Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

Cette technique de préparation d’échantillon est conçue pour combiner la meilleure qualité de conservation d’ultrastructure avec le contraste le plus approprié pour la modalité d’imagerie dans un microscope électronique focalisé de balayage de faisceau d’ion. Ce protocole est particulièrement utile pour les échantillons qui nécessitent une préparation par congélation à haute pression pour une préservation fiable de l’ultrastructure, mais qui ne sont pas suffisamment contrastés pendant la substitution de gel à l’imagerie en volume. Pour l’intégration minimale de résine, il est essentiel d’enlever autant de résine que possible pour permettre un ciblage approprié plus tard dans le microscope électronique à balayage de faisceau iion focalisé.

Pour commencer, utilisez la pipette pour goutte à goutte une goutte de 20%PVP PBS sur le tapis de coupe. Plonger le nervus tibialis disséqué dans la gouttelette. Utilisez le scalpel pour couper deux millimètres de longueur de l’échantillon.

Utilisez des forceps fins pour placer l’échantillon dans un porte-échantillons métallique de type A de 0,2 millimètre de profondeur. Transférer le support dans la plaque centrale de la cartouche. Placez le support de type B recouvert d’hexadécane sur le dessus comme couvercle.

Fermer l’assemblage en abaissant la moitié supérieure de la cartouche. Fermez la cartouche de trois pièces dans la station de chargement du congélateur haute pression. Appuyez sur le bouton de processus et procédez selon les instructions de fonctionnement du fabricant.

Dans un bain d’azote liquide, placer les porteurs d’échantillons dans des flacons cryo contenant deux millilitres d’acide tannique congelé de 0,1 % et d’acétone et fermer les bouchons. Placez les flacons cryo dans l’unité de substitution de gel fixée à moins 90 degrés Celsius. Démarrez le programme et gardez les échantillons là pendant 100 heures.

Dans l’unité de substitution de congélation, laver les échantillons avec deux millilitres d’acétone trois fois pendant 30 minutes. Placez 2% de tétoxyde d’osmium dans l’acétate d’uranyle de 0,1 % dans l’unité de substitution de gel pour le refroidissement et ajoutez-le aux échantillons pendant sept heures en continuant à tacher à moins 90 degrés Celsius. Lorsque la température du programme dans l’unité de substitution du gel atteint moins 20 degrés Celsius, gardez les échantillons là-dedans pendant encore 16 heures.

Lorsque la température monte à 4 degrés Celsius, jeter le liquide dans les flacons et remplir l’acétone pure. Retirer les flacons cryo de l’unité de substitution de gel. La manipulation de l’échantillon avant la congélation et après l’osmofication est essentielle puisque l’échantillon peut être gravement endommagé.

Dans un capot de fumée, utilisez des forceps fins pour enlever les porteurs métalliques des flacons cryo et transférer les échantillons des porteurs pour les submerse dans un plat en verre de montre de 150 millimètres de profondeur rempli d’acétone. Utilisez des forceps fins pour transférer les échantillons dans deux tubes de réaction millilitre remplis d’acétone. Réglez le four à micro-ondes à 250 watts pendant 40 secondes et démarrez le four à micro-ondes pour laver les échantillons et répéter quatre fois.

Pipette un millilitre de 1% thiocarbohydrazide solution dans le tube de réaction et le mettre dans le micro-ondes. Allumez la fonction vide avec deux minutes et deux minutes d’absence, en itérant pendant un total de 14 minutes et réglez-la à 150 watts. Démarrez le micro-ondes.

Lavez l’échantillon quatre fois en acétone comme auparavant. Pipette un millilitre de 2% osmium solution de tétoxyde dans le tube de réaction. Placez l’échantillon au micro-ondes et utilisez les mêmes réglages micro-ondes qu’avec le thiocarbohydrazide.

Lavez l’échantillon quatre fois en acétone comme auparavant. Pipette un millilitre de 25% de résine dans l’acétone dans le tube de réaction et le mettre au micro-ondes. Allumez la fonction vide pendant trois minutes et réglez-la à 250 watts.

Démarrez le micro-ondes. Utilisez un cure-dent pour retirer le nervus tibialis du tube de réaction et les placer sur un morceau de film plastique. Placez une lampe halogène près des échantillons pour chauffer la résine.

À l’aide d’un cure-dent, poussez doucement l’échantillon sur le film plastique jusqu’à ce qu’aucune résine restante ne soit détectée. Mettez le film plastique avec l’échantillon sur le dessus dans le four et réglez la température à 60 degrés Celsius pour polymériser les échantillons pendant au moins 48 heures. Utilisez une lame de rasoir pour découper les échantillons polymérisés ainsi que le film plastique à une taille qui convient au talon SEM.

Utilisez un cure-dent pour ajouter de la résine d’argent conductrice sur les talons SEM et y fixer les échantillons coupés. Et puis ajouter de la résine autour des échantillons. Mettez les talons SEM dans le four pour polymériser à 60 degrés Celsius pendant au moins 4 heures ou toute la nuit.

Après polymérisation, placez les talons SEM dans un revêtement de pulvérisateur. Réglez le revêtement de pulvérisateur à 35 milliamperes et appliquez 10 nanomètres d’épaisseur revêtement or ou manteau pendant une minute. Après le revêtement, placez les talons SEM à l’intérieur du microscope électronique à balayage du faisceau iion focalisé.

Dans cette étude, un protocole amélioré a été exécuté pour nervus tibialis de la souris aussi bien que C.elegans pour illustrer la conservation optimale et le contraste pour exécuter la formation image de volume 3D avec un microscope électronique focalisé de balayage de faisceau d’ion. Protocoles standard souffrent souvent d’un manque de contraste membranaire où que le protocole amélioré fournit un fort contraste membranaire. Les images transversales de C.elegans avec protocole amélioré et protocole standard montrent une différence distinctive.

En plus des images transversales de nervus tibialis, le protocole amélioré aide à montrer un contraste membranaire plus fort par rapport au protocole standard. Après le post-traitement, les données du microscope électronique sont visualisées à l’aide d’IMOD, un programme de traitement et de modélisation d’images. La zone surlignée de bleu montre des axones segmentés.

La zone surlignée en rouge montre les paquets Remak. Les zones jaunes et oranges présentent des gaines de myéline. Et la zone turquoise montre des mitochondries.

Le découpage virtuel et le modèle tridimensionnel illustrent l’architecture des tissus fins et aident à comprendre sa fonction. D’autres méthodes de microscopie électronique à balayage de volume peuvent être utilisées ainsi que la microscopie électronique à balayage de bloc-face en série et la tomographie de tableau. Ce protocole peut également être utilisé pour la microscopie électronique de transmission et d’autres types d’échantillons tels que des échantillons du système nerveux central.

Le tétoxyde d’osmium, le thiocarbohydrozide et l’acétate d’uranyl sont des produits chimiques toxiques et doivent être utilisés avec soin. La résine est également nocive et doit être utilisée avec soin. L’équipement de protection individuelle comme les gants et le manteau de laboratoire doit être porté pour le protocole complet.