Injection directe d’un vecteur Lentiviral met en évidence plusieurs voies motrices de la moelle épinière de Rat

Les vecteurs viraux peuvent introduire du matériel génétique dans les cellules pour compenser les gènes défectueux, pour réguler les protéines de croissance importantes, ou pour fabriquer des marqueurs qui peuvent tracer des circuits neuronaux. L’introduction de vecteurs viraux dans le système nerveux est difficile en raison des barrières biologiques innées. L’injection directe dans le tissu médullaire contourne ces barrières, permettant l’accès aux corps cellulaires ou aux synapses.

Il peut être difficile de cibler correctement les niveaux rachidiens de L1 à L4. Il est important d’utiliser des repères pour vérifier la cible et n’oubliez pas que ces segments s’alignent vers les vertèbres T11 à T13. Le jour de la procédure, branchez l’injecteur dans la micro-pompe et placez la micro-pompe dans un micromanipulateur à l’échelle vernier.

Utilisez une seringue avec une aiguille flexible pour charger soigneusement un colorant coloré dans l’une des aiguilles en verre et insérer l’aiguille en verre dans l’injecteur. Ensuite, confirmez que l’aiguille est ensemencée correctement dans les rondelles, et que le bouchon de l’injecteur est vissé sur serré, et que l’aiguille injecteur d’acier est prolongée d’environ trois quarts de la longueur de l’aiguille en verre. Avant de commencer l’intervention, décongeler au moins un microlitre, plus un petit volume de virus supplémentaire par injection provenant de l’entreposage du congélateur, et confirmer un manque de réponse de pincement des pieds chez un rat anesthésié.

Raser le long de la ligne médiane dorsale des hanches à l’angle inférieur de l’omoplate de l’animal, en tirant la peau tendue pour un rasage plus facile et plus précis, et désinfecter la peau exposée avec séquentielle 5% iode et 70% gommages à l’éthanol. Appliquer de l’onguent ophtalmique sur les deux yeux. Placez ensuite l’animal sur un tissu stérile et placez de la gaze sous la vessie pour recueillir l’urine.

Pour identifier l’emplacement de l’incision cutanée, appuyez doucement sur les doigts à la dernière côte pour localiser la vertèbre L1. En utilisant cette vertèbre comme point de repère et en tenant la peau tendue par la propagation douce tout en appuyant fermement avec le scalpel, utilisez une lame chirurgicale numéro 10 pour faire une incision écorchée de trois à quatre centimètres se terminant juste inférieur à L1 pour exposer le muscle. Utilisez des forceps et des ciseaux pour ressentir les processus épineux.

Faire de petites coupes rostrales pour permettre à l’espace de saisir solidement sur un processus supérieur avec des forceps de dent de rat. Et faire deux longues coupures profondes aussi près que possible des processus. Après avoir sécurisé les muscles lauraux en place, effacer le muscle autour des processus pour déterminer la forme de leurs têtes.

Visualisez ensuite les formes des têtes des processus épineux afin d’identifier le site de laminectomie. Les processus T11 et T12 et T13 seront le site de la laminectomie. Une fois que la zone cible a été correctement identifiée, écartez doucement les vertèbres pour révéler les ligaments intervertébraux, et utilisez des rongeurs pour prendre de petites morsures des processus épineux et de l’aspect dorsal des vertèbres.

Dégagez l’os loin de la ligne médiane afin que le vaisseau sanguin de ligne médiane puisse être observé, laissant une fenêtre qui révèle clairement le tissu médullaire et est exempte de débris. Attachez ensuite les forceps stabilisateurs aux processus épineux rostral et caudal à la fenêtre de laminectomie pour fixer l’animal dans un support spinal. Et soulever l’abdomen de l’animal pour nier l’effet des mouvements respiratoires.

Pour charger le virus dans l’injecteur, pipette environ cinq microlitres du stock décongelé sur un morceau de Parafilm, et de positionner les aiguilles de verre de sorte que la pointe est à l’intérieur de la goutte. Utilisez la micro-pompe pour retirer jusqu’à quatre microlitres de virus à un taux de 20 à 100 nanolitres par seconde, et réglez le contrôleur à injecter avant de libérer une petite quantité de virus de la pointe de l’aiguille pour s’assurer qu’il n’est pas bloqué. Essuyez tout excès de virus avec un lingette de laboratoire et placez les micromanipulateurs de sorte que l’échelle vernier soit visible.

Placez l’aiguille au milieu de la moelle épinière et utilisez l’écaille vernier sur le micromanipulateur pour diriger l’aiguille latéralement de 0,8 millimètre. Ensuite, abaissez l’aiguille à l’accord rachidien jusqu’à ce qu’elle soit en retrait, mais pas perforant, le dura, et utilisez un mouvement de torsion rapide pour percer le dura avec l’aiguille jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille a coulé à une profondeur de 1,5 millimètres. Une fois l’aiguille en place, programmez l’injecteur pour délivrer le virus à un taux de 400 nanolitres par minute, et confirmez que le virus pénètre dans la moelle épinière en observant la progression du front de teinture.

Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille reposer dans la moelle épinière pendant deux à cinq minutes pour faciliter la diffusion du virus, avant de retirer lentement l’aiguille pour le positionner au prochain site d’injection. Après la dernière injection, retirer l’animal du porte-rachidien pour permettre l’ablation de tous les dispositifs utilisés pour propager le muscle latéral. Ensuite, fermez le muscle avec une suture de catgut chromique de 4,0 et agrafez la peau avec des pinces à plaies de neuf millimètres.

Quatre semaines après une injection réussie, l’expression significative de GFP est observée dans les neurones dans la matière grise de la moelle épinière thoracique sur le côté, ipsilateral à l’injection. Dans la matière blanche, l’expression GFP est observée dans les axones du cordon ipsilateral, en particulier dans les zones typiques des axones propriospinaux. Un grossissement plus élevé des neurones de la matière grise révèle un exemple d’expression typique du signal dans les corps cellulaires neuronaux et les dendrites.

L’expression de GFP dans les neurones peut également être observée dans les noyaux de tronc cérébral, tels que dans la formation réticulaire de pontine. Les facteurs clés pour une procédure réussie d’injection de moelle épinière sont le ciblage vertébral correct et s’assurant que le virus entre dans le tissu Si une lésion rostrale de moelle épinière est exécutée avant cette procédure, l’injection directe peut être employée pour tracer des neurones qui rétablissent des connexions autour de la blessure.