Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume
19 mars 2019
Nous présentons ici un protocole permettant de combiner deux techniques traitement échantillon haute pression gel et traitement des échantillons assistée par micro-ondes, suivie de minime résine enrobage d’acquisition de données avec un microscope électronique à balayage faisceau ionique focalisé (FIB-SEM). Cela est démontré à l’aide d’un échantillon de nerf tibial de souris et le Caenorhabditis elegans.
Cette technique de préparation d’échantillon est conçue pour combiner la meilleure qualité de conservation d’ultrastructure avec le contraste le plus approprié pour la modalité d’imagerie dans un microscope électronique focalisé de balayage de faisceau d’ion. Ce protocole est particulièrement utile pour les échantillons qui nécessitent une préparation par congélation à haute pression pour une préservation fiable de l’ultrastructure, mais qui ne sont pas suffisamment contrastés pendant la substitution de gel à l’imagerie en volume. Pour l’intégration minimale de résine, il est essentiel d’enlever autant de résine que possible pour permettre un ciblage approprié plus tard dans le microscope électronique à balayage de faisceau iion focalisé.
Pour commencer, utilisez la pipette pour goutte à goutte une goutte de 20%PVP PBS sur le tapis de coupe. Plonger le nervus tibialis disséqué dans la gouttelette. Utilisez le scalpel pour couper deux millimètres de longueur de l’échantillon.
Utilisez des forceps fins pour placer l’échantillon dans un porte-échantillons métallique de type A de 0,2 millimètre de profondeur. Transférer le support dans la plaque centrale de la cartouche. Placez le support de type B recouvert d’hexadécane sur le dessus comme couvercle.
Fermer l’assemblage en abaissant la moitié supérieure de la cartouche. Fermez la cartouche de trois pièces dans la station de chargement du congélateur haute pression. Appuyez sur le bouton de processus et procédez selon les instructions de fonctionnement du fabricant.
Dans un bain d’azote liquide, placer les porteurs d’échantillons dans des flacons cryo contenant deux millilitres d’acide tannique congelé de 0,1 % et d’acétone et fermer les bouchons. Placez les flacons cryo dans l’unité de substitution de gel fixée à moins 90 degrés Celsius. Démarrez le programme et gardez les échantillons là pendant 100 heures.
Dans l’unité de substitution de congélation, laver les échantillons avec deux millilitres d’acétone trois fois pendant 30 minutes. Placez 2% de tétoxyde d’osmium dans l’acétate d’uranyle de 0,1 % dans l’unité de substitution de gel pour le refroidissement et ajoutez-le aux échantillons pendant sept heures en continuant à tacher à moins 90 degrés Celsius. Lorsque la température du programme dans l’unité de substitution du gel atteint moins 20 degrés Celsius, gardez les échantillons là-dedans pendant encore 16 heures.
Lorsque la température monte à 4 degrés Celsius, jeter le liquide dans les flacons et remplir l’acétone pure. Retirer les flacons cryo de l’unité de substitution de gel. La manipulation de l’échantillon avant la congélation et après l’osmofication est essentielle puisque l’échantillon peut être gravement endommagé.
Dans un capot de fumée, utilisez des forceps fins pour enlever les porteurs métalliques des flacons cryo et transférer les échantillons des porteurs pour les submerse dans un plat en verre de montre de 150 millimètres de profondeur rempli d’acétone. Utilisez des forceps fins pour transférer les échantillons dans deux tubes de réaction millilitre remplis d’acétone. Réglez le four à micro-ondes à 250 watts pendant 40 secondes et démarrez le four à micro-ondes pour laver les échantillons et répéter quatre fois.
Pipette un millilitre de 1% thiocarbohydrazide solution dans le tube de réaction et le mettre dans le micro-ondes. Allumez la fonction vide avec deux minutes et deux minutes d’absence, en itérant pendant un total de 14 minutes et réglez-la à 150 watts. Démarrez le micro-ondes.
Lavez l’échantillon quatre fois en acétone comme auparavant. Pipette un millilitre de 2% osmium solution de tétoxyde dans le tube de réaction. Placez l’échantillon au micro-ondes et utilisez les mêmes réglages micro-ondes qu’avec le thiocarbohydrazide.
Lavez l’échantillon quatre fois en acétone comme auparavant. Pipette un millilitre de 25% de résine dans l’acétone dans le tube de réaction et le mettre au micro-ondes. Allumez la fonction vide pendant trois minutes et réglez-la à 250 watts.
Démarrez le micro-ondes. Utilisez un cure-dent pour retirer le nervus tibialis du tube de réaction et les placer sur un morceau de film plastique. Placez une lampe halogène près des échantillons pour chauffer la résine.
À l’aide d’un cure-dent, poussez doucement l’échantillon sur le film plastique jusqu’à ce qu’aucune résine restante ne soit détectée. Mettez le film plastique avec l’échantillon sur le dessus dans le four et réglez la température à 60 degrés Celsius pour polymériser les échantillons pendant au moins 48 heures. Utilisez une lame de rasoir pour découper les échantillons polymérisés ainsi que le film plastique à une taille qui convient au talon SEM.
Utilisez un cure-dent pour ajouter de la résine d’argent conductrice sur les talons SEM et y fixer les échantillons coupés. Et puis ajouter de la résine autour des échantillons. Mettez les talons SEM dans le four pour polymériser à 60 degrés Celsius pendant au moins 4 heures ou toute la nuit.
Après polymérisation, placez les talons SEM dans un revêtement de pulvérisateur. Réglez le revêtement de pulvérisateur à 35 milliamperes et appliquez 10 nanomètres d’épaisseur revêtement or ou manteau pendant une minute. Après le revêtement, placez les talons SEM à l’intérieur du microscope électronique à balayage du faisceau iion focalisé.
Dans cette étude, un protocole amélioré a été exécuté pour nervus tibialis de la souris aussi bien que C.elegans pour illustrer la conservation optimale et le contraste pour exécuter la formation image de volume 3D avec un microscope électronique focalisé de balayage de faisceau d’ion. Protocoles standard souffrent souvent d’un manque de contraste membranaire où que le protocole amélioré fournit un fort contraste membranaire. Les images transversales de C.elegans avec protocole amélioré et protocole standard montrent une différence distinctive.
En plus des images transversales de nervus tibialis, le protocole amélioré aide à montrer un contraste membranaire plus fort par rapport au protocole standard. Après le post-traitement, les données du microscope électronique sont visualisées à l’aide d’IMOD, un programme de traitement et de modélisation d’images. La zone surlignée de bleu montre des axones segmentés.
La zone surlignée en rouge montre les paquets Remak. Les zones jaunes et oranges présentent des gaines de myéline. Et la zone turquoise montre des mitochondries.
Le découpage virtuel et le modèle tridimensionnel illustrent l’architecture des tissus fins et aident à comprendre sa fonction. D’autres méthodes de microscopie électronique à balayage de volume peuvent être utilisées ainsi que la microscopie électronique à balayage de bloc-face en série et la tomographie de tableau. Ce protocole peut également être utilisé pour la microscopie électronique de transmission et d’autres types d’échantillons tels que des échantillons du système nerveux central.
Le tétoxyde d’osmium, le thiocarbohydrozide et l’acétate d’uranyl sont des produits chimiques toxiques et doivent être utilisés avec soin. La résine est également nocive et doit être utilisée avec soin. L’équipement de protection individuelle comme les gants et le manteau de laboratoire doit être porté pour le protocole complet.
Aperçu
Cette étude présente un protocole amélioré de préparation des échantillons qui combine la congélation à haute pression et le traitement assisté par micro-ondes afin d'améliorer la préservation de l'ultrastructure et le contraste en imagerie. En utilisant le nerf tibial de souris et Caenorhabditis elegans comme systèmes modèles, la technique démontre des avantages significatifs par rapport aux protocoles standards en termes de contraste membranaire et de capacités d'imagerie 3D.
Composantes clés de l'étude
Domaine de recherche
- Microscopie
- Techniques d'imagerie
- Préparation des échantillons
Contexte
- La préservation de l'ultrastructure est essentielle pour un imagerie efficace.
- Les protocoles standard échouent souvent à fournir un contraste adéquat pour certains tissus.
- La combinaison de plusieurs techniques peut améliorer les résultats d'imagerie.
Méthodes utilisées
- Congélation à haute pression et traitement des échantillons assisté par micro-ondes
- Nerf tibial de souris et Caenorhabditis elegans
- Microscopie électronique à balayage par faisceau d'ions focalisés (FIB-SEM)
Résultats principaux
- Le protocole amélioré offre un meilleur contraste de la membrane par rapport aux méthodes standard.
- Les images en coupe transversale illustrent des différences nettes dans la visualisation structurale.
- Les résultats confirment l'efficacité du protocole pour l'imagerie détaillée en volume 3D.
Conclusions
- La présente étude démontre que la combinaison de techniques de traitement spécifiques améliore considérablement la qualité de l'imagerie.
- Le protocole est pertinent pour divers échantillons biologiques et peut contribuer à la compréhension de l'architecture tissulaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Ce protocole comble une lacune critique dans l'imagerie ultrastructurale, là où la congélation classique sous haute pression ne fournit pas un contraste suffisant pour l'imagerie volumique en FIB-SEM. En améliorant le contraste des membranes grâce à une coloration assistée par micro-ondes et à un inclusion minime dans la résine, il permet une reconstruction 3D fiable des tissus nerveux. Cela soutient la validation des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans les flux de découverte en neurosciences en fournissant des données structurales prédictives et de haute fidélité.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet l'interrogation d'hypothèses thérapeutiques grâce à la préservation de l'ultrastructure et à un contraste membranaire amélioré dans les tissus nerveux.
- Valeur opérationnelle : Réduit l'ambiguïté dans les études d'engagement ciblé en fournissant une visualisation claire des architectures axonales et de la myéline.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques validés produisant des données ultrastructurales quantitatives pour le criblage de composés en aval.
- Valeur opérationnelle : Garantit la standardisation et la reproductibilité des tests grâce à une amélioration du contraste constante et à un enrobage minimal dans la résine.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Permet la modélisation liée aux maladies en préservant l'architecture tissulaire fine des échantillons du système nerveux central.
- Valeur opérationnelle : Assure la continuité depuis la découverte jusqu'à la validation préclinique grâce à la génération reproductible de données volumétriques 3D.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de la découverte, de l'identification de la cible à l'évaluation préclinique, en particulier pour les programmes axés sur les neurosciences nécessitant une validation structurale.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification des hypothèses et la clarification des voies biologiques en résolvant les structures subcellulaires essentielles à la fonction neuronale.
- Écrans (screening) : Assure la préparation aux tests grâce à des échantillons reproductibles et à fort contraste, adaptés aux flux automatisés d'imagerie FIB-SEM.
- Analyse : Produit des données morphométriques quantitatives (par exemple, diamètre de l'axone, épaisseur de la myéline) permettant des analyses comparatives entre différentes conditions.
- Recherche translationnelle : Assure une continuité préclinique en modélisant l'architecture tissulaire liée aux mécanismes des maladies dans les neuropathies.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable de validation ultrastructurale pour plusieurs programmes ciblant le système nerveux.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Confiance prédictive dans la validation des cibles grâce à une ambiguïté mécanistique réduite concernant l'ultrastructure neuronale.
- Valeur opérationnelle : Normalisation, reproductibilité et évolutivité de la préparation des échantillons pour des campagnes d'imagerie à haut débit.
- Valeur stratégique : Amélioration des décisions d'engagement ou de rejet grâce à des biomarqueurs structuraux fiables, réduisant ainsi les risques biologiques en phase avancée dans les programmes du SNC.
- Impact sur le portefeuille : Priorisation ajustée au risque des cibles neuronales selon des phénotypes ultrastructuraux validés.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Des compétences en congélation à haute pression, en traitement assisté par micro-ondes et en microscopie électronique sont requises.
- L'accès à des congélateurs à haute pression, à des appareils de traitement par micro-ondes, à un FIB-SEM et à des pulvérisateurs cathodiques est essentiel.
- Une standardisation entre équipes, entre les unités d'histologie, d'imagerie et d'analyse de données, est nécessaire pour obtenir des résultats cohérents.
- L'adaptation à différents systèmes modèles (par exemple, souris, C. elegans, tissu humain) nécessite une optimisation des durées de coloration et d'inclusion.
- Les limites pratiques incluent la manipulation de réactifs toxiques (tétraoxyde d'osmium, acétate d'uranyle) et des durées prolongées de traitement pour la substitution à froid et la polymérisation.
