Name: Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Apprenez à quantifier la formation des pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs) par microscopie confocale tridimensionnelle. Cette méthode haut débit permet d'évaluer les réponses immunitaires et de tester des thérapies ciblant les NETs chez les patients atteints de maladies auto-immunes.

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Le travail de Eline J. Arends et Y.K. Onno Teng est soutenu par la Fondation néerlandaise du rein (17OKG04), bourse de recherche clinique de l’organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (90713460). Travail de Laura S. van Dam est soutenu par la Fondation pour la recherche en rhumatologie (FOREUM).

Tous les patients et les témoins sains ont consenti à participer à la biobanque LUMC. Les deux études de biobanques ont été approuvées par le Comité d’éthique LUMC.
1. isolement des neutrophiles sains
<ol><li>Provenir d’un donneur sain dans deux tubes EDTA-revêtus de 10 mL 20 mL de sang périphérique.</li>
	<li>Mettre 10 mL de sang dans un tube stérile de 50 mL et ajouter en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à 32,5 mL.</li>
	<li>
Ajouter le gradient de densité (par exemple,., gradient de Ficoll-amidotrizoaat) dans les cellules.
	<ol>
<li>Relever 14 mL de densité de gradient avec une pipette de 10 mL et le régulateur de la pipette.</li>
		<li>Placez la pipette sur la partie inférieure du tube de 50 mL.</li>
		<li>Tenir la pipette contrôleur au large de la pipette, autorisant le gradient de densité s’écouler de la pipette par gravité jusqu'à ce que le maximum est atteint par effet de capillarité (1 à 2 mL restera-t-il), sans utiliser le moteur.</li>
		<li>Enlever pipette en plaçant un pouce sur le dessus de la pipette, empêchant ainsi le gradient de densité de fuir au moment du retrait de la pipette.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faites tourner les tubes pendant 20 min à 912 x g et à température ambiante (RT) sans accélération ou de freinage. Remarque : Globules rouges (RBC) et les neutrophiles ont une densité élevée et sont au fond du tube de 50 mL. Les cellules mononucléaires de sang périphérique (PBMC) sont séparés et sur le dessus du gradient de densité comme un anneau de couleur blanche. PBS-dilué plasma sera au-dessus les PBMC. Si nécessaire, les PBMC peut être isolés en transférant l’anneau blanc dans un nouveau tube de 50 mL avec étapes de lavage supplémentaire avec du PBS.</li>
	<li>Retirer délicatement l’anneau blanc contenant des PBMC tout d’abord, suivie de l’élimination du plasma PBS dilué et enfin la couche de gradient de densité autant que possible.</li>
	<li>
Pour isoler les neutrophiles du mélange neutrophile/érythrocytes, lyse érythrocytes par froid eau distillée stérile.
	<ol>
<li>Prendre la bouteille d’eau distillée stérile froide et un 10 x concentré flacon de PBS dans le réfrigérateur.</li>
		<li>Travailler rapidement pour cette étape. Ajouter 36 mL d’eau distillée stérile froide directement sur le dessus de la pastille et mélanger une fois soigneusement. Ajouter 4 mL de 10 x PBS après 20 s pour faire une solution isotonique. Mélanger une fois soigneusement.</li>
		<li>Tourner le tube pendant 5 min à 739 x g et 4 ° C (pour l’élimination des globules rouges). Neutrophiles sera dans la pastille blanche.</li>
		<li>Soigneusement éliminer le surnageant. Effectuez de nouveau étape 1.6.2 et veillez à ce que la pastille est suspendue correctement.</li>
		<li>Tourner le tube pendant 5 min à 328 x g et 4 ° C.</li>
		<li>Avec précaution, retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL de PBS. Compter les neutrophiles et les garder sur la glace. Remarque : Rendement prévu de 1 tube de sang (10 mL) est à environ 15 millions de neutrophiles.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. rouge Fluorescent cellule étiquetage des neutrophiles
<ol><li>Préparer une suspension neutrophile des neutrophiles 10 millions dans 2 mL de PBS dans un tube de 15 mL.</li>
	<li>Préparer une solution de 2 mL de PBS avec 4 µL de linker de cellule fluorescente rouge 2 µM (voir Table des matières) dans un tube différentes 15 mL. Ajouter délicatement à la suspension de neutrophile et mélanger soigneusement.</li>
	<li>Incuber dans l’obscurité pendant exactement 25 minutes à 37 ° C, d’étiqueter les neutrophiles avec l’éditeur de liens cellule fluorescente rouge.</li>
	<li>Inactiver l’étiquetage en ajoutant un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de chaleur inactivé (FCS) de sérum de veau fœtal au RT jusqu'à 15 mL et mélanger une fois soigneusement. Veillez à ce que la pastille est resuspendue soigneusement si une pastille a formé.</li>
	<li>Tourner le tube pendant 5 min à 328 x g et RT.</li>
	<li>Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 5 mL de phénol rouge-libre RPMI 1640 moyen contenant FCS 2 % et 10 % P/S à RT. compter les neutrophiles. Remarque : Une perte cellulaire de 50 % peut se produire après marquage de cellules fluorescentes rouges.</li>
</ol>3. induction de la Formation de neutrophiles Trap extracellulaire
<ol><li>Faire une suspension de cellules de 0,42 x 106 cellules/mL dans le rouge de phénol gratuit RPMI 1640 moyen contenant 2 % FCS et 10 % P/S.</li>
	<li>Ajouter 37 500 neutrophiles dans 90 µL / puits dans une plaque 96 puits, plat noir.</li>
	<li>Ajouter 10 µL du stimulus choisi (par exemple, le sérum du patient) en trois exemplaires pour atteindre une concentration de 10 % dans le puits. Toujours inclure un contrôle négatif (moyen) en trois exemplaires.</li>
	<li>Incuber à 37 ° C dans l’obscurité pour la durée désirée, allant de 30 min à 2, 4 ou 6 h. incubation pour 4 h est suggéré.</li>
	<li>Calculer le volume nécessaire d’ajouter 25 µL de 5 µM imperméable ADN teindre (voir Table des matières), pour atteindre une concentration finale de 1 µM dans le puits. Faire une dilution si nécessaire en milieu RPMI 1640 moyen contenant 2 % FCS et 10 % P/S pour obtenir une concentration de 5 µM.</li>
	<li>Ajouter 25 µL de 5 colorant µM à ADN imperméable 15 min avant la fin de la période d’incubation. Poursuivre l’incubation pendant 15 min à 37 ° C dans l’obscurité.</li>
	<li>Retirer le surnageant (~ 125 µL) très soigneusement et entreposer si nécessaire. Ajouter 100 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA). Maintenir dans l’ignorance et passez immédiatement à l’étape 4.</li>
</ol>4. NET visualisation avec la microscopie confocale Immunofluorescence 3D de haute résolution, haute teneur
<ol><li>
Configurer les paramètres sur la microscopie confocale immunofluorescence en cliquant sur le paramétrage de l’Acquisition.
	<ol>
<li>Cliquez sur l’onglet configurer .</li>
		<li>Sélectionner l’objectif et la caméra. Le choix de l’objectif de 10 X Apo Lambda avec un mode d’acquisition d’un trou d’épingle confocal 60 µm.</li>
		<li>Cliquez sur la plaque et choisissez la plaque 96 puits en plastique. Sélectionner les sites à visiter et de choisir un nombre fixe de sites. Remplir 3 colonnes et 3 lignes sans chevauchement (0 µm), qui couvrent un total de 45 % du puits.</li>
		<li>Cliquez sur l’Acquisition. Sélectionnez activer par Laser mise au point. Le cas échéant, sélectionnez Acquérir série Z/chronologiques .</li>
		<li>Cliquez sur le Site Autofocus.<ol>
<li>Cliquez sur Focus sur fond de plaque | Déport de fond épaisseur. Pour le puits initial trouver de l’échantillon, choisissez le premier puits d’acquis. Pour la mise au point automatique de site, choisissez tous les sites.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Cliquez sur les longueurs d’onde.<ol>
<li>Pour le nombre de longueurs d’onde, choisissez 2. Pour le niveau de raffinement TL ombrage correction, choisissez 2.</li>
			<li>Pour la longueur d’onde 1, sélectionnez Texas Red.<ol>
<li>Pour les options de mise au point automatique, sélectionnez laser avec décalage Z, poste laser offset 1,1 µm. utilisation Z-pile avec une gamme personnalisée de 200-10.</li>
			</ol>
</li>
			<li>Pour la longueur d’onde 2, sélectionnez FITC.<ol>
<li>Pour les options de mise au point automatique, sélectionnez imprimante laser Z offset de w1 0 µm. utilisation Z-pile avec une gamme personnalisée de 200-10.</li>
				<li>Pour les options d’acquisition, sélectionnez série Z et projection 2D image maximale. Pour les options d’acquisition, sélectionnez Shading Correction | Hors.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Sélectionnez la série Z. Sélectionnez le nombre d’étapes : 10. Sélectionnez la taille d’étape : 3 mm (gamme totale sera 27 µm).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Mettre la plaque dans la microscopie confocale immunofluorescence.
	<ol>
<li>Cliquez sur l’onglet exécuter .<ol>
<li>Remplir de la description et le nom de plaque et choisissez l’emplacement de stockage.</li>
			<li>Sélectionnez les puits qui doivent être acquises.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Choisir les temps d’exposition pour Texas Red et FITC.</li>
	<li>Cliquez sur la Plaque d’acquérir pour démarrer l’acquisition, qui prendra environ 1 h par plaque.</li>
</ol>5. l’analyse de formation nette
<ol><li>Utilisez une programme conçu pour l’analyse des images multidimensionnelles scientifiques (voir Table des matières) pour analyser la formation nette de traitement d’image.</li>
	<li>Transférer les données de l’image acquise sur un disque dur distinct.</li>
	<li>
Sélectionnez la couleur, l’ajout d’outil.
	<ol>
<li>Sélectionnez w1 et choisissez le dossier dans le disque dur où les données sont stockées.</li>
		<li>Sélectionnez w2 et choisissez le dossier dans le disque dur où les données sont stockées. Remarque : Utiliser une macro standard qui utilise w1 dans le nom du fichier à ajouter de la couleur rouge aux images Texas Red et w2 pour ajouter de la couleur verte aux images FITC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sélectionnez analyse Macro.
	<ol>
<li>Sélectionnez w1, choisissez la valeur de seuil (seuil d’intensité), qui est habituellement de 10. Sélectionnez la valeur désirée pixel (seuil de la taille, par exemple, 100).</li>
		<li>Sélectionnez w2, choisissez la valeur de seuil (seuil d’intensité), qui est habituellement de 10. Sélectionnez la valeur désirée pixel (seuil de la taille, par exemple, 500).</li>
		<li>Choisissez la destination pour le fichier de feuille de calcul, exécuter une analyse et enregistrer des fichiers journaux par la suite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyser les données dans une feuille de calcul.</li>
</ol>

<ol><li>Jorgensen, I., Rayamajhi, M., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+cell+death+as+a+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Programmed cell death as a defence against infection.</a> Nature Reviews Immunology. 17 (3), 151-164 (2017).</li>
<li>Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+neutrophil+extracellular+traps+contribute+to+the+heightened+risk+of+thrombosis+in+inflammatory+diseases%3F%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases?</a> World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).</li>
<li>Kessenbrock, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+in+autoimmune+small-vessel+vasculitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis.</a> Nature Medicine. 15 (6), 623-625 (2009).</li>
<li>Garcia-Romo, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netting+neutrophils+are+major+inducers+of+type+I+IFN+production+in+pediatric+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Netting neutrophils are major inducers of type I IFN production in pediatric systemic lupus erythematosus.</a> Science Translational Medicine. 3 (73), 73ra20(2011).</li>
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<li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particles+of+different+sizes+and+shapes+induce+neutrophil+necroptosis+followed+by+the+release+of+neutrophil+extracellular+trap-like+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports+-+Nature%22%5BJournal%5D)">Particles of different sizes and shapes induce neutrophil necroptosis followed by the release of neutrophil extracellular trap-like chromatin.</a> Scientific Reports - Nature. 7 (1), 15003(2017).</li>
<li>Desai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PMA+and+crystal-induced+neutrophil+extracellular+trap+formation+involves+RIPK1-RIPK3-MLKL+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">PMA and crystal-induced neutrophil extracellular trap formation involves RIPK1-RIPK3-MLKL signaling.</a> European Journal of Immunology. 46 (1), 223-229 (2016).</li>
<li>Apel, F., Zychlinsky, A., Kenny, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neutrophil+extracellular+traps+in+rheumatic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The role of neutrophil extracellular traps in rheumatic diseases.</a> Nature Reviews Rheumatology. , (2018).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+high-throughput+detection+and+quantification+of+neutrophil+extracellular+traps+reveals+ROS-independent+NET+release+with+immune+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Autoimmunity+Reviews%22%5BJournal%5D)">A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes.</a> Autoimmunity Reviews. 15 (6), 577-584 (2016).</li>
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<li>Nakazawa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+formation+and+disordered+regulation+of+NETs+in+myeloperoxidase-ANCA-associated+microscopic+polyangiitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+the+American+Society+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Enhanced formation and disordered regulation of NETs in myeloperoxidase-ANCA-associated microscopic polyangiitis.</a> Journals of the American Society of Nephrology. 25 (5), 990-997 (2014).</li>
<li>Konig, M. F., Andrade, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Reappraisal+of+Neutrophil+Extracellular+Traps+and+NETosis+Mimics+Based+on+Differential+Requirements+for+Protein+Citrullination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A Critical Reappraisal of Neutrophil Extracellular Traps and NETosis Mimics Based on Differential Requirements for Protein Citrullination.</a> Frontiers in Immunology. 7, 461(2016).</li>
<li>Kenny, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+stimuli+engage+different+neutrophil+extracellular+trap+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+image-based+quantitative+method+for+the+characterization+of+NETosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis.</a> Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).</li>
<li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> The Journal of Immunology. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li>
<li>Tanaka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+characterization+of+neutrophil+extracellular+traps+in+various+organs+of+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model.</a> PLoS One. 9 (11), e111888(2014).</li>
<li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> Journal of Cell Biology. 176 (2), 231-241 (2007).</li>
<li>von Köckritz-Blickwede, M., Chow, O., Nizet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+calf+serum+contains+heat-stable+nucleases+that+degrade+neutrophil+extracellular+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps.</a> Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).</li>
<li>Kraaij, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excessive+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+ANCA-associated+vasculitis+is+independent+of+ANCA%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International%22%5BJournal%5D)">Excessive neutrophil extracellular trap formation in ANCA-associated vasculitis is independent of ANCA.</a> Kidney International. , (2018).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le volet essentiel de ce test est la nécessité d’utiliser des neutrophiles fraîchement isolées pour chaque expérience, parce que les neutrophiles sont de courte durées et meurent lorsque congelés. Cela nécessite un donneur sain chaque fois, ce qui pourrait impliquer quelques variations en raison des caractéristiques du donneur. Une de ces variantes est l’état d’activation des neutrophiles. Neutrophiles pourraient être activées déjà in vivo avant l’isolation. En outre, les neutrophiles peuvent être activées dans les étapes d’isolement, notamment lors de la lyse des érythrocytes, un gestionnaire expérimenté des neutrophiles est donc requise pour minimiser l’activation des neutrophiles. En général, isolement des neutrophiles doit être effectuée dès que possible après le dessin de sang et l’expérience ne devrait pas être suspendue afin d’éviter une activation spontanée excessive. Deuxièmement, une manipulation brutale des neutrophiles doit être évitée. Par conséquent, l’avantage notable du protocole décrit est les interventions minimales de pipetage une fois que les neutrophiles sont ensemencées dans une plaque à 96 puits. Ce qui est important, l’état d’activation des neutrophiles est mieux appréciée dans la condition non stimulée, dans lequel ce test peut détecter avec sensibilité de faibles niveaux de formation nette. Un autre facteur qui pourrait influencer le dosage est l’utilisation des centres d’amitié dans le milieu. Le pourcentage de FCS a été réduit de 10 % à 2 % pour éviter la suppression éventuelle formation nette d’antioxydant activité19,20 ou l’activation possible des neutrophiles malgré l’inactivation par la chaleur. Culture sans FCS ou avec l’utilisation de différents types de médias n’a pas été jugée. Un contrôle non stimulée ou moyen est toujours emmené lors de l’exécution de l’essai d’avoir une idée du signal de fond (par exemple, état d’activation des neutrophiles). L’augmentation de pli pour chaque stimulus par rapport à l’échantillon non stimulée s’affiche pour obtenir des résultats cohérents sur différentes expériences à l’aide d’un même stimulus.
Un facteur important pour un fond important possible est la coloration des ADN extracellulaire qui n’est pas lié au processus de formation nette. Le test actuel essaye de réduire cela en supprimant la coloration de l’ADN extracellulaire immédiatement après la courte période d’incubation de 15 min et en analysant la plaque directement après fixation. Par conséquent, il est indispensable d’utiliser un microscope confocal avancé qui a suffisamment de vitesse et puissance d’analyse pour capturer la plaque 96 puits dans 1 à 2 h. automatique réglage de la durée d’exposition et mise au point est recommandé. Ainsi, le paramètre microscope peut varier entre chaque échantillon et expérimenter en ce qui concerne le seuil d’intensité de couleur qui est nécessaire pour une qualité d’image optimale dans l’ensemble. Les influences de ce dernier devrait donc confirmer la capacité éventuelle de quantifier correctement les neutrophiles et les filets et le réglage optimal en utilisant plusieurs échantillons de contrôle (par exemple, le sérum de sujets sains). Lors de l’analyse des images capturées, l’utilisation d’un seuil de pixel et le seuil de la taille dans le programme d’analyse permet une meilleure sélection formation nette.
Extracellulaire ADN dérivé de formation nette peut être le résultat des voies distinctes de la mort, y compris NETosis, necroptosis, pyroptosis, ferroptosis ou même non-lytique processus vital formation nette1. À ce titre, une limitation de l’analyse actuelle est que par coloration seulement pour ADN extracellulaire il n’y aucune distinction possible entre formation nette et autres voies cellulaires pertinents de la mort. Il est possible d’y parvenir en utilisant deux inhibiteurs sélectifs des voies distinctes mort pour distinguer les différentes formes qui sous-tendent la formation nette ou immunostainings séparé pour confirmer la présence de marqueurs NET spécifiques, tels que citH3 et NE, a localisé avec l’ADN. La co-localisation d’ADN extracellulaire avec citH3 et NE a récemment été confirmée pour ce dosage10. L’avantage d’éviter des marqueurs spécifiques NET dans ce test, permet d’évaluer toutes les formes de NET formation menant à l’extrusion de l’ADN par les neutrophiles aussi complets et aussi objective que possible avec le potentiel de criblage à haut débit. L’application du présent protocole a été démontrée dans l’étude de faible induction NET niveau médiée par les complexes immuns dans la maladie auto-immune dans laquelle la capacité à détecter des différences qualitatives et quantitatives peut être plus importante que le type de processus participant10,21,22. Illustrant que cet essai de roman quantification NET peut être de valeur ajoutée pour les différents chercheurs étudier divers aspects de la formation nette. De petits ajustements à l’essai sont facilement mises en œuvre : ajustement de la période de stimulation, l’utilisation d’un marqueur NET favori pour se concentrer sur la voie d’un décès spécifique conduisant à la formation nette, l’utilisation d’un grossissement différent ou l’utilisation des différents critères nets dans la quantification et l’analyse.
En conclusion, le protocole fourni est très sensibles d’un test largement applicable pour la quantification semi-automatisé formation nette pour l’évaluation de l’induction ex vivo des filets à différents stimuli.

La formation de pièges extracellulaires neutrophiles (filets) est le processus dans lequel neutrophiles libèrent leur ADN dans un réseau tridimensionnel extracellulaire de (3D) comme structure, complexé avec un large éventail de molécules antimicrobiennes et dangereux, granulaires et enzymes cytoplasmiques, des peptides et des protéines. Ces structures immunogènes et toxiques ont un rôle physiologique important dans la défense immunitaire innée des individus sains par piégeage et tuer les pathogènes infectieux1. Cependant, ils ont aussi prouvés à être impliqué dans diverses maladies auto-immunes systémiques, y compris les anticorps anti-neutrophile cytoplasmiques (ANCA) et de thrombose2 -associés de vascularite (AAV)3, le lupus érythémateux disséminé (SLE )4,5, syndrome des antiphospholipides (APS)2,6, la polyarthrite rhumatoïde (pr), psoriasis et la goutte7,8,9.
Formation nette in vitro a été largement étudiée avec le phorbol composé chimique 12-myristate 13-acétate (PMA), qui induit la formation nette massive. Toutefois plus de stimuli physiologiques induisent des niveaux beaucoup plus bas de formation nette10. D’étude NET-déclencheurs dans, par exemple, un cadre d’une maladie auto-immune, un test quantitatif normalisé, sensible et à haut débit est nécessaire pour détecter et quantifier la formation nette. Quantification des filets s’est avéré pour être un défi et est actuellement réalisée par des méthodes différentes, chacune avec leurs propres avantages et limitations11. Une méthode couramment utilisée est la détection de l’ADN dans les surnageants12, qui est l’objectif, mais ne fait aucune distinction entre l’origine de l’ADN (apoptose, nécrotique, filets) et n’est donc pas très spécifiques pour les filets. Deuxièmement, les dosages d’immuno-enzymatique (Elisa) d’ADN-complexé avec des protéines spécifiques NET, par exemple, contre la myéloperoxydase (MPO) ou l’élastase neutrophile (NE), sont une approche plus spécifique pour détecter les filets et ont été démontrées à la pour corrélation entre les citrullinés histone-3 (CitH3) positif filets13. Cependant, on ne sait pas si cette méthode est assez sensible pour ramasser tous les filets (p. ex., MPO, NE et CitH3 NETs négatifs). Une troisième approche est la microscopie en immunofluorescence qui sert à détecter la co-localisation des molécules associées aux NET (NE, MPO, CitH3) avec l’ADN extracellulaire pour quantifier les filets. Cette méthode est généralement spécifique pour les filets, mais il ne peut être appliquée comme une méthode de haut-débit et n’est pas objectif en raison de la partialité de l’observateur. En outre, cette méthode ne tient pas compte FTU-, NE-, filets CitH3-négatifs qui sont fréquemment présentes selon les NET-déclencheur utilisé14,15. Flow cytometry approches détectent les filets grâce à une diffusion avant/côté changée (FSC/SSC) indiquant un gonflement du noyau dans NET-ting neutrophiles16. Cette méthode ne tient pas compte des différentes formes de formation nette qui ont été identifiées, qui pourraient impliquer pas de gonflement du noyau, telles que formation nette vital17. Enfin, la microscopie confocale immunofluorescence a été appliquée afin de visualiser et de quantifier la formation nette par coloration directement l’ADN extracellulaire avec un colorant cellulaire-imperméable qui taches extracellulaire ADN12,18. Généralement, 5 à 10 champs haute puissance sont manuellement cueillis et appréciées, qui couvre 1 à 5 % de chaque puits d’une plaque à 96 puits11,17. Sélection manuelle des images n’est pas toujours objective, sujettes à un biais et pas intéressant pour l’analyse de haut-débit. Un essai de quantification NET automatisé et à haut débit a été récemment développé, qui imagés 11 % du puits de façon 3D couvrant 13 µm par microscopie confocale immunofluorescence Z-stack, entraînant ainsi une technique très sensible pour évaluer les filets par rapport aux méthodes conventionnelles10. Le présent rapport décrit le protocole plus récent afin de quantifier la formation nette grâce à un dosage automatisé et très sensible à l’aide de la microscopie confocale 3D, qui atteint une superficie totale de représentation de 45 % de chaque puits et couvre 27 µm par Z-cheminées. Ce protocole est conçu pour quantifier, avec une sensibilité élevée, faibles niveaux de formation nette de façon objective et impartiale.

<table><tbody><tr><td>Aqua Stérile H2O</td><td>B. Braun, Melsungen, Allemagne</td><td>12604052</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (SCF)</td><td>Bodinco, Alkmaar, Pays-Bas</td><td></td><td>Utilisé à des concentrations élevées, il pourrait influer sur la formation de NET</td></tr><tr><td>Ficoll 5,7 % - amidotrizoaà 9 % densité 1,077 g/mL</td><td>LUMC, Leiden, Pays-Bas</td><td>97902861</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td> <td>confocal à immunofluorescenceImage Xpress Micro Confocal (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutralisation PBS (10x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>70011-036</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine (p/s)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Rouge de phénol sans RPMI 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>11835-063</td><td>Le rouge de phénol peut interférer avec le signal d’immunofluorescence</td></tr><tr><td>Tamponné au phosphate solution saline (PBS)</td><td>B. Braun, Melsungen, Allemagne</td><td>174628062</td><td></td></tr><tr><td>PKH26 2 &mu ; M Red fluorescent cell linker</td><td>Sigma Aldrich Saint-Louis, MO, USA</td><td>PKH26GL-1KT</td><td>PKH sont des colorants fluorescents brevetés et une technologie de marquage cellulaire nommée d’après leur découvreur Paul Karl Horan</td></tr><tr><td>Programme d’analyse scientifique d’images multidimensionnelles</td><td>ImageJ, Research Services Branch, National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI medium 1640 (1x)</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>52400-025</td><td></td></tr><tr><td>Sytox vert 5 mM Colorant ADN imperméable</td><td>Gibco, Paisley, UK</td><td>57020</td><td></td></tr><tr><td>Coloration bleue trypan 0,4 %</td><td>Sigma Aldrich, Allemagne</td><td>17942E</td><td></td></tr><tr><td>96 puits, noir, fond plat, plaque traitée pour culture tissulaire</td><td>Falcon, NY, USA</td><td>353219</td><td></td></tr></tbody></table>

un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire formation

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Les pièges extracellulaires neutrophiles (filets) sont immunogènes structures extracellulaires d’ADN qui peuvent être libérées par les neutrophiles sur une grande variété de déclencheurs. Des filets ont été démontrés pour servir comme un mécanisme de défense du hôte important qui emprisonne et tue les micro-organismes. En revanche, ils ont été impliqués dans diverses maladies auto-immunes systémiques. Les filets sont immunogènes et toxiques des structures contenant un pool d’auto-antigènes pertinentes, y compris les anticorps anti-neutrophile cytoplasmiques (ANCA)-vascularite (AAV) et lupus érythémateux systémique (les) associés. Différentes formes de filets peuvent être induites selon le stimulus. La quantité de filets peut être quantifiée à l’aide de différentes techniques y compris mesure de libération d’ADN dans les surnageants, mesure ADN complexée avec NET-molécules comme la myéloperoxydase (MPO) ou de l’élastase neutrophile (NE), mesurer la présence des citrullinés histones par microscopie de fluorescence, ou détection de cytométrie en flux NET-composants, qui tous ont des caractéristiques différentes au sujet de leur spécificité, la sensibilité, l’objectivité et la quantité. Voici un protocole pour quantifier ex vivo NET formation de manière très sensible et à haut débit à l’aide de la microscopie confocale immunofluorescence en trois dimensions. Ce protocole peut être appliqué pour répondre à diverses questions de recherche sur la formation nette et de la dégradation de la santé et la maladie.

Formation de neutrophiles trap extracellulaire (NET) est quantifiée de façon 3D en quantifiant l’ADN extracellulaire tachée sur 10 Z-piles avec 3 µm distance départ dans le plan focal dans chaque puits. En mesurant la superficie cumulée, la sensibilité de l’augmentation de dosage (Figure 1 a). Les neutrophiles isolés ont une pureté moyenne 98,7 % avec la déviation standard (SD) de 1,10 %, mesurée en 14 différents échantillons d’isolations différentes. Le pourcentage moyen des globules rouges est de 1,04 % ± 1,1 % SD et le pourcentage moyen des monocytes est 0,085 % ± 0,17 % SD (données non présentées). La superficie totale des neutrophiles tachées imagés sont quantifiées que dans le plan focal dans chaque puits, qui sont corrélés significativement avec le nombre de neutrophiles total dans chaque puits avec un coefficient de corrélation de Pearson de 0,99 (95 % intervalle de confiance [IC] 0,985-0,997, p &lt; 0,0001) (Figure 1 b). Les résultats représentatifs de quantification formation nette dans les neutrophiles stimulent avec 10 % des sérums de patients de l’AAV ou moyen (MED) comme témoin négatif, exprimé en cumulé zone tachée d’ADN extracellulaire sur 10 Z-piles par imagés neutrophile (Figure 1 C). instantanés d’images représentatives des neutrophiles non stimulées (Figure 2 a) et des filets dans les neutrophiles stimulée par l’AAV (Figure 2 b) sont indiquées.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig1.jpg"> Figure 1 : Quantification de formation nette en mesurant l’ADN extracellulaire et neutrophiles. (A) zone est quantifiée cumulativement sur les 10 Z-piles pour chaque bien pour neutrophiles non stimulées (MED) et pour les neutrophiles stimulée avec 10 % de sérum de vascularites associées aux ANCA patients (AAV) (n = 4) quantifié avec un programme de traitement d’image. Chaque stimulus a été testé en trois exemplaires, chaque point représente la valeur médiane. (B) rouge fluorescent étiqueté zone et cellule globules ont été quantifiés dans le plan focal de chaque puits par le programme de traitement d’image (R2 = 0,99, p &lt; 0,0001). (C) formation nette est exprimée en superficie cumulée par imagés neutrophile (région de la cellule). La moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM) de chaque trois exemplaires sont tracée par stimulation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59150/59150fig2.jpg"> Figure 2 : instantanés d’essai de quantification NET. Fluorescents étiquetés neutrophiles sont indiquées en rouge et tachée ADN extracellulaire s’affiche en vert. 10 x objectif Plan Apo Lambda. Neutrophiles non stimulées (A). (B) neutrophiles stimulés avec sérum AAV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59150/59150fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Ce protocole décrit un dosage très sensible et très haut débit de neutrophiles piège extracellulaire (NET) pour la quantification semi-automatisé des ex vivo NET formation par microscopie confocale tridimensionnelle par immunofluorescence. Ce protocole peut être utilisé pour évaluer la formation nette et dégradation après différents stimuli et peut être utilisé pour l’étude des thérapies potentielles axés sur le NET.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...

Nous avons développé un essai à haut débit pour mesurer les pièges extracellulaires neutrophiles, ou NETs. Les NET sont des structures immunogéniques de l’ADN qui sont exposées par les neutrophiles. Les NET peuvent piéger et tuer les micro-organismes et sont donc un mécanisme anti-infectieux important, mais ils jouent également un rôle pathogène dans les maladies auto-immunes.Avec cette technique, les NETs sont quantifiés par microscopie confocative d’immunofluorescence tridimensionnelle ayant pour résultat une méthode très sensible et à haut débit pour étudier la formation et la dégradation de NET. Cette technique nous permet de quantifier la formation net des patients atteints de maladies auto-immunes. La formation ex vivo NET des patients présentant la vascularite ANCA-associée ou l’érythématose systémique de lupus pourrait être surveillée avec cet essai.En outre, des thérapeutiques potentielles ciblant la formation d’AUT pourraient être testées avec cet essai in vitro. L’isolement des neutrophiles pourrait être une lutte pour les personnes qui n’ont jamais pratiqué cette technique auparavant. Pour commencer cette procédure, obtenez 20 millilitres de sang périphérique d’un donneur sain dans deux tubes edta-codés de 10 millilitres.Transférer 10 millilitres de sang dans un tube stérile de 50 millilitres et pbs à un volume total final de 32,5 millilitres. À l’aide d’un contrôleur de pipette et de pipette de 10 millilitres, prenez 14 millilitres de gradient de densité. Placez la pipette sur le fond du tube de 50 millilitres.Ensuite, sortez le contrôleur pipette de la pipette, ce qui permet au gradient de densité de s’écouler par gravité jusqu’à ce que le maximum soit atteint par effet capillaire. Placez un pouce sur la pipette pour empêcher le gradient de densité restant de s’échapper, puis retirez la pipette du tube. Centrifuger le tube à 912 fois g à température ambiante pendant 20 minutes sans accélération ni frein.Retirez soigneusement l’anneau blanc contenant les cellules mononucléaires périphériques de sang d’abord, a suivi le plasma PBS-dilué. Enfin, retirez autant que possible la couche de gradient de densité. Ensuite, récupérez une bouteille d’eau distillée stérile froide et un flacon de PBS concentré de 10 x dans un réfrigérateur.En travaillant rapidement, ajouter 36 millilitres d’eau directement sur le dessus de la pastille et mélanger soigneusement une fois. Après 20 secondes comptées dès le départ, ajouter quatre millilitres de 10x PBS pour faire une solution isotonique. Et encore une fois, mélanger une fois avec soin.Centrifuger le tube à 739 fois g et à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Jetez le supernatant, en vous assurant d’être extrêmement prudent car la pastille n’est pas solide, et répétez rapidement le processus d’ajout de l’eau distillée stérile froide et concentré PBS comme décrit précédemment. Centrifugeuse à 328 fois g et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.Retirez soigneusement le supernatant et suspendez la pastille en cinq millilitres de PBS. Comptez les neutrophiles et gardez-les sur la glace. Tout d’abord, faire une suspension neutrophile contenant environ 10 à 20 millions de neutrophiles en deux millilitres de PBS dans un tube de 15 millilitres.Dans un autre tube de 15 millilitres, mélanger deux millilitres PBS avec quatre microlitres de liaison cellulaire fluorescente rouge deux micromolaires. Ajouter délicatement la solution de liaison cellulaire fluorescente rouge à la suspension du neutrophile et mélanger soigneusement. Envelopper le tube dans du papier d’aluminium pour protéger le mélange de la lumière, et incuber pendant exactement 25 minutes à 37 degrés Celsius pour étiqueter les neutrophiles avec le linker rouge fluorescent.Inactivez l’étiquetage en ajoutant rpmi 1640 moyen contenant 10% de chaleur inactivée FCS à température ambiante à un volume final de 15 millilitres et mélanger une fois soigneusement. Si, après cela, une pastille s’est formée, suspendre soigneusement le mélange. Centrifuger le tube à 328 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.Avant d’enlever le surnatant, assurez-vous qu’une pastille s’est formée. Après cela, re-suspendre la pastille en cinq millilitres de rouge libre RPMI 1640 moyen contenant 2%FCS à température ambiante. Ensuite, comptez les neutrophiles.Faire une suspension cellulaire à une densité de 420.000 cellules par millilitre dans le phénol sans rouge RPMI 1640 milieu contenant 2%FCS. Ajouter 37 500 neutrophiles dans 90 microlitres à chaque puits d’une plaque noire à fond plat de 96 puits. Ensuite, ajoutez 10 microlitres du stimulus choisi en triplicate pour atteindre une concentration de 10% dans chaque puits.Toujours inclure un contrôle négatif dans le triplicate. Incuber dans l’obscurité à 37 degrés Celsius pour le temps désiré, allant de 30 minutes à deux, quatre ou six heures. Ensuite, préparez le volume de colorant imperméable à l’ADN nécessaire pour ajouter 25 microlitres de colorant d’ADN imperméable à cinq micromillons pour atteindre une concentration finale d’un micromolaire dans chaque puits.15 minutes avant la fin du temps d’incubation, ajouter 25 microlitres de colorant imperméable à l’ADN de cinq micromolaires à chaque puits. Poursuivre l’incubation pendant les 15 dernières minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Après cela, retirez le surnatant très soigneusement et rangez-le si nécessaire.Ajouter 100 microlitres de 4% de paraformaldéhyde. Gardez la plaque dans l’obscurité, et passez immédiatement à la section suivante. Après avoir configuré les paramètres, sélectionnez série Z.Sélectionnez 10 comme nombre d’étapes. Sélectionnez trois micromètres comme taille d’étape. Chargez la plaque dans le microscope confocal d’immunofluorescence.Cliquez sur l’onglet Exécuter. Remplissez le nom et la description de la plaque et choisissez l’emplacement de stockage. Sélectionnez les puits qui doivent être acquis.Choisissez le temps d’exposition pour Texas Red et FITC. Ensuite, cliquez sur Acquire Plate et commencer l’acquisition, qui prendra environ une heure par plaque. Après cela, sélectionnez Analyse Macro.Sélectionnez ensuite w1 et choisissez la valeur seuil. Ensuite, sélectionnez la valeur pixel désirée. Enfin, dans une deuxième fenêtre Image J, sélectionnez w2 et choisissez la valeur seuil avec la valeur pixel désirée.Sélectionnez une destination pour le fichier de feuille de calcul, exécutez l’analyse et enregistrez le fichier journal par la suite. Présenté ici est un essai très sensible largement applicable pour la quantification semi-automatisée de la formation extracellulaire de piège de neutrophile pour l’évaluation de l’induction ex vivo des pièges extracellulaires de neutrophile sur différents stimulus. La formation de NET est quantifiée d’une manière tridimensionnelle en quantifiant l’ADN extracellulaire taché sur 10 Z-stacks avec la distance de trois micromètres commençant au plan focal dans chaque puits.En mesurant la zone cumulative, la sensibilité de l’essai augmente. La superficie totale des neutrophiles tachés photographiés n’est quantifiée que dans le plan focal de chaque puits, ce qui correspond de façon significative au nombre total de neutrophiles dans chaque puits avec un coefficient de corrélation Pearson de 0,99. Le résultat représentatif de la quantification de la formation de NET dans les neutrophiles est exprimé comme zone cumulative tachée d’ADN extracellulaire plus de 10 Z-stacks par neutrophile imaged.Des instantanés sont ensuite pris de l’analyse de quantification nette. Des images représentatives de neutrophiles non formulés et de NETs dans les neutrophiles stimulés par l’AAV sont montrées ici avec les neutrophiles fluorescents étiquetés en rouge et l’ADN extracellulaire taché en vert. Les neutrophiles doivent être manipulés avec soin, et l’étiquetage PKH doit être effectué exactement selon le protocole.Cet essai peut être employé pour étudier la morphologie, la cinétique, et la composition des NETs. Cette technique est une autre méthode qui offre la possibilité d’étudier les NETs dans la santé et la maladie. Trypan bleu, PKH, et PFA doit être manipulé avec des gants et ne doit pas être respiré directement.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo présente une technique in vitro pour générer et isoler des pièges extracellulaires neutrophiles (TNE). Les neutrophiles sont isolés du sang périphérique et stimulés avec de l’acétate de myristate de phorbol (PMA) pour produire des TNE. Au cours de l’incubation, les neutrophiles subissent un processus de mort cellulaire (NETosis) pour libérer des TNE composées de chromatine décondensée mélangée à des protéines cytoplasmiques granulaires.

Une technique in vitro pour générer des pièges extracellulaires de neutrophiles humains

Cette vidéo montre l’induction et la visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles ou TNE dans des neutrophiles pré-marqués à l’aide de sérum de patient contenant des anticorps cytoplasmiques anti-neutrophiles. De plus, l’utilisation d’un colorant d’ADN imperméable et la microscopie à fluorescence permettent de visualiser les TNE.

Induction et visualisation de pièges extracellulaires de neutrophiles dans des neutrophiles pré-marqués

Des dosages à haut débit sont présentés qui, combinés, fournissent d’excellents outils pour quantifier la libération de TNE par les neutrophiles humains.

High Throughput Mesure de l&#39;ADN extracellulaire de sortie et quantitative Formation NET dans les neutrophiles humains<em&gt; In vitro</em

pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont des réseaux d'ADN, les histones et les protéines de neutrophiles. Bien qu'une composante de la réponse immunitaire innée, TNE sont impliqués dans l'auto-immunité et de la thrombose. Ce protocole décrit une méthode simple pour l'isolement des cellules neutrophiles canins et la quantification de TNE en utilisant un dosage de fluorescence de microplaque.

A Fluorescence Assay simple pour Quantification de Canine neutrophiles extracellulaires Piège sortie

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In Vitro Formation canine piège extracellulaire neutrophiles : Analyse dynamique et Quantitative par microscopie de Fluorescence

Ici, nous présentons un protocole pour générer des pièges extracellulaires neutrophiles (NET) et l'exploitation de NETQUANT, une option logicielle entièrement automatique pour la quantification des NET dans les images d'immunofluorescence.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

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Apprenez à quantifier la formation des pièges extracellulaires des neutrophiles (NETs) par microscopie confocale tridimensionnelle. Cette méthode haut débit permet d'évaluer les réponses immunitaires et de tester des thérapies ciblant les NETs chez les patients atteints de maladies auto-immunes.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

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