Name: Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: Découvrez la mesure des espèces réactives de l'oxygène (ROS) par cytométrie en flux dans les macrophages après réticulation des récepteurs FcγR. Cette méthode permet d'évaluer le stress oxydatif et les réponses immunitaires.

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Les auteurs tiennent à remercier les autres membres du laboratoire Tigno-Aranjuez notamment Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy et Roopin Singh pour leur aide dans l’entretien de colonie entretien et de la souris de laboratoire. Cette recherche a été fourni par R00 HL122365 de subventions et de fonds de démarrage à J.T.T-A.

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<li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation%3A+another+inconvenient+truth%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

DHFC2-DA et détection DHE de ROS est une technique largement utilisée14,15. Facilité d’utilisation et l’adaptabilité de ces sondes ROS pour les formats microplaques cinétiques, analyse de fluorescence microscopie ou flux de cytométrie de flux a contribué à leur popularité. Toutefois, dans nos études des fonctions de médiation FcγR macrophage, il semblait être un protocole standard pour la réalisation de cet essai pour cytométrie de FcγR cellules réticu...

Espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont des molécules réactives ou des radicaux libres qui sont des sous-produits de la respiration aérobie (évaluée à 1). Il s’agit de l’anion superoxyde, peroxyde, peroxyde d’hydrogène, radical hydroxyle et ions d’hydroxyle, entre autres. Dans des conditions physiologiques normales, ROS sont produites principalement par les mitochondries et les oxydases de nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) et sont rapidement détoxifiés par diverses enzymes et protéines comme la superoxyde dismutase et de glutathion. Une production exagérée de ROS ou un défaut de la possibilité de supprimer les ROS peut entraîner un stress oxydatif, selon laquelle les espèces réactives de l’oxygène promouvoir les dégâts des protéines, les lipides et l’ADN entraînant stress cellulaire ou mort et les États pathologiques de la maladie. Cependant, on constate actuellement que ROS peut aussi servir de molécules de signalisation (signalisation redox) et ROS induite par la modification des différentes molécules et intermédiaires de la voie peut influer sur le métabolisme cellulaire, la prolifération, la survie, inflammatoire signalisation et le vieillissement2. Dans les cellules phagocytaires, ROS joue un rôle essentiel en fournissant une activité antimicrobienne durant la soi-disant « burst respiratoire »1,3,4,5,6. Au cours de la réaction des phagocytes à des stimuli externes, composants de la NADPH oxydase complexe (p40phox, p47phox, p67phox) translocation du cytosol vers la membrane phagosome contenant la gp91phox et p22phox sous-unités, et avec les actions de Rac1/2, forment un entièrement fonctionnel NADPH oxydase complexe enzymatique. La NADPH oxydase Assemblée puis utilise NADPH pour réduire l’oxygène de superoxyde dans la vacuole phagosome. Les anions superoxyde peuvent causer directement des dommages ou être dismutated en peroxyde d’hydrogène. Superoxyde et peroxyde d’hydrogène peuvent réagir avec d’autres molécules pour générer des radicaux hydroxyles très réactifs. Dommage est médiée par la réaction de ces ROS avec les clusters fer-soufre sur des protéines ou en provoquant une base oxydation de l’ADN, conduisant finalement à métabolisme microbien restreint ou mort du microbe5. L’importance de l’enzyme oxydase de NADPH complexe et ROS produites pendant l’explosion respiratoire est illustrée sur le plan clinique chez les patients avec maladie granulomateuse chronique (CGD)7,8,9, 10. individus avec DMC possèdent des mutations gp91phox, ce qui entraîne un manque de production de ROS et la susceptibilité aux infections récurrentes avec les bactéries et les champignons qui ne sont pas habituellement une préoccupation avec les individus immunocompétents. Par conséquent, si étudiant oxidative stress, signalisation redox ou défense de l’hôte, étant capable de mesurer la production de ROS en temps réel est un effort utile.
Plusieurs essais ont été utilisés pour la production de ROS de mesure ou les résultats du stress oxydatif11,12,13. Parmi ceux-ci, un des plus couramment utilisé est la sonde fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacétate (DHFC2-DA)14. Cette molécule est incolore et lipophiles. Diffusion de DHFC2-DA à travers la membrane de la cellule lui permet d’être commandés par des estérases intracellulaires, qui il deacetylates en DHFC2, rendant la cellule imperméable. Les actions de plusieurs types de ROS (peroxyde d’hydrogène, peroxynitrite, les radicaux hydroxyles, oxyde nitrique et radicaux peroxy) sur DHFC2 il s’oxyder en DCF qui est fluorescent (déclarés Ex / Em : 485-500 nm/515-530 nm) et peut être détecté à l’aide d’un flux cytomètre équipé d’un filtre standard défini pour la fluorescéine (FL1 canal). Superoxyde ne réagit pas fermement avec DHFC2 mais elle peut réagir avec une autre sonde dihydroethidium (DHE) pour donner le produit fluorescent 2-hydroxyethidium (ainsi que d’autres produits d’oxydation de superoxyde indépendant fluorescent)15. Les produits fluorescents d’oxydation DHE peuvent être détectés à l’aide d’une longueur d’onde d’excitation de 518 nm et une longueur d’onde d’émission de 605 nm (FL2 canal). Bien que relativement simple d’utilisation, utilisation de ces sondes de détection de ROS nécessite une connaissance de leurs limites et intégration minutieuse de coloration des procédures et des contrôles dans le dosage spécifique en cours afin d’avoir valide expérimentale résultats et conclusions. Le protocole suivant illustre l’utilisation d’un kit disponible dans le commerce qui emploient ces 2 sondes conçues pour mesurer les ROS par cytométrie en flux. Nous avons tache apprêtées macrophages dérivés de la moelle osseuse avec ces sondes et induire la production de ROS par réticulation FcγR. Nous présentons des données représentatives obtenues à l’aide de ce protocole et insister sur les précautions appropriées doivent être entrepris dans une expérimentation réussie.

<table><tbody><tr><td>Anti-BSA IgG1</td><td>Recherche innovante</td><td>IBSA9E2C2</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &kappa ; Isotype Ctrl Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>400626</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris F4/80 conjugué à Alexa Fluor 647</td><td>BD Biosciences</td><td>565853</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris F4/80 conjugué à FITC</td><td>BioLegend</td><td>123108</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-souris/humain CD11b conjugué à Alexa Fluor 647&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>101218</td><td></td></tr><tr><td>bêta-mercaptoéthanol (BME)</td><td>Sigma</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) FractionV</td><td>Fisher</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J&nbsp ;</td><td>Jackson labs</td><td>Code commande 000664</td><td></td></tr><tr><td>Sondes moléculaires</td><td>CM-H2DCFDA</td><td>C6827</td><td>Peut être un substitut du réactif de détection du stress oxydatif dans le kit Enzo</td></tr> <tr><td>Sondes moléculaires</td><td>de dihydroéthidium (DHE)</td><td>D11347</td><td>Peut être un substitut du réactif de détection de superoxyde dans le kit Enzo</td></tr><tr><td>DMEM 1x</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>31053-028</td><td></td></tr><tr><td>DMF Anhydre&nbsp ;</td><td>Acros Organics</td><td>61094-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2a, &kappa ; Isotype Ctrl Anticorps</td><td>BioLegend</td><td>400506</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>L glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Cellules LADMAC</td><td>ATCC</td><td>CRL-2420</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Corning</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>souris IFN-g</td><td>GoldBio</td><td>1360-06-100</td><td></td></tr><tr><td>N-Acétyl-L-cystéine</td><td>EMD Milipore</td><td>106425</td><td>Peut être un substitut de l’inhibiteur/piégeur de ROS dans le kit Enzo</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux novocytaire avec passeur d’échantillons Acea</td><td></td><td>2060R</td><td></td></tr><tr><td>Pyocyanine (inducteur de ROS)</td><td>10009594</td> <td>chimique des Caïmans</td><td>Peut être un substitut de l’inducteur dans le kit Enzo</td></tr> Kit <tr><td>de détection de ROS-ID total/superoxyde</td><td>ENZO</td><td>ENZ-51010</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure de débit par cytométrie en flux de production de ros dans les macrophages en réponse à la réticulation fcγr

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Le burst oxydatif ou respiratoire est utilisé pour décrire la consommation rapide d’oxygène et de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les phagocytes en réponse à divers stimuli immunitaires. ROS générées au cours de l’activation immunitaire exerce une activité antimicrobienne puissante principalement par le biais de la capacité du ROS à endommager l’ADN et les protéines, causant la mort des micro-organismes. Être capable de mesurer la production de ROS avec facilité et de façon reproductible est nécessaire afin d’évaluer la contribution des différentes voies et des molécules à ce mécanisme de défense de l’hôte. Dans cet article, nous montrent l’utilisation de sondes fluorescentes et cytométrie en flux pour détecter la production de ROS. Bien que largement utilisé, fluorescent mesure de ROS est notoirement difficile, surtout en ce qui concerne la mesure de ROS induite par des stimuli spécifiques et non mitogènes. Nous présentons une méthodologie détaillée pour détecter les ROS due à la stimulation spécifique de FcγR commençant par génération de macrophage, amorçage, coloration, FcγR réticulation et se terminant par cytométrie.

En utilisant le protocole décrit au sein, nous présentons des données représentatives démontrant la détection cytométrie en flux de production de ROS résultant de la stimulation du WT C57BL/6J BMDMs à travers le FcγR. Comme prévu, nous observons des changements minimes dans la fluorescence LV1 ou LV2 au-dessus des niveaux de fond dans les cellules non stimulées (Figure 3 a, compare contre « teinté, non stimulées » dot « sans tache, non stimulées » parcelles). Nous observons une augmentation ...

Cette étude démontre l’utilisation de la cytométrie à détecter une production réactives de l’oxygène (dro) résultant de l’activation de la FcγR. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer les changements dans les antimicrobiens et oxydo-réduction fonction des phagocytes en réponse à des complexes immuns, micro-organismes opsonisées ou direct FcγR réticulation de signalisation.

Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

La mesure des espèces réactives d’oxygène ou ROS est notoirement problématique. Dans cette vidéo, nous démontrerons la mesure reproductible de ROS en réponse à la liaison croisée des récepteurs FC-gamma à l’aide de sondes fluorescentes et de cytométrie d’écoulement. Les principaux avantages de cette technique sont la reproductibilité de l’analyse et l’utilisation de cette méthode avec des stimuli antigéniques spécifiques, pas seulement des mitogènes ou des inducteurs ROS connus.La production de ROS dysregulated est centrale au développement de nombreuses maladies telles que la maladie granulomatous chronique ou la DGCC. La mesure précise du ROS pourrait constituer une partie du diagnostic moléculaire de la DGCC. L’étude de la production de ROS à 100 000 FC est importante dans l’étude des immunodéficiences, comme la DGC, mais aussi dans l’étude des maladies auto-immunes, ou des maladies neurodégénératives, où trop de ROS conduit au stress oxydatif et à l’inflammation.Le moment de l’analyse est critique. Je conseillerais à quelqu’un qui essaie ce protocole pour la première fois de bien se préparer et de faire une simulation d’expérience si possible. Démonstration visuelle de cette méthode est critique afin de souligner les étapes de l’essai qui ont besoin d’une attention particulière comme le moment de l’essai.Pour commencer, préparez des macrophages dérivés de la moelle osseuse à l’aide de supports conditionnés tels que décrits dans le protocole texte qui l’accompagne. Après l’amorçage des macrophages pendant la nuit, aspirer le supernatant et laver les cellules une fois avec PBS. Le sérum affame les cellules en remplaçant les médias par le même volume de DMEM à faible sérum.Pour chaque souris, une plaque sera traitée avec anti-BSA IgG1 tandis que le sérum affamé tandis que l’autre ne sera pas traitée. Ajouter seulement le DMEM à faible sérum aux plaques non traitées et ajouter du DMEM à faible sérum contenant 2,5 microgrammes par millilitre d’anti-BSA IgG1 murin aux plaques traitées. Assurez-vous d’inclure une plaque supplémentaire non traitée pour chaque expérience afin d’agir comme le contrôle de la compensation cytométrique du flux.Incuber les plaques quatre heures à 37 degrés Celsius, 5% de CO2. Pendant l’incubation de quatre heures, préparer une solution 2X des sondes réactives d’espèces d’oxygène. Pour chaque tranche de 10 millilitres de DMEM à faible sérum nécessaire, ajouter quatre microlitres d’un réaccéléologue oxydatif de détection du stress et quatre microlitres d’un réaccéléologue de détection de superoxyde.Ensuite, préparez les solutions de sonde 2X contenant uniquement le reagent oxydatif de détection de stress ou ne contenant que le réaccente de détection de superoxyde. Après l’incubation de quatre heures, récolter les cellules en raclant doucement les plaques, en les recueillant dans des tubes à fond rond étiquetés de cinq millilitres. Centrifuger les tubes à 750 fois g pendant cinq minutes.Assurez-vous de garder une trace des cellules qui ont été traitées avec murine anti-BSA IgG1. Ensuite, lavez les granulés cellulaires avec deux millilitres de PBS pour se débarrasser de tout anti-BSA résiduel des cellules traitées. Centrifuger les tubes à 750 fois g pendant cinq minutes.Ensuite, aspirez le PBS et résuspendez la pastille cellulaire dans 600 microlitres de DMEM à faible sérum. De la suspension cellulaire de 600 microlitres, aliquot 200 microlitres dans les tubes à fond rond préétiquetés de cinq millilitres. À partir des cellules non traitées, prendre 200 microlitres pour les tubes étiquetés non formulés, 200 microlitres pour les tubes étiquetés inducteur positif, et 200 microlitres pour les tubes étiquetés inducteur positif plus inhibiteur.Ensuite, à partir des cellules traitées anti-BSA IgG1, prendre 200 microlitres pour les tubes étiquetés FC-gamma récepteur crosslinking, et 200 microlitres pour les tubes étiquetés RÉCEPTEUR FC-gamma croisement plus inhibiteur. Des cellules non traitées à utiliser pour les contrôles de compensation, prendre 200 microlitres pour le tube étiqueté non taché non formulé, 200 microlitres pour le contrôle vert plus inducteur, et 200 microlitres pour orange plus le contrôle inducteur. Préparez une solution d’incitation positive 2X en diluant la pyocyanine d’un à 100 dans chacune des solutions de sonde 2X à une concentration de 500 micromolaires.Ensuite, préparez une solution BSA 2X en diluant la solution de stock BSA dans la solution de sonde 2X pour obtenir une concentration de 2X de deux microgrammes par millilitre. Avant de commencer la stimulation spécifique, comme la liaison croisée des récepteurs FC-gamma, assurez-vous que tous les réavants et cellules sont prêts et placez les tubes sur la glace dans l’ordre dans lequel ils seront stimulés. Pour les cytomètres d’écoulement avec un autosampler, prenez note du temps que le cytomètre prend pour analyser un échantillon et passer à l’autre.Assurez-vous d’inclure toutes les étapes de mélange et de lavage des sondes. Le timing est très critique pour cet essai. Pour que chaque condition soit bien contrôlée, la stimulation doit être effectuée en exactement 30 minutes pour chaque condition.Stimulez les cellules dans l’ordre et incorporez le décalage entre les acquisitions d’échantillons par le cytomètre à écoulement. Si vous effectuez une compensation manuelle à ce stade, stimulez les tubes de commande à utiliser pour la compensation en ajoutant 200 microlitres de la solution de sonde 2X contenant le réaccente oxydative de détection de stress et l’inducteur dans les tubes marqués vert plus inducteur. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de solution de sonde 2X contenant le réaccente de détection de superoxyde et l’inducteur dans les tubes marqués orange plus inducteur.Incuber les cellules pendant 30 minutes dans l’obscurité. À l’aide du logiciel de cytométrie du flux, générer et étiqueter trois fichiers d’échantillons pour le contrôle, non taché, non traité, le vert plus inducteur, et l’orange plus échantillons inducteurs, en s’assurant d’indiquer les canaux et les paramètres à analyser. En outre, entrez les conditions d’arrêt souhaitées.Une fois que les échantillons de contrôle ont été mis en place, générer et étiqueter un ensemble similaire de fichiers pour les échantillons expérimentaux. Maintenant, exécutez l’échantillon non taché et non traité. Ouvrez une parcelle de points pour la dispersion vers l’avant sur l’axe X par rapport à la dispersion latérale sur l’axe Y et dessinez une porte autour des cellules d’intérêt, à l’exclusion des cellules mortes et des débris.Ensuite, utilisez la porte de cette cellule pour ouvrir une autre parcelle de point du premier marqueur de fluorescence, FL1, sur l’axe X, par rapport au deuxième marqueur de fluorescence, FL2, sur l’axe Y. Dessinez une porte de quadrant initiale, puis ajustez la porte quadrant de sorte que les événements apparaissent sur le quadrant inférieur gauche de la parcelle FL1 contre FL2. Une fois terminé, exécutez l’échantillon vert plus inducteur.Réglez la tension de sorte que les événements apparaissent sur les quadrants inférieur gauche et droit de l’intrigue FL1 contre FL2. Ensuite, appliquez cette matrice de rémunération aux trois fichiers d’échantillons. Maintenant, exécutez l’échantillon orange plus inducteur.Ajustez la tension de sorte que les événements apparaissent sur les quadrants supérieur et inférieur gauche de la parcelle FL1 versus FL2, puis appliquez cette matrice de compensation aux trois fichiers d’échantillon. Vérifiez chaque fichier d’indemnisation et assurez-vous que des événements non tachés et non traités apparaissent sur le quadrant inférieur gauche, que les événements verts plus inducteurs apparaissent dans les quadrants inférieur gauche et droit, et que les événements orange plus inducteur apparaissent sur les quadrants supérieur et inférieur gauche de la parcelle FL1 contre FL2. Ensuite, appliquez la matrice de rémunération à tous les fichiers d’échantillons expérimentaux.Une fois que la compensation manuelle a été effectuée et qu’un modèle expérimental a été obtenu, passez aux échantillons expérimentaux. Avant de traiter les cellules avec un inducteur positif ou d’effectuer la stimulation des cellules récepteurs FC-gamma, marquez quels tubes recevront un inhibiteur ros. Traitez ces cellules avec l’inhibiteur ros au moins 30 minutes avant l’inducteur positif ou la stimulation des récepteurs FC-gamma en ajoutant un microlitre de l’inhibiteur à 200 microlitres de cellules résuspendues pour une concentration finale de cinq millimolaires.Pour les cellules non simulées, traiter les cellules avec 200 microlitres de la solution de sonde 2X sans aucun stimulus ajouté aux 200 microlitres de suspension cellulaire étiquetés tachés, non stimulés. Pour les contrôles positifs, traiter les cellules avec 200 microlitres de la solution d’incitation positive 2X à 200 microlitres de suspension cellulaire étiquetés inducteur positif ou inducteur positif plus inhibiteur. Enfin, pour les cellules stimulées par la liaison croisée des récepteurs FC-gamma, traitez-les avec 200 microlitres de la solution 2X BSA ajoutées à 200 microlitres de la suspension cellulaire étiquetée liaison croisée des récepteurs FC-gamma ou liaison croisée des récepteurs FC-gamma plus inhibiteur.Incuber les cellules pendant 30 minutes dans l’obscurité. Après l’incubation, analyser les échantillons dans l’ordre dans lequel ils ont été stimulés, à l’aide du cytomètre d’écoulement et des modèles d’analyse générés au cours des étapes initiales de compensation. Les données présentées ici démontrent la détection cytométrique de flux de la production réactive d’espèces d’oxygène résultant de la stimulation des macrophages par le récepteur FC-gamma.Il y a une augmentation marquée de la fluorescence de FL1 et de FL2 quand les cellules sont stimulées avec l’agent de liaison croisée de récepteur de FC-gamma. Lorsque les cellules ont été traitées avec l’inhibiteur réactif des espèces d’oxygène avant la liaison croisée des récepteurs FC-gamma, cette fluorescence accrue est ramenée à des niveaux basaux. En revanche, ces parcelles de points présentent une expérience infructueuse, où la production réactive sous-optimale d’espèces d’oxygène à la suite de la stimulation des récepteurs FC-gamma a été observée.Pour mettre en évidence les grandes différences entre les pourcentages attendus, ou les augmentations de l’IMF, ces données montrent à quoi ressemblent les échantillons dont la fluorescence fl1 et FL2 est minime. Le protocole actuel utilise une étape d’amorçage 24 heures sur 24. En comparant un temps d’amorçage de 24 heures par rapport à un temps d’amorçage de 48 heures, il n’y avait aucune différence marquée dans le pourcentage de cellules positives pour le reagent oxydant vert d’effort oxydant.Cependant, l’augmentation du temps d’amorçage à 48 heures a augmenté le pourcentage de cellules positives pour la fluorescence orange. Les choses les plus importantes à retenir lors de l’exécution de cette procédure est la planification à venir, et d’être cohérent sur le moment de l’essai pour obtenir des résultats reproductibles.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Nous démontrons l'utilité de la cytométrie en flux multicouleur pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle détaillée du total des sous-ensembles ainsi que la mémoire des lymphocytes CD4 + et CD8 + T dans les macaques rhésus, le modèle idéal pour les études de vaccin contre le VIH / SIDA.

Analyses Multicolor cytométrie de flux de réponse immunitaire cellulaire dans les macaques rhésus

Une méthode efficace pour mieux comprendre en visualisant l'induction paracrine dérivés du ROS endothéliales de signalisation Ca2 + est décrite. Cette méthode prend avantage de mesurer paracrine dérivés ROS déclenché la mobilisation de Ca2 + dans les cellules endothéliales vasculaires dans un modèle de co-culture.

Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

Cette vidéo présente un test monocouche de monocytes utilisant des monocytes primaires du sang périphérique pour évaluer la phagocytose médiée par le récepteur Fcγ avec des globules rouges R2R2 opsonisés par anticorps poly D.

Un test pour l’étude de la phagocytose induite par le récepteur Fcγ dans les monocouches de monocytes

Ici, nous démontrons comment cytométrie d'image peut être utilisé pour la quantification des champignons pathogènes, en association avec les cellules hôtes en culture. Cette technique peut être utilisée comme une alternative à la CFU énumération.

Utilisation de la cytométrie d&#39;image pour la quantification des champignons pathogènes en association avec les cellules hôtes

phagocytose microgliale est essentiel pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et la fonction phagocytaire insuffisante a été impliquée dans la pathologie. Cependant, l' évaluation de la fonction microglies in vivo est techniquement difficile. Nous avons mis au point une technique simple mais robuste pour surveiller et quantifier le potentiel phagocytaire de la microglie dans un cadre physiologique précisément.

Évaluation Retinal microglial phagocytaire Fonction<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;un test basé sur la cytométrie de flux

Le présent document décrit un procédé de mesure alloréactivité dans une population mixte de cellules T en utilisant la cytométrie de flux d'imagerie.

Mesure de cellules T alloréactivité basés sur l&#39;imagerie cytométrie en flux

Ce protocole fournit une méthode pour digérer des yeux entiers dans une suspension cellulaire simple aux fins de l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres afin d’identifier des populations phagocytiques mononucléaires oculaires spécifiques, y compris les monocytes, les microglies, les macrophages et les cellules dendritiques.

Digestion des yeux de souris entières pour l’analyse cytométrique de flux multi-paramètres des phagocytes mononucléaires

Ce protocole fournit une méthode efficace de digestion de la collagénase pour isoler des adipocytes viables et des cellules stromales de fraction vasculaire-SVF de la graisse viscérale humaine en un seul processus, y compris une méthodologie pour obtenir un ARN de haute qualité à partir d’adipocytes et la phénotypification des macrophages SVF par coloration de plusieurs marqueurs membranaires pour analyse par cytométrie en flux.

Isolement d’adipocytes viables et d’une fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux viscéral humain adapté à l’analyse de l’ARN et au phénotypage des macrophages

Nous proposons ici un protocole systématisé, accessible et reproductible pour détecter les espèces réactives cellulaires de l’oxygène (ROS) à l’aide d’une sonde de diacétate de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans les cellules gliales de Müller (MGC). Cette méthode quantifie les niveaux de ROS cellulaires totaux à l’aide d’un cytomètre en flux. Ce protocole est très facile à utiliser, adapté et reproductible.

Quantification des espèces réactives de l’oxygène à l’aide de la sonde de diacétate de dichlorofluorescéine 2′,7′-dichlorofluorescéine et de la cytométrie en flux dans les cellules gliales de Müller

Ce travail décrit un protocole in vitro standardisé permettant de quantifier et de comparer les taux de phagocytose des globules rouges xénogéniques (humains) et allogéniques (rats) par des macrophages de rats isolés.

Une évaluation quantitative de la phagocytose des érythrocytes allogéniques et xénogéniques par les macrophages de rat in vitro

Découvrez la mesure des espèces réactives de l'oxygène (ROS) par cytométrie en flux dans les macrophages après réticulation des récepteurs FcγR. Cette méthode permet d'évaluer le stress oxydatif et les réponses immunitaires.

Mesure de débit par cytométrie en flux de Production de ROS dans les Macrophages en réponse à la réticulation FcγR

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