Name: Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur lexpression génique de la pomme de terre pendant linfestation par linsecte à mâcher Manduca sexta (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Découvrez une méthode simplifiée pour étudier l'expression génique de la pomme de terre en réponse à l'herbivorie par Manduca sexta. Ce protocole utilisant des feuilles détachées offre des données reproductibles et contrôlées.

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Les auteurs tenons à remercier Bob Farrar et Alexis Park d'avoir fourni des insectes utilisés dans cette étude et de leur expertise dans la mise en scène larvaire. Merci également à Michael Blackburn et Saikat Ghosh pour l'examen critique du manuscrit.
La mention des noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cette publication vise uniquement à fournir des renseignements précis et n'implique pas de recommandation ou d'approbation par le ministère de l'Agriculture des États-Unis.
L'USDA est un fournisseur et un employeur de l'égalité des chances.

REMARQUE : Le protocole suivant est conçu pour qu'une personne s'installe, fasse des observations et prérecueille des échantillons. Plusieurs exécutions d'une même configuration peuvent être combinées pour augmenter la réplication biologique. Toute répétition supplémentaire de l'expérience doit être mise en place en même temps de la journée pour éliminer les influences diurnes possibles sur l'expression des gènes. Le protocole est conçu pour créer 3 feuilles « infestées » pour 5 points de temps de récolte distincts. Les feuilles de commande assorties pour chaque point de temps créent un total de 30 échantillons. L'expérience peut être réalisée avec une variété de tailles de feuilles et d'étapes larvaires, mais il est recommandé que la taille des feuilles, le stade larvaire et le temps d'infestation soient uniformes tout au long de la procédure.
1. Préparation des plants de pommes de terre
REMARQUE: Toutes les étapes nécessitant une technique stérile doivent être effectuées dans une hotte de culture tissulaire18,19.
<ol><li>Préparer les plantlets Kennebec à partir de la source d'explantation.<ol>
<li>Préparer le milieu de propagation.<ol>
<li>Ajouter 4,43 g de Murashige et Skoog (MS) avec de la poudre de vitamines, 20 g de saccharose et 2 g de substitut d'agar à 1 L d'osmose inverse (RO) purifiée dans un flacon de 2 L avec une barre de spin. Transférer le flacon dans une plaque à remuer et mélanger. Ajuster le pH à 5,8 à l'aide de NaOH tout en continuant à remuer. REMARQUE : L'agar ne se dissoudra pas tant qu'il n'aura pas été autoclaved.</li>
			<li>Ajouter 1 ml de conservateur/biocide et autoclave sur cycle liquide pendant 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirer le milieu de l'autoclave immédiatement après la fin du cycle et le refroidir à 50 oC. Transférer 100 ml de vaisseaux de culture stériles et refroidis de propagation moyen à stérile (p. ex. Magenta ou Plantcon) à l'aide d'une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer le matériel d'explantation.<ol>
<li>Obtenir la source d'explantation comme pommes de terre de semence de Kennebec et enlever toutes les traces de sol en lavant avec le robinet H2O. Enlever les germes et les couper en morceaux de 2 cm avec un scalpel stérile.</li>
			<li>Stériliser les morceaux de germes en trempant pendant 15 s dans 70 % d'éthanol, suivi de 13 min dans 1:1 eau de Javel (1 partie RO-eau : 1 partie d'eau de Javel germicide/commerciale concentrée). Rincer 5 fois dans le H2O stérile.</li>
			<li>Transférer le matériel d'explantation aux vaisseaux stériles de culture de tissu avec le milieu de propagation dans une hotte de culture de tissu utilisant la technique stérile. Transférer les récipients dans une chambre de culture des tissus végétaux et pousser pendant 2 semaines 20123 ou jusqu'à ce que les plantules se forment à 24 oC, 16 h de lumière (140 'mol 'm-2's-1)/8 h photopériode foncée.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Préparer des plants de pommes de terre de culture tissulaire propaganés par nodal.<ol>
<li>Préparer le milieu de transfert nodal. REMARQUE : Cela fera 10 récipients de culture de tissu qui peuvent être employés le même jour ou peuvent être faits à l'avance et stockés à 4 oC jusqu'au transfert nodal.<ol>
<li>Ajouter 36,43 g de mélange d'agar nutritif à 1 L d'eau purifiée dans un flacon de 2 L avec une barre de spin. Transférer le flacon dans une plaque à remuer et mélanger. Ajuster le pH à 5,8 à l'aide de KOH tout en continuant à remuer. REMARQUE : L'agar ne se dissoudra pas tant qu'il n'aura pas été autoclaved.</li>
			<li>Autoclave sur cycle liquide pendant 20 min (121 oC, 101,3 kPa). Retirer le milieu de l'autoclave immédiatement après la fin du cycle et le refroidir à 50 oC. Transférer 100 ml de récipients de transfert nodal refroidis stériles à des récipients de culture stériles (voir le Tableau des matériaux) en utilisant une technique stérile dans une hotte de culture tissulaire.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer les boutures nodales.<ol>
<li>Obtenir des plantules Kennebec cultivées à partir de matériaux d'explantation (produits à l'étape 1.1.2). Les plantlets doivent avoir au moins 3 à 4 nœuds (points de branche). Retirer les feuilles à l'aide de ciseaux stériles ou de scalpel. Couper les branches près de la tige principale, en laissant environ 2 mm de tissu de branche.</li>
			<li>Enlever les sections nodale de la tige en coupant environ 2 mm au-dessus et au-dessous de chaque point de branche ou noeud. Disposer les boutures nodales dans un récipient de culture tissulaire stérile contenant le milieu de transfert nodal (produit à l'étape 1.2.1.2) dans la même orientation que dans le vaisseau précédent (branche pointant vers le haut).</li>
			<li>Transférer les récipients avec des boutures nodales dans une chambre de culture de tissus végétaux et pousser pendant 2'u20123 semaines à 24 'C, 16 h de lumière (140 'mol'm -2's-1)/8 h photopériode sombre. REMARQUE : Chaque coupe nodale se transformera en nouveau plantlet. Le nombre de boutures dans chaque navire détermine la taille des feuilles. Moins de boutures transférées par navire se traduira par de plus grandes feuilles. Trois plantes par navire auront des feuilles de 15 mm x 20 mm en 2'u20123 semaines.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>(Facultatif) Préparer les plants de pommes de terre Kennebec cultivés dans le sol. REMARQUE : Pour produire de plus grandes feuilles, les plantuées de pommes de terre nadiques propagées peuvent être transférées au sol.<ol>
<li>Transférer les plantulets de pommes de terre cultivés dans le milieu de transfert nodal au sol en tirant doucement la plante du milieu jusqu'à ce que tout le tissu racinaire soit libéré de l'agar.</li>
		<li>Transférer au sol juste au-dessus du 1er nœud des racines et emballer légèrement le sol autour de la greffe. Arrosez doucement pour assurer le contact du sol avec le système racinaire.</li>
		<li>Placer dans une chambre de croissance avec une lumière de 16 h (140 'mol 'm-2's-1)/8 h photopériode sombre et 25/20 degrés Celsius de jour/nuit. REMARQUE : Les plantes sont prêtes lorsque les deux feuilles les plus agrandies ont atteint la taille appropriée pour l'assidu.</li>
	</ol></li>
	<li>(Facultatif) Préparer des plants de pommes de terre cultivés dans des tubercules. REMARQUE : Les plants de pommes de terre cultivés à partir de tubercules sont plus gros et plus robustes et peuvent être utiles si l'élevage des larves sur les plantes ou si l'alimentation larvaire de nuit est souhaitée.<ol>
<li>Placer un tubercule de pomme de terre 6 en profondeur dans un pot de 10 contenant du mélange de sol complété par 10 ml d'engrais à libération lente granulés.</li>
		<li>Placer dans une chambre de croissance avec une lumière de 16 h (140 'mol 'm-2's-1)/8 h photopériode sombre et 25/20 degrés Celsius de jour/nuit de température. Les plantes sont prêtes à environ 30'u201240 jours de plantation de tubercules. REMARQUE : N'utilisez pas de plantes qui ont commencé à fleurir.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation des insectes pour l'alimentation
<ol><li>Obtenir l'étape larvaire désirée de M. sexta. REMARQUE : Les larves de cette étude ont été rémunées sur le régime artificiel par le 5ème instar20 et mises en scène par un individu expérimenté de l'insectaire interne. Les larves peuvent également être rémunées partiellement ou complètement sur les tissus végétaux. Les larves ne mangent pas immédiatement avant une mue et sont plus susceptibles de manger juste après la mue, de sorte que la mise en scène appropriée est importante21.</li>
	<li>Transférer les larves dans un récipient de confinement approprié (p. ex., plat de culture tissulaire de 6, 12, 24 puits) selon la taille des larves. Il devrait y avoir une larve par puits dans le plat. REMARQUE : Les larves peuvent afficher un comportement territorial ou cannibale sans source de nourriture et peuvent se blesser si elles sont logées ensemble.</li>
	<li>(Facultatif) Les larves de fémin jusqu'à 2 h, car cela peut améliorer l'alimentation larvaire. REMARQUE : Les larves doivent se siévrer dans un récipient de confinement entreposé dans la chambre de croissance pendant cette période.</li>
</ol>3. Configuration des composants pour l'expérience d'infestation
REMARQUE : Voir le résumé schématique de la figure 1.
<ol><li>Faites des modèles de placement pour chaque point de récolte. REMARQUE: Il est utile de mettre en place 5 plateaux différents pour chaque point de temps de récolte. Cela permet d'organiser les échantillons et permet aux plats d'être déplacés plus efficacement comme un ensemble sans changer leur arrangement. Si des calculs en pourcentage des dommages sont effectués, cela est essentiel car les images avant et après l'infestation doivent être capturées à la même longueur focale.<ol>
<li>Obtenir 5 plateaux robustes capables de tenir un ensemble de six plats Petri de taille appropriée et la ligne avec du papier blanc. REMARQUE : La taille du plat Petri est basée sur la taille des feuilles choisie pour l'alimentation. La feuille doit s'insérer facilement dans le plat sans toucher les côtés. Par exemple, un plat de 60 mm x 15 mm convient aux feuilles jusqu'à 50 mm de longueur ou de largeur.</li>
		<li>Tracer un ensemble de six cercles à l'aide du plat Petri de taille appropriée sur le papier dans chaque plateau. Étiquetez un ensemble de cercles « contrôle » A, B et C et l'autre « infesté » A, B et C. Étiquetez également chaque modèle de placement avec le temps de récolte approprié.</li>
	</ol>
</li>
	<li>(Facultatif) Configurez une caméra pour la capture d'images « avant l'infestation » et « après l'infestation ».<ol>
<li>Fixez une caméra sur un support à la longueur focale appropriée pour la capture d'image de tous les plats Petri dans le modèle de placement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Étiqueter les tubes de temps de récolte.<ol>
<li>Étiqueter un ensemble de tubes microcentrifuges de 30, 1,7 mL correspondant à chaque cercle dans le modèle de placement. Étiqueter les tubes pour identifier de façon appropriée la perturbation (contrôle/infesté), la lettre de réplication de la plante (A, B ou C) et le point de temps de récolte (nombre de minutes après la période d'infestation).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les plats Petri choisis à l'étape 3.1.1.<ol>
<li>Placez un disque de papier filtre stérile dans chacun des 30 plats Petri de l'étape 3.1.1. Ajouter de l'eau stérile pour humidifier les disques; ne laissez pas l'excès d'eau s'enclenfiler dans le plat. Placez chaque plat dans chacun des six cercles dans chaque modèle de placement.</li>
		<li>Placez trois plants de pommes de terre à côté de chaque modèle de placement. Assurez-vous que les plantes ont tous le même âge et la même taille relative.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Effectuer l'infestation
REMARQUE : Un modèle de point de temps de récolte/placement est mis en place à la fois.
<ol><li>Retirer les deux feuilles supérieures assorties de chaque plante avec des ciseaux stériles et placer une feuille dans le plat Petri de contrôle et une dans le plat Petri infesté pour chaque plante (A, B et C). Effectuez ce processus le plus rapidement possible.</li>
	<li>(Facultatif) Transférer le modèle de placement sur le support de la caméra pour capturer une image « avant l'infestation ».</li>
	<li>Transférer les larves dans chaque plat infesté à l'aide de forceps tactiles douces le plus rapidement possible. Définir la minuterie pour le temps d'infestation souhaité. REMARQUE : La période pendant laquelle les larves consomment le tissu foliaire est le « temps d'infestation ». C'est quelque chose qui peut être déterminé empiriquement à l'aide de quelques feuilles/larves d'essai avant le début de l'infestation réelle. Le « temps d'infestation » choisi doit être uniforme pour toutes les feuilles infestées. REMARQUE : Les larves doivent être manipulées avec soin par des forceps tactiles douces. 2ème à 4ème instar peut être saisi doucement par leur corne ou section médiane.</li>
	<li>Observez l'alimentation pour vous assurer que toutes les larves mangent. Les larves doivent être ajoutées/enlevées en fonction du comportement alimentaire. Gardez les couvercles sur la vaisselle Petri autant que possible. REMARQUE : Plusieurs larves peuvent être utilisées par feuille.</li>
	<li>Retirer les larves des feuilles à la fin du temps d'infestation. Démarrer la minuterie pour le temps de récolte.</li>
	<li>(Facultatif) Transférer le modèle de placement sur le support de la caméra pour capturer l'image « après l'infestation ». REMARQUE : Les six feuilles du modèle de placement sont récoltées au moment précis de la récolte.</li>
</ol>5. Récolte des feuilles
<ol><li>Transférer chaque feuille dans le tube étiqueté correspondant à la fin de chaque point de récolte et congeler immédiatement en laissant tomber le tube dans le liquide N2. Conserver les tissus végétaux récoltés à -80 oC jusqu'à l'isolement de l'ARN.</li>
	<li>Répétez les étapes 4-u20125.1 pour chaque point de récolte.</li>
</ol>6. Traitement du tissu foliaire pour l'analyse de l'expression génique
<ol><li>Broyer le tissu foliaire congelé en poudre à l'eau à l'eau.</li>
	<li>Isoler l'ARN total et le processus pour l'expression des gènes comme décrit précédemment22.</li>
</ol>7. (facultatif) Estimation des dommages causés aux feuilles
<ol><li>Estimer visuellement le pourcentage des dommages causés aux feuilles ou calculer la superficie des feuilles dans les images avant et après l'infestation.</li>
	<li>Mesurer la zone des feuilles à l'égard d'outils logiciels (p. ex. Phénophyte)23.</li>
	<li>À partir des mesures de la zone foliaire, calculez le pourcentage des dommages % de dommages - [(zone de feuille avant la zone des feuilles après)/zone de la feuille avant] x 100.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n'ont rien à révéler.

L'utilisation de méthodes d'herbivorie végétale s'enclenchent ensemble n'est pas nécessaire pour atteindre l'objectif de cette étude particulière (c.-à-d. examiner un ensemble de gènes candidats pour leur réponse à l'infestation). L'avantage évident du raffinement détaché de feuille est de raccourcir le temps qu'il prend pour effectuer des essais d'herbivorie. La nature lourde des plantes entières avec des cages à clip est éliminée et les essais sont effectués plus tôt, puisque des plantes aussi jeunes que 2 semaines peu...

Herbivory met en branle une série d'événements moléculaires au cours desquels une plante peut à la fois identifier l'attaque et monter une réponse appropriée pour sa survie. Une plante reçoit deux indices de base des insectes à mâcher; l'un des dommages physiques au tissu et l'autre de substances spécifiques aux insectes. Les modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) sont libérés en réponse aux dommages créés par les parties buccales larvaires etdéclenchent une réponse bien définie de blessure qui a comme conséquence une augmentation de l'acide jasmonique d'hormone et de la transcription des gènes de défense 1. L'un des DAMP les plus connus est la systemine, un polypeptide qui est formé par le clivage de la protéine prosystemine plus grande après une feuille est blessée2,3. La réponse de blessure d'acide jasmonique est encore modulée par des modèles moléculaires herbivore-associés (HAMPs), qui peuventêtre dérivés de la salive de chenille, du contenu d'intestin (régurgitant) et des excréments (frass) 4. Les insectes utilisent ces substances pour stimuler ou échapper à la réponse de la défense5. Les facteurs de transcription relaient alors le message des signaux hormonaux dans la réponse de défense par la régulation des gènes de défense en aval6,7,8.
Certaines études d'interaction plante-insectes utilisées en laboratoire sont du type simulé, dans le but d'approxirér la méthode naturelle d'alimentation de l'insecte. L'herbivorie simulée est généralement accomplie en créant des dommages artificiels aux tissus végétaux avec divers outils qui imitent le mécanisme spécifique des parties buccales d'insecte suffisantes pour causer la libération des DAMP et déclencher la production des gènes de défense. D'autres composants spécifiques aux insectes tels que les sécrétions orales ou régurgitants sont souvent ajoutés pour reproduire la contribution des HAMPs9,10,11. La création d'une taille et d'un type de plaies spécifiques et l'application de quantités précises de HAMP est un avantage pour ces types d'études et peuvent offrir des résultats plus reproductibles. Les études d'herbivorie naturelle, où les dommages aux tissus végétaux sont causés par l'application d'insectes acquis sur le terrain ou élevés en laboratoire, sont souvent plus difficiles parce que les quantités de plaies et de HAMP sont régies par le comportement des insectes et ajoutent de la variabilité à la données. Les méthodes naturelles par rapport aux méthodes simulées et leurs avantages et inconvénients sont bien débattus dans la littérature12,13,14.
Pour étudier les événements de signalisation précoce tels que les facteurs de transcription, un certain pourcentage de la feuille doit être consommé dans un laps de temps relativement court, de sorte que les larves doivent commencer à mâcher immédiatement et maintenir la consommation jusqu'à ce que la feuille soit congelée pour analyse. M. sexta est une mangeoire vorace sur plusieurs plantes solitaires au cours de plusieurs de ses stades larvaires, ce qui le rend idéal pour donner un maximum de dommages dans un laps de temps relativement court15. Ceci est pratique lors de l'étude des événements de signalisation précoce, comme la réponse de la plante se produit presque immédiatement après un insecte entre en contact avec la surface de la feuille16,17. La méthode de confinement couramment utilisée par la cage à agrafes s'avère maladroite, car plusieurs cages nécessiteraient des ajustements continus tout au long de l'expérience pour permettre l'enlèvement ou l'ajout de larves. Les feuilles doivent également être assez grandes et assez fortes pour supporter l'alimentation de plusieurs insectes en même temps. Ces types de plants de pommes de terre ont besoin d'une grande quantité d'espace pour observer l'alimentation. Les larves se déplacent souvent vers le dessous de la surface des feuilles, ce qui rend également les observations d'alimentation assez difficiles. L'utilisation de plantes entières pour effectuer ces expériences est clairement lourde.
L'étude actuelle utilise des feuilles détachées isolées dans les plats Petri plutôt que des plantes entières pour rationaliser et simplifier l'approche végétale entière à l'étude de l'herbivorie. L'application du protocole dans cette étude se limite à l'observation d'un groupe de facteurs de transcription C2H2 induits tôt dans les feuilles de pomme de terre après des dommages herbivores par les larves de M. sexta.

<table><tbody><tr><td>Le produit</td><td>G3251</td> de <td>PhytoTechnology Laboratories</td> est <td></td></tr><tr><td>un récipient de confinement Gelzan (plat de 6, 12 ou 24 puits)</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>08-772-49, 08-772-50, 08-72-51</td><td>de nombreuses autres entreprises vendent ces produits</td></tr><tr><td>Manduca Eggs&nbsp ;</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>143880</td><td>30-50 œufs</td></tr><tr><td>œufs de manduca&nbsp ;</td><td>Ver des Grands Lacs</td><td>NA</td><td>50, 100, 250 ou 500 œufs</td></tr><tr><td>larves de manduca</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>demander des larves spécifiques pour un stade larvaire</td> pour <td>des</td></tr><tr><td>larves de manduca larves de manduca</td><td>des Grands Lacs pour des</td><td>demandes spécifiques pour un stade larvaire</td><td>pour des</td>demandes spécifiques pour un</tr><tr><td>stade Tubes de microcentrifugation pour un stade entier, 1,7 ml&nbsp ;</td><td>Thomas Scientific</td><td>1158R22</td><td>ceux-ci ont été testés dans du N2 liquide et n’exploseront pas</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog (MS) Milieu de base avec vitamines</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M519</td><td>utilisé pour fabriquer le milieu de multiplication</td></tr><tr><td>mélange de gélose nutritive</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>M5825</td><td>le produit est Murashige & Skoog Basal Medium avec vitamines, saccharose et</td></tr><tr><td>disques filtrants en papier</td> Gelzan <td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>09-805A</td><td>Cercles Whatman-achat pour s’adapter à la boîte de Pétri boîte</td></tr> de <tr><td>Pétri, 60X15 mm ou 100X15 mm</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>FB0875713A ou FB0875712</td><td>taille d’achat appropriée pour</td></tr><tr><td>les tubercules de pomme de terre</td> de la taille des feuilles.<td>n’importe quelle</td><td>taille B (non biologique)</td> <td>suggérer Maine Farmer' s Pots d’échange</td></tr><tr><td>, 10"&nbsp ;</td><td>Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td><td>41PT1000CN2</td><td></td></tr><tr><td>conservateur/biocide</td><td>Plant Cell Technology</td><td>Le</td><td>produit NA est PPM (Plant Preservation Mixture)</td></tr> <tr><td>pommes de terre de semence pour explant source</td><td>n’importe quelle</td><td>taille B (non biologique)</td> <td>suggérer Maine Farmer' s</td></tr><tr><td>Engrais à libération lente d’échange (14-14-14 )</td><td>any</td><td>NA</td><td>Osmocote est une</td></tr><tr><td>pince de marque populaire au toucher</td><td>doux BioQuip</td><td>4750</td><td></td></tr><tr><td>mélange de sol</td><td>Griffin Greenhouse Supplies, Inc.</td><td>65-51121</td><td>est un récipient de culture stérile à mélange Sunshine LC1</td></tr><tr><td>.</td><td>PhytoTechnology Laboratories</td><td>C2100</td><td>Récipient de type Magenta, récipient de culture stérile PTL-100</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td>ICN2672206</td><td>produit est MP Biomedicals Plantcon</td></tr></tbody></table>

des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher manduca sexta

Detached Leaf Assays to Simplify Gene Expression Studies in Potato During Infestation by Chewing Insect Manduca sexta

La nature multitrophique des études d'expression génique de l'herbivorie d'insecte exige un grand nombre de répliques biologiques, créant la nécessité de protocoles d'herbivorie plus simples et plus rationalisés. Les perturbations des insectes à mâcher sont généralement étudiées dans des systèmes végétaux entiers. Bien que cette stratégie de l'organisme entier soit populaire, il n'est pas nécessaire que des observations similaires puissent être reproduites en une seule feuille détachée. L'hypothèse est que les éléments de base requis pour la transduction du signal sont présents dans la feuille elle-même. Dans le cas d'événements précoces dans la transduction du signal, les cellules n'ont qu'à recevoir le signal de la perturbation et à transmettre ce signal aux cellules voisines qui sont astoyées pour l'expression des gènes.
La méthode proposée change simplement le moment du détachement. Dans des expériences végétales entières, les larves sont confinées à une seule feuille qui est finalement détachée de la plante et aventurée pour l'expression des gènes. Si l'ordre d'excision est inversé, de la dernière dans des études végétales entières, à la première dans l'étude détachée, l'expérience d'alimentation est simplifiée.
Solanum tuberosum var. Kennebec est propagé par transfert nodal dans un milieu de culture tissulaire simple et transféré au sol pour une croissance ultérieure si désiré. Les feuilles sont excisées de la plante mère et relocalisées dans les plats Petri où l'alimentation est effectuée avec les stades larvaires de M. sexta. Le tissu foliaire endommagé est mis en ligne pour l'expression d'événements relativement précoces dans la transduction du signal. L'analyse de l'expression génique a permis d'identifier des facteurs de transcription Cys2-His2 (C2H2) spécifiques à l'infestation, confirmant le succès de l'utilisation de feuilles détachées dans les études de réponse précoce. La méthode est plus facile à exécuter que les infestations de plantes entières et utilise moins d'espace.

La consommation de feuilles définit le succès du protocole. Les larves saines et bien mises en scène devraient commencer à se nourrir immédiatement après le placement à la surface des feuilles et l'alimentation devrait se poursuivre de façon assez cohérente tout au long du temps d'infestation. Dans la vidéo 1, la larve au sommet commence à mâcher immédiatement après le placement et maintient un taux constant pendant l'alimentation. Ceci est particulièrement important si l...

La méthode présentée crée des tissus végétaux naturels endommagés par l'herbivore grâce à l'application de larves de sexta de Manduca sur des feuilles détachées de pommes de terre. Le tissu végétal est mis en ligne pour l'expression de six homologs de facteur de transcription impliqués dans les réponses précoces à l'herbivorie d'insecte.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

The multitrophic nature of gene expression studies of insect herbivory demands large numbers of biological replicates, creating the need for simpler, more ...

Ce protocole utilise une approche simplifiée pour mesurer l’expression des gènes végétaux en réponse à l’herbivorie des insectes. En utilisant des feuilles détachées isolées dans les boîtes de Pétri, les insectes sont plus faciles à appliquer et à surveiller pendant la période relativement courte d’infestation contribuant à des données reproductibles sur l’expression des gènes. Ce protocole peut être adapté à de nombreuses interactions plantes/insectes.si l’on considère les observations de base de systèmes végétaux entiers. La nature imprévisible de l’alimentation des insectes peut être difficile. Par conséquent, un approvisionnement fiable de larves correctement mises en scène et de plantes saines offrent les meilleures chances de succès.La visualisation de la santé des plantes et des insectes devrait apparaître et se comporter est essentielle à l’obtention de résultats optimaux, en particulier pour les chercheurs nouveaux dans le domaine d’étude. Frances Perez, biologiste moléculaire au laboratoire d’amélioration génétique des fruits et légumes, fera la démonstration de la procédure avec moi. Pour préparer les plants de pommes de terre de culture tissulaire propagée nodale, obtenez d’abord des plantules de Kennebec cultivées à partir de matériaux explantés avec au moins trois à quatre nœuds.Utilisez une lame stérile pour enlever les feuilles qui coupent les branches près de la tige principale et qui laissent environ deux millimètres de tissu de branche par feuille. Couper environ deux millimètres au-dessus et au-dessous de chaque nœud pour enlever les sections nodales des tiges et organiser les boutures nodales dans un récipient stérile de culture tissulaire contenant le milieu de transfert nodal avec la branche pointant vers le haut. Transférez ensuite les boutures nodales dans une chambre de culture des tissus végétaux pendant deux à trois semaines de croissance à 24 degrés Celsius et à une période de photo sombre de 16 heures et de huit heures.Pour préparer les insectes à l’alimentation, obtenir le stade larvaire désiré de M.sexta et transférer une larve dans chaque puits d’un récipient de confinement approprié en fonction de la taille de la larve. Faites des modèles de placement pour chaque point de temps de récolte à l’aide de cinq plateaux robustes capables de tenir un ensemble de six boîtes de Petri de taille appropriée tapissées de papier blanc. Tracez un ensemble de six cercles à l’aide de la boîte petri de taille appropriée sur le papier dans chaque plateau et étiquetez un ensemble de cercles de contrôle A, B et C et l’autre infesté A, B, et C.Then étiqueter chaque modèle de placement avec le temps de récolte approprié.Ensuite, étiquetez un tube de microcentrifugeuse de 1,7 millilitre pour chaque cercle dans le modèle de placement afin d’identifier de façon appropriée la perturbation, la lettre de réplication des plantes et le point de temps de récolte. Lorsque tous les tubes ont été étiquetés, placez un disque de papier filtre stérile dans une boîte de Pétri par modèle et humidifiez les disques avec de l’eau stérile sans laisser l’excès de liquide dans chaque plat. Placez ensuite un plat dans chaque cercle dans chaque modèle de placement et placez trois plants de pommes de terre du même âge et de la même taille relative à côté de chaque modèle de placement.Pour déclencher l’infestation, utilisez des ciseaux stériles pour enlever les feuilles appariées de deux tailles de chaque plante et placer une feuille dans la boîte de Petri de contrôle et une dans la boîte de Pétri infestée pour chaque plante aussi rapidement que possible. Lorsque toutes les feuilles ont été placées, utilisez des forceps tactiles souples pour transférer au moins une larve dans chaque plat infesté le plus rapidement possible et régler la mise à jour pour le temps d’infestation désiré. Observez l’alimentation pour vous assurer que toutes les larves mangent, en remplaçant les larves qui ne se nourrissent pas au besoin.Retirez toutes les larves de toutes les feuilles à la fin du temps d’infestation et commencez la période de la récolte. À la fin de chaque point de temps de récolte, transférer chaque feuille dans le tube correspondant et déposer immédiatement le tube dans de l’azote liquide pour congeler l’échantillon de feuilles avant l’entreposage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’isolement de l’ARN. Les larves en bonne santé avec précision devraient commencer à se nourrir immédiatement après leur placement à la surface des feuilles et l’alimentation devrait se poursuivre de façon assez uniforme tout au long de la période d’infestation.La larve au fond de cette feuille n’a pas consommé de matériel végétal et est un exemple d’infestation infructueuse. Ces feuilles ont été détachées des plantes nodales de culture des tissus nondal de deux semaines et consommées à des taux et des styles d’alimentation différents pour chaque stade larvaire. Sur la base de ces résultats, les larves du quatrième stade ont été sélectionnées pour évaluer davantage les dommages causés aux feuilles pour les plants de pommes de terre cultivés dans le sol plus matures qui se rapprochent davantage des plants de pommes de terre cultivés en champ.Dans ces études d’expression de gène, deux nouveaux facteurs de transcription de doigt de zinc C2H2 qui sont solidement sensibles à l’herbivorie de M.sexta ont été identifiés soutenant l’utilisation des feuilles détachées pour des analyses d’infestation. N’oubliez pas d’utiliser des feuilles appariées en âge et en taille et de bien mettre en scène les larves pour chaque expérience, car l’uniformité se traduit par des données plus reproductibles. Les tissus foliaires peuvent être assayed pour les espèces réactives d’oxygène stress-intronisés et les dérivés jasmonic d’hormone d’acide.Des études complètes de transcriptome, de protéome ou de microbiome peuvent également être effectuées sur les tissus foliaires.

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Source : Shi, J., et al. Dépistage et identification des suppresseurs de silencieux d’ARN à partir des effecteurs sécrétés de pathogènes des plantes. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre un essai de co-infiltration permettant d’identifier les protéines effectrices pathogènes qui suppriment le silence de l’ARN dans Nicotiana benthamiana 16c. Un reporter fluorescent et un gène effecteur candidat sont délivrés dans les feuilles des plantes via Agrobacterium. Normalement, le silence de l’ARN...

Essai de co-infiltration pour le dépistage des effecteurs pathogènes qui suppriment le silence de l’ARN végétal

Source : Rufián, J. S., et al. Analyse unicellulaire de l’expression des gènes de Pseudomonas syringae dans les tissus végétaux. J. Vis. Exp. (2022).Cette vidéo démontre une méthode d’analyse de l’expression génique dans des bactéries pathogènes extraites de plantes au niveau unicellulaire en utilisant un facteur de transcription marqué fluorescentement. L’imagerie confocale révèle une hétérogénéité dans l’expression des gènes de virulence, mettant en lumière la diversité fonctionnelle au sein...

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La quantification de la croissance des agents pathogènes est un outil puissant pour caractériser diverses réponses immunitaires d’Arabidopsis thaliana (ci-après : Arabidopsis). La méthode décrite ici présente un test d’infiltration à la seringue optimisé pour quantifier le Pseudomonas syringae pv. maculicola Croissance d’ES4326 dans les feuilles adultes d’Arabidopsis.

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De nombreux gènes importants pour le développement ont des modèles d’expression spécifiques aux cellules ou aux tissus. Cet article décrit des expériences de séquençage de l’ARN LM pour identifier les gènes qui sont exprimés de manière différentielle à la limite limbe-gaine de la feuille de maïs et chez les mutants lg1-R par rapport aux mutants de type sauvage. Les considérations expérimentales discutées ici s’appliquent aux analyses transcriptomiques d’autres phénomènes de développement.

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Ici, nous présentons une méthode de criblage modifiée qui peut être employée intensivement pour examiner rapidement des suppresseurs de silençage d'ARN dans les agents pathogènes de plante.

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Nous présentons un protocole détaillé pour le système de silençage microARN (VbMS) à base du virus X de la pomme de terre (PVX) pour caractériser fonctionnellement les microARN endogènes (miARN) dans la pomme de terre. Les molécules d’imitation cible (TM) de miARN d’intérêt sont intégrées dans le vecteur PVX et exprimées transitoirement dans la pomme de terre pour faire taire la famille de miARN ou miARN cible.

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Découvrez une méthode simplifiée pour étudier l'expression génique de la pomme de terre en réponse à l'herbivorie par Manduca sexta. Ce protocole utilisant des feuilles détachées offre des données reproductibles et contrôlées.

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur lexpression génique de la pomme de terre pendant linfestation par linsecte à mâcher Manduca sexta (Vidéo) | JoVE Journal

Des essais de feuilles détachées pour simplifier les études sur l'expression génique de la pomme de terre pendant l'infestation par l'insecte à mâcher Manduca sexta

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