Un écran de suppresseur de Deep-séquençage-assisted, spontanée chez la levure Scissipare Schizosaccharomyces pombe

Ce protocole décrit un écran suppresseur simple et efficace pour identifier les mutations suppressrices chez les mutants qui ont un défaut de croissance dans la levure de fission. Les méthodes traditionnelles de mutagenèse utilisent des produits chimiques toxiques ou UV qui peuvent générer de multiples mutations dans une cellule. Inversement, ce protocole peut enrichir un mutant suppresseur unique dans les cellules individuelles sans utiliser de méthodes induisant la mutation.

Commencez cette procédure par la construction et la préparation des souches telles que décrites dans le protocole textuel. Ajouter 200 microlitres de liquide à chaque puits d’une microplaque en polystyrène de 96 puits. À l’aide d’un applicateur stérile, prenez une petite quantité de chacune des colonies préparées et suspendez chaque colonie dans des puits individuels qui contiennent les liquides.

Inclure un puits vide pour chaque rangée sur la plaque contenant 200 microlitres du même média. Configurez maintenant le protocole sur le logiciel de détection des lecteurs de plaques connecté à un lecteur de microplaque automatisé. Réglez la température à 30 degrés Celsius et définissez un programme cinétique pendant 24 heures avec une fréquence de lecture de deux minutes.

Il en résulte 721 lectures totales sur une période de 24 heures par puits. Réglez la secousse à la secousse orbitale rapide continue. Réglez les lis optiques pour mesurer la dispersion de la lumière à une longueur d’onde de 600 nanomètres pour mesurer la densité optique et régler la lumière à lire sous la plaque.

Après 24 heures, enregistrez les dernières lectures de densité optique vierge et utilisez la formule du protocole texte pour déterminer le volume nécessaire pour diluer chacun des échantillons jusqu’à une densité optique de 0,1. Pour traiter par lots le volume de dilution à utiliser à partir de chaque puits expérimental, exportez les données à partir du logiciel de lecteur de plaques et utilisez un logiciel de feuille de calcul pour insérer la même formule qu’une fonction. Toutes les 24 heures, utilisez le même média que le jour zéro pour diluer chacun des échantillons à une densité optique de 0,1 en utilisant la formule.

Assurez-vous d’utiliser la formule pour diluer tous les puits jusqu’à une densité optique de 0,1. Cela inclut les puits qui ont peut-être commencé à montrer une certaine reprise de leur défaut de croissance. Enregistrez toutes les courbes de croissance générées quotidiennement.

Notez toute colonie individuelle qui montre un taux de croissance accru jugé par une densité optique finale qui est significativement plus élevée que le reste de la cohorte ayant le même fond génétique ou par une courbe de croissance similaire à celle des colonies de type sauvage. Cet essai prend habituellement environ sept à 14 jours. Effectuez toutes les étapes dans des conditions stériles.

Dès le dernier jour de l’analyse du lecteur de plaques, certaines cultures liquides ont un taux de croissance sensiblement récupéré vraisemblablement en obtenant une mutation suppressrice qui peut soulager le phénotype de la mutation parentale. Pour stocker les cultures phénotypiquement récupérées, transférez et mélangez 250 microlitres de culture liquide à un cryotube contenant 250 microlitres de 50% glycérol. Flash congeler les cellules dans l’azote liquide et sauver les souches en moins 80 degrés Celsius indéfiniment.

Pour confirmer que la mutation suppressrice est un élément génétiquement héréditaire, utilisez des méthodes de croisement génétique standard pour croiser vos cellules P mutantes préférées avec vos cellules mutantes S préférées. Lorsque deux cellules haploïdes avec un type d’accouplement complémentaire sont mélangées et soumises à la famine de l’azote, elles peuvent générer un zygote qui sporule pour former un tétrad de quatre spores. Le matériel génétique parental se séparera pendant la méiose suivant les règles de la génétique mendélienne.

Après la sporulation, les spores individuelles des mêmes tétrads peuvent être disséquées et former quatre colonies individuelles observées verticalement sur une plaque. Placez uniformément les spores une par une sur la plaque à l’aide d’un microneedle. Après la dissection, laisser les cellules se développer dans un incubateur de 30 degrés Celsius pendant quelques jours jusqu’à ce que les colonies apparaissent.

Si la mutation suppressrice est un élément génétiquement héréditaire, cette croix devrait produire des tétrads dans lesquels deux colonies ont le phénotype de la maladie de la souche parentale et deux colonies ont le taux de croissance de récupération de la souche suppresseur. Choisissez trois colonies avec le phénotype suppresseur et trois colonies avec le phénotype parental de la même croix génétique et procédez aux étapes génomiques d’extraction et de séquençage de l’ADN telles que détaillées dans le protocole textuel. Effectuez ensuite une analyse bioinformatique pour l’identification des mutations suppressrices telle que détaillée dans le texte.

Des courbes de croissance des colonies individuelles ont été enregistrées au point de temps initial et pendant six jours avec une surveillance continue à l’aide du lecteur de plaques. Comme prévu, les colonies de type sauvage ne montrent aucun changement notable dans leurs courbes de croissance tout au long de l’expérience. Notamment, quatre colonies avec le fond de suppression elf1 et une colonie de suppression fal1 montrent un changement spectaculaire dans la croissance de la croissance lente à certains niveaux variables de croissance similaire à celle des colonies de type sauvage.

De façon spectaculaire, tous les mutants clr6 montrent une récupération phénotypique constante de plus en plus à un rythme plus rapide à la fin de l’essai. Deux des changements non synonymes identifiés, la mutation cue2 et la mutation rpl2702 ont été reconstruits en laboratoire à l’aide de protocoles standard pour la mutagenèse dirigée par le site. Cue2 elf1 mutants doubles et rpl2702 elf1 mutants doubles ont été croisés avec la souche mutante elf1 gratuit suppression.

Le croisement génétique a prouvé que les mutations identifiées de suppresseur réussissent en supprimant le phénotype lent croissant du mutant elf1 de suppression et sont héréditaires. Lors de la dilution quotidienne de la plaque de 96 puits, il est important de diluer tous les puits à la même concentration afin d’éviter une récupération artificielle de la croissance. Cette méthode permet l’isolement des mutations suppressrices d’une manière à haut débit accélérant la découverte de centaines de gènes qui n’ont pas été bien caractérisés dans la levure de fission et d’autres micro-organismes.

Cette méthode peut être utilisée pour isoler les suppresseurs pour tous les micro-organismes qui ont une mutation causant un défaut de croissance et qui peuvent être cultivés à une grande population dans la culture liquide. L’identification des mutations suppressrices dans la levure de fission pourrait avoir des implications potentielles en trouvant des gènes pathogènes dans les voies qui se chevauchent, surtout quand il s’agit de voies fortement conservées de la levure à l’homme.