Name: Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Découvrez une technique rigoureuse pour extraire et isoler les vésicules extracellulaires à partir de tissus entiers, y compris des tumeurs cérébrales et pulmonaires. Cette méthode permet une caractérisation morphologique et immunophénotypique approfondie.

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Les auteurs remercient Dr Richard Nowakowski et la Floride état Université laboratoire Animal ressources pour fournir et prendre soin des animaux utilisés afin d’élaborer ce protocole, respectueusement. Nous remercions Liu Xia, Dr Rakesh Singh et la Florida State University translationnelle Science Laboratory d’assistance avec le œuvre de spectrométrie de masse utilisée pour la caractérisation de la vésicule en aval, ainsi que la facilité aus Biological Sciences Imaging Resource l’utilisation du microscope électronique à transmission dans cette étude. Enfin, nous remercions le Dr Mandip Sachdeva (Florida A & M University) pour don des spécimens tumeur utilisés dans le développement de cette méthode. Cette étude a été financée par des subventions de la Floride ministère de la santé Ed et Ethel Moore Alzheimer maladie recherche programme attribué à D.G.M. et J.M.O (6AZ11) et le National Cancer Institute de la National Institutes of Health, sous le numéro Award R01CA204621 attribué à D.G.M.

Cerveau entier ont été obtenus avec l’approbation de l’Institutional Animal Use et soin Comité (IACUC) de l’Université d’Etat de Floride. Un total de douze cerveaux de souris (3 cerveaux de chaque groupe d’âge : 2, 4, 6 et 8 mois) d’un J C57BL/6 fond ont été utilisés pour l’extraction de EV, comme précédemment décrit16. Les échantillons de tumeur pulmonaire ont été généreusement donnés par Dr Mandip Sachdeva sous approbation de la Florida Agricultural and IACUC mécanique de l’université. Tumeurs pulmonaires ont été dérivées de la lignée de cellules d’adénocarcinome humain H1975 cultivé en Balb/c nu/nu nue des souris immunodéficientes. Données provenant de deux répétitions de tumeur représentatifs sont mises en évidence dans cette étude.
Remarque : Un aperçu schématique de la méthode d’isolement et de purification de vésicule est fourni à la Figure 1.
1. tissu Dissociation et Centrifugation différentielle
<ol><li>Préparer 10 mL de tampon de dissociation (10 mg de papaïne, 5,5 mM de L-cystéine, 67 µM 2-mercaptoéthanol ; 1,1 mM EDTA) dans un milieu Hibernate-E par environ 0,4 à 1,0 g de tissu. Notez que toutes les solutions utilisées pour la purification et l’enrichissement de l’EV doivent être diluées dans l’eau filtrée ultrapure.</li>
	<li>Ajouter des tissus entiers frais ou congelés au tampon de dissociation dans un tube conique de 50 mL et incuber dans une eau chaude bain à 37 ° C pendant 20 min. de tissu peut être coupé en fragments plus petits avant incubation si nécessaire.</li>
	<li>Après l’incubation, ajouter des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour une concentration finale de 1 x vers le tampon de dissociation contenant le tissu.</li>
	<li>Versez la solution contenant le tissu dans un homogénéisateur de Dounce loose-fit et doucement se dissocient les tissus à l’aide d’environ 30 coups lents par exemple. Le nombre de traits peut-être être ajusté en fonction sur la cohérence du tissu.</li>
	<li>Tissu de transfert dissocié dans le tampon d’un tube conique de 50 mL et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 ° C pour granuler les cellules et les fragments restants de tissu fibreux ou cohésifs.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un tube à fond conique propre de 50 mL et centrifuger à 2 000 x g pendant 10 min à 4 ° C à pellet et jeter les gros débris cellulaires.</li>
	<li>Transférer le surnageant à nouveau à un tube à fond conique propre de 50 mL et centrifuger à 10 000 x g pendant 40 min à 4 ° C pour granuler indésirables plus grandes vésicules ou corps apoptotiques petit. Remarque : Cette pastille peut être enregistrée pour une étude supplémentaire de grandes vésicules si vous le souhaitez.</li>
	<li>Éliminer le surnageant à travers un filtre de 0,45 µm dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL. Remarque : Échantillons de tissu fibreux dense ne peuvent être facilement été filtrés. Ces échantillons peuvent être filtrés à travers un tamis de cellule 40 µm, puis transmises en série de petites aiguilles (18 G, 20 G, 22 G) avant de filtrer à travers le filtre de 0,45 µm.</li>
	<li>Ultracentrifugeuse l’échantillon à 100 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour granuler petits EVs.</li>
	<li>Éliminer le surnageant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant 5-10 min, taraudage fréquemment pour éliminer le liquide résiduel sur les côtés des tubes. Liquide résiduel peut aussi être aspiré à l’aide d’une pipette à aspiration sous vide.</li>
	<li>Resuspendre le culot de EV en 1,5 mL de tampon de saccharose de 0,25 M (10 mM Tris, pH 7,4). Il est important de s’assurer la complète remise en suspension de l’extrait concentré dans cette étape. Pour ce faire, couvrir les tubes avec parafilm avant vortex EVs en solution. Roche l’ultracentrifugeuse tubes pendant 15-20 min à température ambiante avant un mélange final vortex.</li>
	<li>Brièvement centrifuger les tubes à une vitesse pas plus de 1 000 x g pour récupérer la liquide de la suspension au fond du tube.</li>
	<li>Passez à la procédure de purification gradient ci-dessous, ou le cas échéant, Ranger EV suspension à 4 ° C durant la nuit.</li>
</ol>2. Purification de Gradient de densité
<ol><li>Ajouter 1,5 mL d’iodixanol de 60 % (solution dans l’eau) vers la mémoire tampon saccharose/Tris de 1,5 mL contenant des EVs pour créer une solution finale contenant 30 % iodixanol. Pipetter vers le haut et vers le bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution. Faire preuve de prudence pour éviter de perdre la solution dans l’embout de la pipette, comme la concentration élevée d’iodixanol est assez visqueuse.</li>
	<li>Transférer la solution tampon d’iodixanol 30 % EVs au fond d’un tube d’ultracentrifugation 5,5 mL.</li>
	<li>Préparer au moins 1,5 mL de 20 % et 10 % d’iodixanol solutions par échantillon dans de l’eau ultrapure de la solution mère d’iodixanol de 60 %.</li>
	<li>Mesurer 1,3 mL d’iodixanol de 20 % et soigneusement calque au-dessus du calque de fond dégradé à l’aide d’une seringue et une aiguille 18 G. Pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité, garder le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube ultracentrifugation juste au-dessus du ménisque et ajouter la solution goutte à goutte.</li>
	<li>Couche de 1,2 mL de solution d’iodixanol de 10 % sur le dessus de la couche d’iodixanol de 20 % en utilisant la même technique que ci-dessus.</li>
	<li>Soigneusement équilibrer et charger les tubes d’ultracentrifugation dans les seaux de rotor et centrifuger à un rotor de swing-seau à 268 000 x g pendant 50 min à 4 ° C. Définir la vitesse d’accélération et de décélération de la centrifugeuse aux taux minimal autorisé pour éviter une désorganisation dans les couches de densité.</li>
	<li>Dix tubes de microcentrifuge de 1,5 mL pour chaque échantillon afin de correspondre à des fractions de 1 à 10 de la gradient de densité de l’étiquette. Fraction 1 est désignée comme la fraction supérieure qui sera tout d’abord supprimée, tandis que la fraction 10 est la fraction de fond dernière retirée.</li>
	<li>Une fois terminée l’ultracentrifugation dégradée, délicatement retirer les tubes des seaux de rotor et placer dans un support stable. On constatera souvent une bande visible des vésicules dans la fraction d’intérêt. Pipetter dix fractions séries de 490 µL du haut de la pente dans les tubes correspondants. Il y aura une petite quantité de liquide restant au fond du tube qui contient probablement des protéines contaminantes. Cet exemple peut être mis au rebut, ou conservé sous forme de fraction 11 si vous le souhaitez.</li>
	<li>Mesurer les indices de réfraction des fractions à l’aide d’un réfractomètre. C’est possible aussi avec un dégradé de contrôle s’exécuter en parallèle si la conservation de l’échantillon est nécessaire. Distribuer 20-30 µL de chacune des fractions contenant iodixanol sur la surface du réfractomètre et d’estimer la densité en comparant les indices de réfraction à densités connues iodixanol. Notez que fractions peuvent être stockées pendant la nuit dans la solution contenant de l’iodixanol si nécessaire avant de passer à la prochaine étape de lavage d’ultracentrifugation.</li>
	<li>Transférer chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 mL. Ajouter 5 mL de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS ; 137 mM NaCl, KCl, 2,7 mM 10 mM Na2HPO4mM 2 KH2PO4, pH 7,4) au tube et mélanger en pipettant également lentement de haut en bas. Remarque : PBS ajoutés aux échantillons devrait être exempt de particules, assurée par filtrage de PBS stérile à travers un filtre de 0,22 µm et stocker à température ambiante pour éviter la précipitation de sel.</li>
	<li>Ajoutez une autre 6 mL de solution 1 PBS x au début et à nouveau mélanger soigneusement.</li>
	<li>Ultracentrifugeuse les tubes à 100 000 x g pendant 2 h à 4 ° C pour re-granuler petites vésicules. Éliminer le surnageant et tapoter les tubes secs avant la lyse des vésicules pour l’analyse des protéines (étape 3) ou de la remise en suspension des véhicules électriques pour l’analyse morphologique (étape 5).</li>
</ol>3. lyse et Immunoblot Confirmation des protéines EV
Remarque : Si la conservation des vésicules entières pour caractérisation morphologique ou activité biologique est souhaitée, chercheurs peuvent procéder directement à l’étape 5. Dans les premières expériences, ou avant l’analyse par spectrométrie de masse, toutes les fractions récupérées devraient être analysées par immunoblot pour confirmer des fractions avec des protéines de l’EV.
<ol><li>Pour lyser EVs pour analyse des protéines, ajouter 40 µL de tampon de lyse forte (5 % SDS, 10 mM EDTA, 120 mM Tris-HCl pH 6,8, 2,5 % de 2-mercaptoéthanol, urée 8 M) avec l’ajout de l’inhibiteur de protéase à pellet EV en tube ultracentrifugeuse. Remarque : Si non réductrice des conditions sont nécessaires pour la détection des anticorps des protéines, remplacer l’eau ultrapure pour le 2-mercaptoéthanol dans le tampon de lyse forte.</li>
	<li>Assurer la complète remise en suspension des granulés et lyse des EVs dans le tampon en plaçant parafilm sur l’ultracentrifugation tube, vortex vigoureusement, puis bascule pendant 20 min à température ambiante avant un vortex final.</li>
	<li>Centrifuger brièvement à 1 000 x g pendant 30-60 s pour récupérer le volume de l’échantillon entier. Transférer l’échantillon dans un nouveau tube de microtubes de 1,5 mL et les conserver à-20 ° C à-80 ° C jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.</li>
	<li>Pour préparer les lysates purifiés pour l’analyse par immunotransfert, ajouter 5 x Laemmli solution tampon (10 % SDS, 250 mM Tris pH 6,8, 1 mg/mL de bleu, de bromophénol 0,5 M DTT, glycérol à 50 %, 5 % de 2-mercaptoéthanol) pour les échantillons destinés à une concentration finale de 1 x. Remarque : Si vous désirez des conditions non réducteur, remplacer le DTT et le 2-mercaptoéthanol avec de l’eau ultrapure.</li>
	<li>Si l’homogénat tissulaire tout contrôles sont souhaitées, lyse le tissu dans l’urée contenant fort tampon de lyse détaillés ci-dessus avec inhibiteur de protéase, puis centrifuger à 10 000 g pendant 10 min à jeter le reste de la matrice extracellulaire, cellules entières, ou débris cellulaires intacts. Ajouter 5 x Laemmli solution tampon à l’homogénat tissulaire pour une concentration finale de 1 x.</li>
	<li>Faire bouillir la solution tampon contenant des échantillons de l’homogénat EV ou tissulaires à 95 ° C pendant 5-10 min, puis charger le volume égal (de l’équivalent de 0,1 et 0,3 g de démarrage de matériel tissulaire ; 1 à 2 µg de protéine purifiée de EV) des fractions 1-10 en gel SDS-PAGE 10 %. Charger une masse égale d’homogénat tissulaire. Accroître le volume d’échantillons peut être nécessaire pour la détection par anticorps moins sensibles.</li>
	<li>Procéder à l’électrophorèse sur gel et analyse par Western blot comme précédemment détaillées21 pour confirmer les protéines EV dans les lysats purifiés et comparer l’abondance relative d’EV dans les fractions. Remarque : Une fois que la protéine EV a été démontrée reproductible dans les fractions cohérentes, le lavage final ultracentrifugation décrit dans étape 2.12 peut être limité aux fractions gradients d’intérêt.</li>
</ol>4. Quantification des protéines EV
<ol><li>Utiliser un test compatible détergent et urée fluorescence si sensible quantification des protéines EV est souhaitée pour une analyse plus approfondie (voir Table des matières). Notez que certains tests basés sur la fluorescence sont compatibles avec le bleu de bromophénol présent dans le tampon de Laemmli échantillon, facilitant lyse directe du culot EV (en étape 2.12) dans cette mémoire tampon si vous préférez.</li>
	<li>Si le kit de quantification de ladite protéine basés sur la fluorescence est utilisé, spot 1 µL de l’échantillon ou de la norme au moins dupliquer sur du papier filtre fourni et continuer la quantification des protéines selon les instructions du fabricant.</li>
</ol>5. caractérisation de la morphologie de l’EV
<ol><li>Pour examiner les vésicules entières après la centrifugation finale lavez dans étape 2.12, soigneusement resuspendre EV culot en particules libres 1 x PBS. Magasin EVs à 4 ° C pour pas plus d’une semaine avant le traitement pour éviter les cycles de gel-dégel. Remarque : Il est bénéfique pour ont déjà confirmé les fractions contenant constamment enrichi de protéines EV par immunobuvardage de limiter les analyses morphologiques aux fractions d’intérêt.</li>
	<li>Effectuer des nanoparticules suivi d’analyse sur des échantillons de EV ensemble pour déterminer la concentration et la taille des vésicules dans les préparations, comme précédemment détaillées22.</li>
	<li>Caractériser la morphologie EV et confirmer les mesures de taille par microscopie électronique des vésicules, si vous le souhaitez. EM grilles peuvent être préparés à partir de suspensions de vésicule suite 5.1 étape23, ou alternativement, peuvent être traitées comme bloc préparations24 de boulettes suivant étape 2.12.</li>
</ol>6. en gel Purification et Digestion Trypsique pour analyse par spectrométrie de masse
<ol><li>Si vous souhaitez caractérisation des protéomes EV par spectrométrie de masse, charge masse égale (au moins 10 µg de protéines) des fractions contenant des EVs dans un préfabriqué sur gel de polyacrylamide pour séparer et purifier les protéines. Fabricant fourni préfabriquées gels sont préférables pour réduire les niveaux de potentiel contaminant des protéines (p. ex., kératine) introduits dans les échantillons.</li>
	<li>Exécuter l’exemple au moins 0,5 pouces dans le gel de polyacrylamide pour la purification de la protéine, puis fixer et colorer avec un colorant bleu de Coomassie, comme décrit dans le détail,25.</li>
	<li>Couper les voies en 1 mm3 cubes pour la digestion trypsique, comme précédemment détaillées19,26.</li>
	<li>Charger 5 µL de l’échantillon digéré peptide en instrument de LC-MS/MS pour la séparation sur la colonne analytique et l’analyse ultérieure par spectrométrie de masse selon les paramètres spécifiés dans le détail,16.</li>
</ol>

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<li>Lötvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions%3A+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913(2014).</li>
<li>Thakur, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-stranded+DNA+in+exosomes%3A+a+novel+biomarker+in+cancer+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection.</a> Cell Research. 24 (6), 766-769 (2014).</li>
<li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nature Communications. 2, 180(2011).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature Cell Biology. 10 (12), 1470-1476 (2008).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+distinct+nanoparticles+and+subsets+of+extracellular+vesicles+by+asymmetric+flow+field-flow+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Identification of distinct nanoparticles and subsets of extracellular vesicles by asymmetric flow field-flow fractionation.</a> Nature Cell Biology. 20 (3), 332-343 (2018).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Intérêt scientifique s’est dégagé en ce qui concerne les rôles Qu'evs petits jouent dans le microenvironnement de la tumeur, ainsi que dans la fonction, la maturation et le développement de l’orgue. Dans l’ensemble, cette étude fournit un flux de travail optimisé pour l’extraction du SVE intact du cerveau entier ou les échantillons de tumeur. Alors qu’ici nous avons tout simplement démontrer l’applicabilité de cette technique au poumon dérivées de tumeurs SVE, cette méthode pourrait facilement être adaptée pour des trava...

Petites vésicules extracellulaires (EVs) incluent exosomes dérivés endosomale et petite membrane-hangar microvésicules qui sont d’intérêt biomédical en général. Petits EVs sont composées d’une population hétérogène de 50 à 250 nm membranaires vésicules contenant des protéines biologiquement actives, des lipides et des acides nucléiques qui sont censés collectivement jouent un rôle important dans une multitude de processus morbides. Faire avancer la recherche a impliqué notamment ces vésicules neurodégénératives et maladies à prions, processus infectieux, conditions autoimmunes ou inflammatoires et la croissance tumorale et métastase1,2,3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13. essor de la recherche biomédicale dans la signification du SVE dans la pathogenèse de la maladie a suscité un intérêt parallèle à l’élaboration des méthodes reproductibles et rigoureux pour l’isolement et la purification de ces vésicules.
Un défi historique et actuel dans la caractérisation de l’EV a été l’incapacité de séparer entièrement petites sous-populations EV. Ce défi est en grande partie en raison de notre compréhension limitée des différents mécanismes moléculaires régissant la biogenèse des vésicules distinctes. Chevauchement de taille, densité et biologiques marchandises entre sous-populations plus matérielle de ces distinctions. Partie de ce défi a été également l’utilisation de différentes techniques d’enrichissement largement, offrant des incohérence dans l’analyse en aval de vésicules isolées dans les laboratoires et saper l’effort mondial visant à éclairer les populations EV catégoriques.
Il est à noter que la majorité des EV caractérisation a été effectuée de la collection in vitro de culture cellulaire surnageante, avec les plus récentes études in vivo, décrivant des techniques pour isoler les vésicules de sécrétions animales ou humaines, y compris plasma, urine et la salive. Alors que le serveur virtuel Exchange est présents en grande quantité en circulation, il est également reconnu que ces vésicules jouent un rôle important dans les événements de communication de cellule-cellule et sont présents dans l’interstitium des tissus cellulaires. Dans le contexte du cancer, EVs interstitielles peuvent être particulièrement importants dans la modulation du microenvironnement tumoral pour cellule cancéreuse semis et croissance métastatique14,15. Par conséquent, il y a valeur dans le développement et l’optimisation des techniques pour extraire des vésicules d’échantillons de tissus solides. Ces méthodes fournira un moyen d’étudier directement orgue - ou tumeur dérivée EVs récoltées à partir des échantillons cliniques, y compris les petites biopsies et résection partielle ou totale des organes.
Dans cette étude et dans un précédent rapport, publié par notre laboratoire16, nous avons pour objectif d’aborder plusieurs grandes préoccupations actuelles dans la méthodologie d’enrichissement EV : 1) pour décrire une technique reproductible pour isoler et purifier les EVs au plus haut niveau actuellement acceptée dans le domaine ; 2) pour tenter d’isoler les petites sous-populations EV fortement enrichies en dérivés endosomale exosomes ; et 3) de fournir un protocole pour l’extraction de ces vésicules provenant d’échantillons de tissu solide aux fins de la caractérisation plus loin.
Récemment, Kowal et collègues ont décrit un gradient de densité relativement petits iodixanol pour séparer et purifier les sous-populations EV avec une plus grande efficacité que saccharose comparables densité dégradés17. Dans l’étude citée, les EVs de culture cellulaire dendritiques capturés en une fraction de densité relativement légers, compatible avec une densité de 1,1 g/mL, ont été fortement enrichis en protéines endosomale censés être plus compatible avec une forte proportion des exosomes présent dans cette fraction. Selon les auteurs, ces protéines exosomal « bona fide » incluent gène de susceptibilité tumeur 101 (TSG101), syntenin-1, CD81, ADAM10, EHD4 et plusieurs annexin protéines17. Plus tard, nous avons adapté cette technique pour réussir une méthode de dissociation tissulaire décrite par Perez-Gonzalez et al.18 et un protocole de centrifugation différentielle suivantes pour isoler ensemble encéphales EVs16. Nous avons aussi démontré l’utilité de cette méthode pour la caractérisation des protéomes EV en combinant un protocole séquentiel pour la spectrométrie de masse quantitative et comparative en aval de protéine vésiculaire, déjà décrite par notre laboratoire19. Ce travail est parallèle à celle du laboratoire Hill, où EVs ont été enrichies du cortex frontal du cerveau20.
Dans cette étude, nous avons des précisions sur cette technique et étendre l’application du protocole a récemment publié dans notre laboratoire à l’isolement du SVE de tumeurs pulmonaires solide. À notre connaissance, c’est la première étude pour décrire un protocole afin d’enrichir les EVs d’ex vivo les échantillons de tumeur. Compte tenu de l’intérêt général suscité par EVs comme nouveaux biomarqueurs diagnostiques et leur rôle dans la tumorigenèse, cette méthode s’avérera sans doute précieuse pour un nombre croissant de chercheurs scientifiques. D’un point de vue clinique, EVs interstitielles pourraient abriter grande valeur diagnostique, en particulier dans les échantillons où évaluation histologique l'est limitée. Notre espoir est que la méthode décrite ici constituera un fondement pour une technique reproductible pour récolter des EVs des échantillons frais ou congelés animales ou humaines chirurgicales, ouvrant la voie à des travaux futurs découvrir le rôle important dans la pathogenèse de la maladie ces petites les vésicules peuvent jouer.

<table><tbody><tr><td>0,45 et micro ; Filtre m</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>12 mL tubes à ultracentrifuger</td><td>Beckman Coulter</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>5,5 mL Beckman</td><td>Coulter</td><td>344057</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Alix</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7129</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-Calnexin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-11397</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD63</td><td>Abcam</td><td>ab59479</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-CD81</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9158</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-flottilline 2</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25507</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-HSC70</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7298</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-synténine-1</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100336</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-TSG101</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7964</td><td></td></tr><tr><td>EZQ kit de quantification des protéines</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R33200</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-6-30 rotor&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>5820715006</td><td></td></tr><tr><td>FEI CM120 Microscope électronique</td><td>TSS Microscopie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-lapin IgG (fragment Fab)</td><td>Genetex</td><td>27171</td><td></td></tr><tr><td>HALT inhibiteur de phosphatase (solution 100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78420</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase HALT (solution 100x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78438</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate E medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1247601</td><td></td></tr><tr><td>MLS-50 rotor à godet oscillant</td><td>Beckman Coulter</td><td>367280</td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-XP Ultracentrifugeuse de paillasse&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>393315</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-100 ultracentrifugeuse</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94516</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td>60 % iodixanol en solution d’eau stérile</td></tr><tr><td>Q Exactive HF Mass Spectrometer ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-goat IgG</td><td>Genetex</td><td>26741</td><td></td></tr><tr><td>rabbit anti-mouse IgG</td><td>Genetex</td><td>26728</td><td></td></tr><tr><td>Refracto 30PX (réfractomètre)</td><td>Mettler Toledo</td><td>51324650</td><td></td></tr><tr><td>S-4-104 rotor</td><td>Eppendorf</td><td>5820759003</td><td></td></tr><tr><td>SW 41 Ti swinging-bucket Rotor</td><td>Beckman Coulter</td><td>333790</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table 5804R</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td></td></tr></tbody></table>

extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Extraction of Extracellular Vesicles from Whole Tissue

Circulation et interstitielles petits extracellulaires vésicules membranaires (EVs) représentent des cibles prometteuses pour le développement de tests de nouveaux biomarqueurs diagnostiques et pronostiques et probablement servent comme des acteurs importants dans la progression d’un vaste éventail de maladies. La recherche actuelle est axée sur la caractérisation des vésicules sécrétées par les cellules multiples et les types de tissus afin de mieux comprennent le rôle des véhicules électriques dans la pathogenèse de conditions, y compris la neurodégénérescence, l’inflammation et le cancer. Cependant, les techniques à l’échelle mondiale cohérentes et reproductibles pour isoler et purifier les vésicules demeurent en cours. En outre, méthodes d’extraction d’EVs de tissu solide ex vivo sont guère décrits. Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour extraire l’EVs petits intérêt de tissus entiers frais ou congelés, y compris des échantillons de cerveau et tumeur, pour davantage de caractérisation. Nous avons démontré la capacité d’adaptation de cette méthode pour plusieurs analyses en aval, y compris la microscopie électronique et immunophénotypiques caractérisation des vésicules, ainsi que la spectrométrie de masse quantitative des protéines EV.

Un aperçu schématique de la dissociation tissulaire, centrifugation différentielle et gradient purification des vésicules est affiché à la Figure 1. La confirmation morphologique et immunophénotypiques des EVs purifiés par gradient est mis en évidence dans la Figure 2. Un schéma des densités reproductibles après ultracentrifugation du gradient iodixanol 10 à 30 % est donné, avec deux populations distinctes de vésicules migrent ve...

Ici, nous fournissons un protocole détaillé afin d’isoler les petites vésicules extracellulaires (EVs) de tissus entiers, y compris des échantillons de cerveau et la tumeur. Cette méthode offre une technique reproductible pour extraire les EVs de tissu plein pour approfondir les analyses en aval.

Extraction des vésicules extracellulaires du tissu entier

Circulating and interstitial small membrane-bound extracellular vesicles (EVs) represent promising targets for the development of novel diagnostic or ...

Ce protocole fournit une technique rigoureuse et reproductible pour l’extraction et l’isolement des petites vésicules extracellulaires provenant de spécimens de tissus entiers pour les analyses ex vivo en aval. Avec parmi les niveaux les plus élevés de pureté actuellement réalisables, cette méthode facilite la caractérisation directe morphologique, immunophéotypique et profonde des vésicules interstitielles sécrétées en divers spécimens de tissus, y compris les tumeurs. Ici, nous démontrons l’isolement des VE de tissu des spécimens de tumeur de cerveau et de poumon.Cependant, cette technique peut être appliquée aux études utilisant divers spécimens bénins, ou d’autres tumeurs aussi bien. Pour commencer, préparez 10 millilitres de tampon de dissociation dans le milieu Hibernate-E pour chaque 0,4 à 1,0 gramme de tissu. Ajouter les tissus entiers frais ou congelés au tampon dans un tube de 50 millilitres et incuber dans un bain d’eau chaude à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Après cela, ajouter des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase pour une concentration finale de 1 x dans le tampon de dissociation. Versez la solution avec le tissu dans un ajustement lâche vers le bas homogénéiseur. Utilisez environ 30 coups lents par échantillon pour dissocier doucement le tissu.Ensuite, transférez le tissu dissocié et la solution tampon dans un tube conique de 50 millilitres. Centrifugeuse à 500x g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes pour pelleter les cellules et les fibres restantes ou des fragments de tissu cohésif. Transférer le supernatant dans un tube conique propre de 50 millilitres, et la centrifugeuse à 2000x g et à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes pour pelleter et jeter les gros débris cellulaires.Transférez ce supernatant dans un tube conique propre de 50 millilitres, et centrifugeuse à 10 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 40 minutes pour granuler les vésicules plus grandes non désirables ou les petits corps apoptotiques. Décanter le supernatant à travers un filtre de 0,45 micromètre dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 millilitres. Ensuite, ultracentrifugez l’échantillon à 100 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant deux heures, pour pelleter les petits VE.Décanter le supernatant et laisser les tubes d’ultracentrifugation inversés pendant cinq à dix minutes, en tapant fréquemment pour enlever tout liquide résiduel sur les côtés des tubes. Ensuite, resuspendez la pastille EV en tampon de saccharose molaire de 1,5 millilitres de 0,25. Couvrez les tubes avec Parafilm, puis vortex les VE dans la solution.Faire basculer les tubes d’ultracentrifugeuse de 10 à 15 minutes à température ambiante. Et puis vortex une fois de plus. Centrifugez brièvement les tubes à une vitesse inférieure à 1000x g pour récupérer la suspension liquide au fond du tube.Au besoin, conserver la suspension à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Tout d’abord, ajouter 1,5 millilitres de 60% iodixanol aux 1,5 millilitres du tampon tris saccharose qui contient les VE pour créer une solution finale contenant 30% iodixanol. Pipette de haut en bas plusieurs fois pour bien mélanger la solution.Transférez cette solution au fond d’un tube d’ultracentrifugation de 5,5 millilitres. Ensuite, mélangez le stock de 60% iodixanol avec de l’eau ultra pure pour préparer au moins 1,5 millilitres d’une solution 20% et 10% iodixanol. À l’aide d’une seringue et d’une aiguille de calibre 18, mesurez 1,3 millilitres de la solution iodixanol à 20 % et superposez-la soigneusement au-dessus du gradient inférieur.Gardez le biseau de l’aiguille en contact avec l’intérieur du tube, juste au-dessus du ménisque et ajoutez la solution goutte sage pour éviter de mélanger les couches à l’interface de densité. Ensuite, superposer 1,2 millilitres de la solution 10% iodixanol sur le dessus de la couche de 20%, en utilisant la même technique. Équilibrez soigneusement et chargez les tubes d’ultracentrifugation dans des seaux de rotor.Réglez les vitesses d’accélération et de décélération d’un rotor de seau de balançoire aux taux minimaux, et la centrifugeuse à 268 000 x g et à quatre degrés Celsius pendant 50 minutes. Pendant que l’échantillon est centrifugé, étiquetez 10 tubes de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre pour chaque échantillon qui correspondront à des fractions d’un à dix du gradient de densité. Une fois la centrifugation terminée, retirez doucement les tubes des seaux du rotor et placez-les dans un support stable.Pipette 10 fractions de série de 490 microlitres du haut du gradient dans les tubes correspondants. À l’aide d’un réfractomètre, mesurer les indices réfractifs des fractions. Ensuite, transférez chaque fraction dans un tube d’ultracentrifugation propre de 12 millilitres.Ajouter cinq millilitres de 1x PBS à chaque tube et pipette de haut en bas lentement pour mélanger. Ajouter six millilitres supplémentaires de 1x PBS sur le dessus du tube, et mélanger soigneusement à nouveau. Ultracentrifugez les tubes à 100 000 x g et à quatre degrés Celsius pour re-pelleter les petites vésicules.Décanter le supernatant et appuyez sur les tubes secs avant de lyser les vésicules pour l’analyse des protéines ou de réutiliser les VE pour l’analyse morphologique. Pour lyse les VE pour l’analyse des protéines, ajouter 40 microlitres de tampon de lyse forte contenant inhibiteur de la protéase pour les granulés EV. Placez le parafilm sur chaque tube et vortex vigoureusement.Ensuite, faire basculer les tubes pendant 20 minutes à température ambiante et vortex à nouveau. Centrifugez brièvement l’échantillon à 1 000 x g pendant 30 à 60 secondes pour récupérer tout le volume de l’échantillon. Transférez chaque échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et rangez-le à une température comprise entre 20 et 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour un traitement ultérieur.Pour préparer les lysates purifiés à l’analyse des immunoblots, ajoutez 5 x tampon d’échantillon laemmli aux échantillons pour une concentration finale de 1x. Faire bouillir l’échantillon à 95 degrés Celsius pendant cinq à dix minutes. Ensuite, chargez un volume égal de fractions d’un à 10 dans un gel de page SDS de 10%.Chargez une masse égale d’homogénéité tissulaire. Effectuez l’analyse de l’électrophoresis et de la tache occidentale pour confirmer les protéines EV dans les lysates purifiés et comparer l’abondance relative d’EV en fractions. Dans cette étude, les vésicules extracellulaires sont extraites et purifiées à partir de tissus entiers.Après l’ultracentrifugation du gradient iodixanol de 10 à 30 %, on peut voir une population de VE légers migrer jusqu’à la fraction deux, tandis qu’une population de VE denses peut être vue migrant jusqu’à la fraction cinq, selon le type de tissu. Les immunoblots représentatifs des fractions de gradient montrent la séparation et la purification efficaces des petits VE dérivés de tumeur dans la fraction cinq. Notamment, les spécimens de tumeur de poumon semblent enrichis en VE denses comparés aux VE légers qui ont été précédemment récoltés du tissu entier de cerveau.L’analyse représentative de suivi des nanoparticules et la microscopie électronique des vésicules dérivées des tissus dans la vésicule prédominante contenant une fraction démontrent l’enrichissement et la préservation de vésicules entières. Compatible avec la taille et la structure connues des petits VE. Les VE interstitiels représentent des cibles prometteuses pour le développement de nouveaux tests diagnostiques ou pronostiques de biomarqueurs.Cette technique fournit aux chercheurs des outils pour l’extraction et la purification des vésicules pour l’utilité en aval. Après l’extraction des VE de tissu entiers ou lysed, la caractérisation large des vésicules comprenant les analyses protéomiques, génomiques, et lipidomiques peut être exécutée. En outre, des échantillons peuvent être utilisés pour des approches plus ciblées.Les vésicules isolées directement des échantillons de tissus peuvent fournir un aperçu supplémentaire des mécanismes de la maladie, y compris la genèse tumorale, et peuvent fournir des outils diagnostiques ou pronostiques importants à l’avenir.

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