CD63_PE et cinq microgrammes par millilitre pour l’anticorps anti-CD81_PE. Pour confirmer l’adéquation de la méthode, pour analyser les vésicules extracellulaires en forme de tasse, et non les débris membranaires, les vésicules extracellulaires ont été sonicated, ayant pour résultat une diminution de l’intensité moyenne de florescence, après aussi peu que 30 secondes de sonication, sans florescence détectée du tout après une minute de perturbation mécanique.

La propre purification de X à partir de cellules progénitrices cardiaques, comme démontré, donne des vésicules extracellulaires, exprimant de faibles niveaux de CD9 et des niveaux élevés de CD63 et CD81 des deux populations cellulaires. En outre, alors que les marqueurs de surface de X sont clairement identifiables sans ultracentrifugation, cette étape d’enrichissement améliore considérablement l’intensité moyenne de florescence de ces marqueurs. Lorsque vous travaillez avec des vésicules extracellulaires, il y a plus de granulés de nanoparticules négligents qui peuvent être facilement manqués.

Par conséquent, il est essentiel de suivre toutes les étapes telles qu’démontrées dans le protocole. L’utilisation de vésicules extracellulaires comme biomarqueur est maintenant l’une des recherches sur le terrain les plus émergentes. Et bientôt, peut être traduit dans le diagnostic clinique utilisé comme un outil de dépistage alternatif.