Name: Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L. (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Découvrez un test de criblage de grains simple pour analyser la croissance d'Aspergillus flavus et la production d'aflatoxine dans les grains de maïs transgéniques. Cette méthode utilise une souche GFP pour surveiller l'infection fongique en temps réel.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions David Meints, Université de l’Arkansas pour son aide dans l’élaboration et l’analyse du maïs transgénique au cours des premières générations. Cet ouvrage a reçu le soutien financier du projet de l’USDA-ARS CRIS 6054-42000-025-00D. La mention de noms commerciaux ou des produits commerciaux dans cet article est uniquement dans le but de fournir des informations spécifiques et n’implique pas de recommandation ou une approbation par le US Department of Agriculture. Offre d’emploi égale (EEO) politique des USDA-ARS exige l’égalité des chances pour toutes les personnes et interdit la discrimination dans tous les aspects des politiques relatives au personnel, pratiques et opérations de l’Agence.

1. plasmide constructions et la transformation de maïs
<ol><li>PCR amplification Lablab AILP insert en utilisant les amorces 5'-TATCTAGAACTAGTGATTACCATGGCTCC-3 'et 5'-ATACTGCAGGATTGCATGCAGAGTAGTACTG-3'. Les conditions de la PCR incluent une étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s (étape 1), suivie de la dénaturation à 98 ° C pendant 10 s (étape 2), recuit à 55 ° C pendant 30 s (étape 3), l’allongement à 72 ° C pendant 20 s (étape 4), 31 cycles de l’étape 2 à l’étape 4 , et un allongement final étape à 72 ° C pendant 5 min. Clone le produit PCR dans un pCAMBIA mis à jour le 1 300 vector à l’aide de XbaI et Pstj’ai des sites de restriction. Séquence le vecteur de destination finale végétale pour confirmer l’orientation et la séquence du gène AILP cloné dans le vecteur.</li>
	<li>Transformer la souche Agrobacterium EHA101 avec la construction du vecteur final (Figure 1) comme précédemment décrit 16.</li>
	<li>Utilisation transformé Agrobacterium contenant le vecteur de destination finale usine pour transformer les embryons immatures maïs (Zea mays L. Hi-II) (effectuées à l’usine de Transformation installation de Iowa State University) 16.</li>
	<li>Faire pousser des plantes0 T dans la serre (26 – 29 ° C, photopériode de 16/8 h additionné de Na-lampes à haute pression) et à plusieurs reprises auto-polliniser pour obtenir la génération6 T pour atteindre l’homozygotie pour le caractère transgénique.</li>
</ol>2. test de germination de spores
<ol><li>Récolter des échantillons de feuilles et de conserver à-80 ° C. Moudre les échantillons de feuilles dans un mortier à l’aide d’azote liquide. Peser avec 0,5 g en tubes de microcentrifuge de 2 mL, ajouter 17 µL d’inhibiteur de protéase et placer les tubes sur la glace.</li>
	<li>Centrifuger les tubes pendant 10 min à 16 000 x g. Transférer 225 µL d’extrait de plante aux tubes de microcentrifuge de 0,5 mL et placer sur la glace.</li>
	<li>Dans un tube à centrifuger 15 mL, préparer une suspension 5 mL de spores d' Aspergillus flavus 70 – GFP dans un bouillon de dextrose de pomme de terre 1 % (p/v). Vortex et ajuster la concentration de spores à5 10 spores/mL avec un hémocytomètre. Attention : A. flavus produit des aflatoxines, tous les travaux avec ce champignon devraient être conduite dans une armoire de sécurité biologique.</li>
	<li>Incuber dans APB à 28 ° C jusqu'à ce que la culture atteint 50 % début de la germination de la spore comme indiqué par le renflement des spores.</li>
	<li>Extraient de vortex et aliquote 25 µL spore de solution à l’usine de 225 µL. Incuber les échantillons pendant 20 heures à 28 ° C sous agitation intermittente.</li>
	<li>Aliquote 25 µL de solution de spores sur une lame de microscope et mesurez la longueur du germe de tubes de spores en utilisant le logiciel de l’appareil photo numérique. Utiliser un minimum de 20 mesures répétées pour chaque ligne. Remarque : À ce stade, placer toutes les cultures à 4 ° C pour arrêter la croissance de la colonie jusqu’au moment de compter.</li>
</ol>3. noyau Screening Test (KSA)
<ol><li>Construire des casquettes KSA en collant les 4 capuchons de clin d’oeil (22 mm) dans un plat de pétri de 60 x 15 mm. Laissez la colle sécher pendant 48 H avant d’utiliser des bouchons. Chaque capuchon KSA constitue une Rep (Figure 2).</li>
	<li>Dans une armoire de sécurité biologique stérile, pulvériser un plateau carré bio-essai (24 x 24 cm) avec 70 % éthanol : H2O (v/v) et laissez l’air sec. Papier pour chromatographie stérile s’ajoute la barre d’état. 9 sélections KSA de pulvérisation avec l’éthanol à 70 %, laisser l’air sec et placez dans le bac de dosage biologique.</li>
	<li>Pour chaque ligne de maïs transgénique mis à l’essai, sélectionnez 20 cerneaux intacts et placer dans un tube à centrifuger 50 mL. Ajouter de l’éthanol à 70 % et laisser reposer pendant 4 minutes. Secouer doucement les tubes pendant la stérilisation. Égoutter les amandes éthanol et rincer trois fois dans stérile désionisée H2O.</li>
	<li>Préparer une suspension de spores d' Aspergillus flavus 70 – GFP17 d’une culture vieille de 6 jour cultivées sur un milieu V8 (5 % jus V8, 2 % d’agar, pH 5,2).<ol>
<li>Ajouter 20 mL stérile 0,02 % Triton X-100/désionisée H2O (v/v) et les débris hors des spores avec une anse stérile. Pipette au large de l’inoculum et le place dans un bécher stérile de 300 mL.</li>
		<li>Préparer une dilution de 5 fois avec 0,02 % X-100 Triton, puis effectuez un comte de spore avec un hémocytomètre. Diluer à nouveau si nécessaire pour obtenir 100 mL avec une concentration de 4 x 106 spores/mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer les grains dans un bécher stérile de 300 mL avec une barre de remuer. Ajouter l’inoculum dans le bécher. Attention : Ajout des noyaux à inoculum cause solution éclabousse. Placer le bécher sur une plaque de remuer pendant 3 minutes. Après 3 minutes, égoutter inoculum dans un récipient vide.</li>
	<li>À l’aide d’une pince, placer les noyaux dans le plat de biodosage (1 noyau/cap). Ajouter 30 mL désionisée au fond de chaque bac de dosage biologique et incuber à 31 ° C dans l’obscurité pendant 7 jours.</li>
	<li>Préparer les noyaux pour la photographie.<ol>
<li>Mettre de côté 4 noyaux de chaque ligne pour analyse microscopique et la photographie. Remarque : Les amandes peuvent être stockés à 4 ° C pendant pas plus de 5 jours avant la fin de la photographie.</li>
		<li>Prendre des photos des grains après sept jours après l’inoculation avec a. flavus (Figure 3).</li>
		<li>Nettoyer l’extérieur des noyaux avec un tissu mou et l’eau désionisée. Effectuer des coupes longitudinales de cerneaux et immédiatement prendre des photos sous le microscope à fluorescence.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparer les noyaux pour l’analyse.<ol>
<li>Nettoyer l’extérieur des grains restants avec un tissu mou et l’eau désionisée.</li>
		<li>Placer 4 noyaux, constituant 1 rep, dans un polycarbonate de bouchon à vis 15 mL flacon contenant 2 boules d’acier inoxydable. Immédiatement geler les flacons dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C jusqu'à l’analyse et le traitement ultérieur.</li>
		<li>Retirer les flacons du congélateur-80 ° C et moudre les amandes dans un homogénéisateur à 1 500 tr/min pendant 3 minutes. Remarque : Conservez les grains gelés à l’azote liquide.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. dépistage de la PCR de grains de maïs transgéniques
<ol><li>Utilisez le kit d’isolation de l’ADN pour isoler l’ADN génomique (Adng) de grains de maïs pulvérisés infectées par a. flavus selon les instructions du fabricant. Brièvement, ajouter 280 µL de tampon de F, 20 µL protéase et 3 µL le dithiothréitol (DTT) à 10-15 mg de grains de maïs pulvérisés. Incuber et agiter dans un thermomixer (56 ° C, 1200 tr/min, 30 min). Centrifuger à 10 000 x g pendant 1 min et transvaser le liquide clair surnageant dans colonne équilibré. Incuber à température ambiante pendant 3 min et centrifuger à 700 x g pendant 1 min éluer Adng.</li>
	<li>Prendre 0,8 µL d’extrait Adng à mettre en place une réaction de PCR 20 µL de chaque échantillon à l’aide d’un kit PCR. Vous devez remplir les conditions cyclage thermique tel que recommandé dans le protocole du fabricant. Les conditions de la PCR incluent une étape de dénaturation initiale à 98 ° C pendant 5 min (étape 1) suivie de dénaturation à 98 ° C pendant 5 s (étape 2), recuit à 55 ° C pendant 5 s (étape 3), l’allongement à 72 ° C pendant 20 s (étape 4), 40 cycles d’étape 2 à l’étape 4 et une étape d’élongation finale à 72 ° C pendant 1 min (étape 5).</li>
	<li>Utiliser l’apprêt avant 5'-TATACCACCCCCATCCGTGT-3' et inverser l’apprêt 5'-AGCTCGGAAGCAAAAGACCA-3' pour confirmer la présence de la Lablab AILP gène dans les grains de maïs transgéniques.</li>
</ol>5. les ARN, synthèse de cDNA et RT-PCR semi-quantitative
<ol><li>Prenez homogénéisé a. flavus infectés grains de maïs préalablement stockées à-80 ° C pour l’extraction de l’ARN. Extraire l’ARN utilisant un kit d’isolation de RNA total selon le protocole du fabricant mais avec légère modification18. Après l’ajout de 50 mg de poudre de noyau maïs homogénéisé dans le tampon d’extraction, mélangez-le bien (sans utilisation du vortex) à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et laissez-le sur glace pendant 5 à 6 minutes avant de procéder aux étapes suivantes comme décrit dans le protocole du fabricant.</li>
	<li>Préparer le cDNA utilisant un kit de synthèse de cDNA selon protocole 18 les directives du fabricant.</li>
	<li>Utiliser 0,5 µL d’ADNc non dilué par réaction PCR pour RT-PCR semi-quantitative comme précédemment décrit18. Utiliser des amorces et inverses qAILP-F 5'-TCCCAACAAGGCAACTACTG-3' et qAILP-R 5' - CGGTGTCGAAGAGACCTAGATA - 3' respectivement à détecter Le Lablab AILP l’expression des gènes et avant et fait reculer les amorces qRib-F 5ʹ-GGCTTGGCTTAAAGGAAGGT-3ʹ et qRib-R 5ʹ-TCAGTCCAACTTCCAGAATGG-3ʹ, respectivement pour l’expression du gène structural ribosomique maïs (Rib), GRMZM2G02483819 , comme un gène ménager.</li>
</ol>6. quantification de la GFP
<ol><li>Préparation de 50 mL chacun de phosphate monobasique de sodium 0,2 M (NaH2PO4) et 0,2 M phosphate dibasique de sodium (Na2HPO4·7H2O) dans désionisée H2O.</li>
	<li>Composent de 100 mL de tampon phosphate pH 7.0 Sorenson. Pour pH 7.0, ajouter 19,5 mL NaH2PO4 stock, 30,5 mL NaHPO4·7H stock d’O2et 50 mL eau désionisée H2O.</li>
	<li>Peser 25 mg produit de noyau broyé (poids frais, FW) et placer dans un tube de microcentrifuge de 1,0 mL. Ajouter 500 µL de tampon de phosphate au tube à centrifuger et vortexer pendant 30 s.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons pendant 15 minutes à 16 000 x g. Surnageant du pipette 100 µL dans une assiette bien noir 96. Lire les échantillons avec un fluorimètre (excitation 485 nm, émission 528 nm).</li>
</ol>7. analyse des aflatoxines totales
<ol><li>Échantillons de traitement et aflatoxines d’extraction<ol>
<li>Des échantillons de noyau dans un four à air pulsé à sec pendant 2 jours à 60 ° C. Peser les échantillons et introduire dans un Erlenmeyer avec un bouchon en verre de 50 mL.</li>
		<li>Sous une hotte, ajouter 25 mL de chlorure de méthylène dans chaque fiole. Attention : Le chlorure de méthylène est très volatil et est considéré comme dangereux (cancérigène irritant,). Gants latex ni nitrile sont sûrs pour l’utilisation de chlorure de méthylène. Utiliser des gants alcool polyvinylique résistant aux solvants organiques d’améliorée.</li>
		<li>Secouez les échantillons pendant 30 min sur un agitateur oscillant. Après 30 min, verser lentement l’extrait à travers un filtre plissé cercle dans un bécher de 80 mL. Laisser sécher jusqu’au lendemain béchers dans une hotte de laboratoire.</li>
		<li>Le lendemain, squirt chlorure de méthylène (5 mL environ) autour de l’intérieur de la jante des secs béchers, tourbillonnent autour et verser dans dram 2 flacons en verre. Congé de flacons ouvrent pour sécher toute la nuit sous une hotte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Analyse des aflatoxines<ol>
<li>Ajouter 4,0 mL 80 % méthanol : eau désionisée H2O (v/v) de flacons.</li>
		<li>Utiliser un kit d’extraction d’aflatoxine pour filtrer purifier la solution méthanolique avec la colonne fournie. Analyser les niveaux d’aflatoxine totale avec un fluorimètre, selon les instructions du fabricant.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ismaiel, A., Papenbrock, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycotoxins%3A+Producing+fungi+and+mechanisms+of+phytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Agriculture%22%5BJournal%5D)">Mycotoxins: Producing fungi and mechanisms of phytotoxicity.</a> Agriculture. 5 (3), 492-537 (2015).</li>
<li>Mitchell, N., Bowers, E., Hurburgh, C., Wu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+economic+losses+to+the+USA+corn+industry+from+aflatoxin+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants%3A+Part+A%22%5BJournal%5D)">Potential economic losses to the USA corn industry from aflatoxin contamination.</a> Food Additives & Contaminants: Part A. 33 (3), 540-550 (2016).</li>
<li>Umesha, S., Manukumar, H. M., Chandrasekhar, B., Shivakumara, P., Shiva Kumar, J., Raghava, S., Avinash, P., Shirin, M., Bharathi, T. R., Rajini, S. B., Nandhini, M., Vinaya Rani, G., Shobha, M., Prakash, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins+and+food+pathogens%3A+Impact+of+biologically+active+aflatoxins+and+their+control+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins and food pathogens: Impact of biologically active aflatoxins and their control strategies.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. , (2016).</li>
<li>Brown, R. L., Menkir, A., Chen, Z. Y., Bhatnagar, D., Yu, J., Yao, H., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breeding+aflatoxin-resistant+maize+lines+using+recent+advances+in+technologies+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Additives+%26+Contaminants+-+Part+A+Chemistry%2C+Analysis%2C+Control%2C+Exposure+%26+Risk+Assessment%22%5BJournal%5D)">Breeding aflatoxin-resistant maize lines using recent advances in technologies - a review.</a> Food Additives & Contaminants - Part A Chemistry, Analysis, Control, Exposure & Risk Assessment. 30 (8), 1382-1391 (2013).</li>
<li>Abbas, H., Accinelli, C., Shier, W. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+control+of+aflatoxin+contamination+in+U.S.+crops+and+the+use+of+bioplastic+formulations+of+Aspergillus+flavus+biocontrol+strains+to+optimize+application+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Agricultural+and+Food+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Biological control of aflatoxin contamination in U.S. crops and the use of bioplastic formulations of Aspergillus flavus biocontrol strains to optimize application strategies.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65, 7081-7087 (2017).</li>
<li>Udomkun, P., Wiredu, A. N., Nagle, M., Müller, J., Vanlauwe, B., Bandyopadhyay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovative+technologies+to+manage+aflatoxins+in+foods+and+feeds+and+the+profitability+of+application+%E2%80%93+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Control%22%5BJournal%5D)">Innovative technologies to manage aflatoxins in foods and feeds and the profitability of application – A review.</a> Food Control. 76, 127-138 (2017).</li>
<li>Dohroo, N. P., Bhardwaj, S. S., Shyram, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+and+invertase+activity+as+influenced+by+Pythium+pleroticum+causing+rhizome+rot+of+ginger%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease+Research%22%5BJournal%5D)">Amylase and invertase activity as influenced by Pythium pleroticum causing rhizome rot of ginger.</a> Plant Disease Research. 2, 106-107 (1987).</li>
<li>Singh, R., Saxena, V. S., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pectinolytic%2C+cellulolytic%2C+amylase+and+protease+production+by+three+isolates+of+Fusarium+solani+variable+in+their+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+Journal+of+Mycology+and+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Pectinolytic, cellulolytic, amylase and protease production by three isolates of Fusarium solani variable in their virulence.</a> Indian Journal of Mycology and Plant Pathology. 19, 22-29 (1989).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amy1%2C+the+%CE%B1-amylase+gene+of+Aspergillus+flavus%3A+Involvement+in+aflatoxin+biosynthesis+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Amy1, the α-amylase gene of Aspergillus flavus: Involvement in aflatoxin biosynthesis in maize kernels.</a> Phytopathology. 89 (10), 908-914 (1999).</li>
<li>Bluhm, B. H., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylopectin+induces+Fumonisin+B1+production+by+Fusarium+verticillioides+during+colonization+of+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Amylopectin induces Fumonisin B1 production by Fusarium verticillioides during colonization of maize kernels.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (12), 1333-1339 (2005).</li>
<li>Gilbert, M. K., Majumdar, R., Rajasekaran, K., Chen, Z. Y., Wei, Q., Sickler, C. M., Lebar, M. D., Cary, J. W., Frame, B. R., Wang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference-based+silencing+of+the+a-amylase+%28amy1%29+gene+in+Aspergillus+flavus+decreases+fungal+growth+and+aflatoxin+production+in+maize+kernels%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">RNA interference-based silencing of the a-amylase (amy1) gene in Aspergillus flavus decreases fungal growth and aflatoxin production in maize kernels.</a> Planta. 247 (6), 1465-1473 (2018).</li>
<li>Chen, Z. Y., Brown, R. L., Russin, J. S., Lax, A. R., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+corn+trypsin+inhibitor+with+antifungal+activity+inhibits+Aspergillus+flavus+%CE%B1-amylase%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">A corn trypsin inhibitor with antifungal activity inhibits Aspergillus flavus α-amylase.</a> Phytopathology. 89 (18944733), 902-907 (1999).</li>
<li>Fakhoury, A. M., Woloshuk, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+growth+of+Aspergillus+flavus+and+fungal+%CE%B1-amylases+by+a+lectin-like+protein+from+Lablab+purpureus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant-Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Inhibition of growth of Aspergillus flavus and fungal α-amylases by a lectin-like protein from Lablab purpureus.</a> Molecular Plant-Microbe Interactions. 14 (8), 955-961 (2001).</li>
<li>Mirkov, T. E., Wahlstrom, J. M., Hagiwara, K., Finardi-Filho, F., Kjemtrup, S., Chrispeels, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+relationships+among+proteins+in+the+phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase+inhibitor+family+of+the+common+bean+and+its+relatives%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary relationships among proteins in the phytohemagglutinin-arcelin-a-amylase inhibitor family of the common bean and its relatives.</a> Plant Molecular Biology. 26 (4), 1103-1113 (1994).</li>
<li>Kim, Y. H., Woloshuk, C. P., Cho, E. H., Bae, J. M., Song, Y. S., Huh, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+functional+expression+of+the+gene+encoding+an+inhibitor+against+Aspergillus+flavus+a-amylase%2C+a+novel+seed+lectin+from+Lablab+purpureus+%28Dolichos+lablab%29%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Cloning and functional expression of the gene encoding an inhibitor against Aspergillus flavus a-amylase, a novel seed lectin from Lablab purpureus (Dolichos lablab).</a> Plant Cell Reports. 26 (4), 395-405 (2007).</li>
<li>Frame, B., Main, M., Schick, R., Wang, K. Ch. 22. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFrame%2C+B+%22Plant+Embryo+Culture%22">Plant Embryo Culture</a>. Thorpe, T. A., Yeung, E. C. 710, Humana Press. Methods in Molecular Biology 327-341 (2011).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sickler, C. M., Brown, R. L., Cary, J. W., Bhatnagar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+resistance+to+aflatoxin+contamination+in+kernels+of+maize+genotypes+using+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Evaluation of resistance to aflatoxin contamination in kernels of maize genotypes using a GFP-expressing Aspergillus flavus strain.</a> World Mycotoxin Journal. 6 (2), 151-158 (2013).</li>
<li>Rajasekaran, K., Sayler, R. J., Sickler, C. M., Majumdar, R., Jaynes, J. M., Cary, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Aspergillus+flavus+growth+and+aflatoxin+production+in+transgenic+maize+kernels+expressing+a+tachyplesin-derived+synthetic+peptide%2C+AGM182%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Control of Aspergillus flavus growth and aflatoxin production in transgenic maize kernels expressing a tachyplesin-derived synthetic peptide, AGM182.</a> Plant Science. , 150-156 (2018).</li>
<li>Shu, X., Livingston, D. P., Franks, R. G., Boston, R. S., Woloshuk, C. P., Payne, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+gene+expression+in+maize+seeds+during+colonization+by+Aspergillus+flavus+and+Fusarium+verticillioides%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific gene expression in maize seeds during colonization by Aspergillus flavus and Fusarium verticillioides.</a> Molecular Plant Pathology. 16 (4), 662-674 (2015).</li>
<li>Savary, S., Ficke, A., Aubertot, J. -N., Hollier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crop+losses+due+to+diseases+and+their+implications+for+global+food+production+losses+and+food+security%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Security%22%5BJournal%5D)">Crop losses due to diseases and their implications for global food production losses and food security.</a> Food Security. 4, 519-537 (2012).</li>
<li>Damalas, C. A., Eleftherohorinos, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pesticide+exposure%2C+safety+issues%2C+and+risk+assessment+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Environmental+Research+and+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Pesticide exposure, safety issues, and risk assessment indicators.</a> International Journal of Environmental Research and Public Health. 8 (5), 1402-1419 (2011).</li>
<li>Kowalska, A., Walkiewicz, K., Kozieł, P., Muc-Wierzgoń, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aflatoxins%3A+Characterisitcs+and+impact+on+human+health%5BTitle%5D)+AND+%22Post%C4%99py+Higieny+i+Medycyny+Do%C5%9Bwiadczalnej+%28Online%29%22%5BJournal%5D)">Aflatoxins: Characterisitcs and impact on human health.</a> Postępy Higieny i Medycyny Doświadczalnej (Online). 71, 315-327 (2017).</li>
<li>Rajasekaran, K., Cary, J. W., Cotty, P. J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+GFP-expressing+Aspergillus+flavus+strain+to+study+fungal+invasion%2C+colonization%2C+and+resistance+in+cottonseed%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Development of a GFP-expressing Aspergillus flavus strain to study fungal invasion, colonization, and resistance in cottonseed.</a> Mycopathologia. 165 (2), 89-97 (2008).</li>
<li>Punt, P., Dingemanse, M. A., Kuyvenhoven, A., Soede, R. D., Pouwels, P. H., van den Hondel, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+elements+in+the+promoter+region+of+the+Aspergillus+nidulans+gpdA+gene+encoding+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Functional elements in the promoter region of the Aspergillus nidulans gpdA gene encoding glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase.</a> Gene. 93 (1), 101-109 (1990).</li>
<li>Lee, L. W., Chiou, C. H., Klomparens, K. L., Cary, J. W., Linz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+aflatoxin+biosynthetic+enzymes+Nor-1%2C+Ver-1%2C+and+OmtA+in+time-dependent+fractionated+colonies+of+Aspergillus+parasiticus%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of aflatoxin biosynthetic enzymes Nor-1, Ver-1, and OmtA in time-dependent fractionated colonies of Aspergillus parasiticus.</a> Archives of Microbiology. 181 (3), 204-214 (2004).</li>
<li>Bhatnagar, D., Cary, J. W., Ehrlich, K., Yu, J., Cleveland, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+genetics+of+regulation+of+aflatoxin+production+and+Aspergillus+flavus+development%5BTitle%5D)+AND+%22Mycopathologia%22%5BJournal%5D)">Understanding the genetics of regulation of aflatoxin production and Aspergillus flavus development.</a> Mycopathologia. 162, 155-166 (2006).</li>
<li>Williams, W. P., Krakowsky, M. D., Scully, B. T., Brown, R. L., Menkir, A., Warburton, M. L., Windham, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+developing+maize+germplasm+with+resistance+to+accumulation+of+aflatoxins%5BTitle%5D)+AND+%22World+Mycotoxin+Journal%22%5BJournal%5D)">Identifying and developing maize germplasm with resistance to accumulation of aflatoxins.</a> World Mycotoxin Journal. 8 (2), 193-209 (2015).</li>
<li>Broekaert, W. F., van Parijs, J., Leyns, F., Joos, H., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chitin-binding+lectin+from+stinging+nettle+rhizomes+with+antifungal+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A chitin-binding lectin from stinging nettle rhizomes with antifungal properties.</a> Science. 245 (4922), 1100-1102 (1989).</li>
<li>Vanparijs, J., Broekaert, W. F., Goldstein, I. J., Peumans, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hevein-an+antifungal+protein+from+rubber-tree+%28Hevea+brasiliensis%29+latex%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Hevein-an antifungal protein from rubber-tree (Hevea brasiliensis) latex.</a> Planta. 183, 258-264 (1991).</li>
<li>Gozia, O., Ciopraga, J., Bentia, T., Lungu, M., Zamfirescu, I., Tudor, R., Roseanu, A., Nitu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+properties+of+lectin+and+new+chitinases+from+potato+tubers%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+de+l%27Academie+des+Sciences+-+Series+III%22%5BJournal%5D)">Antifungal properties of lectin and new chitinases from potato tubers.</a> Comptes Rendus de l'Academie des Sciences - Series III. 316 (8), 788-792 (1993).</li>
<li>Wisessing, A., Choowongkomon, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amylase+inhibitors+in+plants%3A+Structures%2C+Functions+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Science+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Amylase inhibitors in plants: Structures, Functions and Applications.</a> Functional Plant Science and Biotechnology. 6 (1), 31-41 (2012).</li>
<li>Tyagi, B., Trivedi, N., Dubey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a-amylase+inhibitor%3A+A+compelling+plant+defense+mechanism+against+insect%2Fpests%5BTitle%5D)+AND+%22Environment+%26+Ecology%22%5BJournal%5D)">a-amylase inhibitor: A compelling plant defense mechanism against insect/pests.</a> Environment & Ecology. 32 (3), 995-999 (2014).</li>
<li>Powers, J. R., Culbertson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+effect+of+bean+amylase+inhibitor+on+insect+amylases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Protection%22%5BJournal%5D)">In vitro effect of bean amylase inhibitor on insect amylases.</a> Journal of Food Protection. 45, 655-657 (1982).</li>
<li>Gatehouse, A. M. R., Fenton, K. A., Jepson, I., Pavey, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+a-amylase+inhibitors+on+insect+storage+pests%3A+Inhibition+of+a-amylase+in+vitro+and+effects+on+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Science+of+Food+and+Agriculture%22%5BJournal%5D)">The effects of a-amylase inhibitors on insect storage pests: Inhibition of a-amylase in vitro and effects on development in vivo.</a> Journal of the Science of Food and Agriculture. 37, 727-734 (1986).</li>
<li>Blanco-Labra, A., Chagolla-Lopez, A., Martinez-Gallardo, N., Valdes-Rodriguez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+characterization+of+the+12-kDa+protease+a-amylase+inhibitor+present+in+maize+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Further characterization of the 12-kDa protease a-amylase inhibitor present in maize seeds.</a> Journal of Food Biochemistry. 19, 27-41 (1995).</li>
<li>Abdollahi, A., Buchanan, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aflatoxin+biosynthesis%3A+Induction+of+aflatoxin+production+by+various+carbohydrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Food+Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aflatoxin biosynthesis: Induction of aflatoxin production by various carbohydrates.</a> Journal of Food Science. 46, 633-635 (1981).</li>
<li>Liu, J., Sun, L., Zhang, N., Zhang, J., Guo, J., Li, C., Rajput, S. A., Qi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+nutrients+in+substrates+of+different+grains+on+aflatoxin+B1+production+by+Aspergillus+flavus%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Effects of nutrients in substrates of different grains on aflatoxin B1 production by Aspergillus flavus.</a> BioMed Research International. 2016, (2016).</li>
<li>Uppala, S. S., Bowen, K. L., Woods, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-harvest+aflatoxin+contamination+and+soluble+sugars+of+peanut%5BTitle%5D)+AND+%22Peanut+Science%22%5BJournal%5D)">Pre-harvest aflatoxin contamination and soluble sugars of peanut.</a> Peanut Science. 40 (1), 40-51 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Des pertes de rendement dans les cultures agricoles en raison des agents pathogènes et parasites est un problème mondial20. Actuellement, application de pesticides et fongicides synthétiques est le moyen prédominant pour contrôle pathogènes et parasites, mais toxicité résiduelle de ces substances biochimiques dans l’alimentation humaine et animale peut constituer une menace sérieuse pour la santé humaine et animale,21. Compte tenu de l’importance économique du maïs comme al...

Contamination par les mycotoxines par les genres fongiques, Alternaria , Fusarium, Penicilliumet Aspergillusest un problème majeur de la nourriture et nourrissent de plantes cultivées dans le monde1,2,3. Parmi ces champignons phytopathogènes, Aspergillus a le plus d’impact défavorable sur la valeur des récoltes et de la santé humaine et animale. Aspergillus flavus (A. flavus) est un plante opportuniste pathogène qui infectent les plantes oléagineuses riches telles que le maïs, le coton et d’arachide et produit les agents cancérigènes, aflatoxines, ainsi que de nombreux métabolites secondaires toxiques (SMs). Le maïs est un aliment important et nourrir des cultures dans le monde entier et est très sensible à la contamination par a. flavus. L’impact économique de la contamination par les aflatoxines sur perd et valeur réduite chez le maïs peut être autant que $ 686,6 millions/an dans l’US2 avec les changements prévus dans le climat mondial, l’incidence des aflatoxines peut entraîner de plus grandes pertes économiques dans le maïs avec aussi hautes que $ 1,68 milliards/an dans le futur proche2estimations. Étant donné les conséquences économiques et sanitaires des aflatoxines chez les humains et le bétail, contrôle avant la récolte aflatoxines dans le maïs peut être le moyen le plus efficace pour prévenir la contamination par les aflatoxines dans les denrées alimentaires et aliments pour animaux.
L’approche du contrôle de pré-récolte majeur pour la résistance des aflatoxines dans le maïs qui a été largement utilisé dans les dernières décennies est principalement par le biais de sélection, ce qui nécessite une quantité importante de temps4. Récemment, biocontrol a eu un certain succès dans la réduction des aflatoxines dans la zone de grande échelle pour les applications5,6. En plus de la lutte biologique, application de pointe outils moléculaires tels que « Hôte induite par Gene Silencing » (HIGS) par le biais de RNAi et expression transgénique de protéines associées à la résistance a eu un certain succès dans la réduction de la croissance d’a. flavus et d’aflatoxines production dans les études de laboratoire et de terrain à petite échelle. Ces approches sont actuellement en cours d’optimisation en plus de l’identification de nouvelles cibles potentielles de gène a. flavus pour manipulation future.
Outre les gènes qui sont directement impliqués dans la production de mycotoxines comme cibles potentielles des stratégies de lutte transgéniques, amylases fongiques auraient dû être divulgués à jouer un rôle crucial dans le maintien de production réussie de pathogénie et de mycotoxine pendant les premiers stades de l’infection des plantes hôtes. Quelques exemples incluent Pythium pleroticum (agent causal de la pourriture du rhizome de gingembre), Fusarium solani (agent causal de la flétrissure de chou-fleur), où des corrélations positives entre la pathogénicité et le α-amylase expression et l’activité ont été observées à 7,,8. Inhibition de l’activité de le α-amylase par knock-out du gène ou approches knockdown affecte négativement la production de toxine et de croissance fongique. Un mutant de knock-out de α-amylase d’a. flavus a été incapable de produire des aflatoxines lorsqu’il est cultivé sur amidon substrat ou dégermées grains de maïs9. De même, au Fusarium verticillioides une souche de α-amylase n’ont pas produit de fumonisine B1 (mycotoxines) au cours de l’infection des grains de maïs10. Dans une étude plus récente, Gilbert et coll. (2018) ont montré qu’un axée sur l’ARNi Démantelez d’a. flavus expression de α-amylase par HIGS significativement réduit a. flavus production de croissance et d’aflatoxines pendant l’infection noyau maïs11 .
Inhibiteurs spécifiques de l’activité de le α-amylase ont également produit des résultats similaires obtenus de down-régulation de l’expression de le α-amylase. Le premier rapport sur le rôle d’un inhibiteur de le α-amylase fongique résistance provenait de l’isolement et la caractérisation d’un inhibiteur de la trypsine-α-amylase 14 kDa de lignées de maïs résistants à a. flavus12. Outre le dépistage de plusieurs centaines d’espèces de plantes par Fanfan et Woloshuk conduit à l’identification d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase 36 kDa (AILP) des graines de haricots de Jacinthe, Lablab purpureus L.13. La séquence peptidique de lectines AILP ressemblait à appartenant à la famille de l’inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase déclarés en commun haricot14,15. AILP purifiée ne présente pas toute activité inhibitrice envers la trypsine mammifères et plus de caractérisation in vitro ont montré une inhibition significative de la croissance d’a. flavus et la germination des conidies13. Les rapports présentés ici clairement montre α-amylase peut servir d’objectif dans les approches de contrôle pour limiter les agents pathogènes ou parasites qui dépendent de la mobilisation d’amidon (à travers l’activité de le α-amylase) et l’acquisition des sucres solubles comme source d’énergie au cours de leur pathogène interaction avec les plantes hôtes.
Alpha-amylase est connu pour être critique dans a. flavus pathogénicité9,10,11et compte tenu de l’importance de AILP comme un puissant anti-a. flavus agent (α-amylase inhibition/antigrowth)13, Nous avons généré des plants de maïs transgéniques exprimant Lablab AILP gène sous le promoteur CaMV 35 s constitutif. Le but était de vérifier si une expression hétérologue de cet inhibiteur de le α-amylase dans le maïs est efficace contre a. flavus pathogenèse et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau de maïs. Nos résultats démontrent que les grains de maïs transgéniques exprimant AILP significativement réduit l’a. flavus croissance et aflatoxine production au cours de l’infection de noyau.

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Caisson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amazing Marine Goop</td><td>Eclectic Products</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch CFX96 Système Temps Réel</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp ; Boîtes de culture tissulaire Falcon, 60 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772F</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp ; 5424 Microcentrifugeuse</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiole Erlenmeyer avec bouchon, 50 mL</td><td>Ace Glass</td><td>6999-10</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FluoroQuant Afla</td><td>Romer Labs</td><td>COKFA1010</td><td></td></tr><tr><td>Cercles de papier filtre qualitatif cannelé, 15 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-790-14E</td><td></td></tr><tr><td>Four à air Force</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FQ-Reader</td><td>Romer Labs</td><td>EQFFM3010</td><td></td></tr><tr><td>Geno/Grinder 2010</td><td>OPS Diagnostics</td><td>SP 2010-115</td><td></td></tr><tr><td>Gants améliorés PolyVinylAlcohol résistants aux solvants organiques</td><td>Ansell</td><td>012-15-554</td><td></td></tr><tr><td>Innova 44 Incubator Shaker</td><td>Brunswick Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td><td></td>liquide</tr><tr><td>Bas Form Bécher Griffin, 100 mL</td><td>DKW Life Sciences</td><td>14000-100</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td></td><td></td><td></td>de méthylène</tr><tr><td>Nexttec Kit d’isolement de l’ADN en 1 étape pour plantes</td><td>Nexttec</td><td>47N</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Nikon Eclipse E600 avec appareil photo</td><td></td><td></td> Nikon DS-Qi1 Nikon<td></td></tr><tr><td>Stéréomicroscope Nikon SMZ25 avec illuminateur épiscopique C-HGFI et appareil photo</td><td></td><td></td><td></td>sCMOS Andor Zyla 4.2</tr><tr><td>Plats carrés Nikon Nunc ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>240835</td><td></td></tr><tr><td>Phire Plant Direct PCR Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F130WH</td><td></td></tr><tr><td>Flacons en polycarbonate, 15 ml</td><td>OPS Diagnostics</td><td>PCRV 15-100-23</td><td></td></tr><tr><td>Pomme de terre Bouchon à pression de bouillon</td><td></td><td></td><td></td>de dextrose</tr><tr><td>, 22 mm</td><td>DKW Life Sciences</td><td>242612</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique</td><td>Sigma-Aldrich</td> Spectrum Plant Total RNA Kit Sigma-Aldrich <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>STRN50</td><td></td></tr><tr><td>Boules de broyage en acier inoxydable, 3/8''</td><td>OPS Diagnostics</td><td>GBSS 375-1000-02</td><td></td></tr><tr><td>Plaque</td><td></td><td></td><td></td>d’agitation</tr><tr><td>Fluorimètre Synergy 4 Biotek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T100 Thermocycleur</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-9284</td><td></td></tr><tr><td>V8 jus</td><td>Campbell’s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman Qualitative Grade Plain Sheets, Grade 3</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-820P</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur de poignet</td><td>Burrell Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition de la croissance d’aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de lablab purpureus l.

Inhibition of Aspergillus flavus Growth and Aflatoxin Production in Transgenic Maize Expressing the &#945;-amylase Inhibitor from Lablab purpureus L.

Contamination par les aflatoxines dans les cultures de l’alimentation humaine et animale est un défi majeur dans le monde entier. Les aflatoxines, produites par le champignon Aspergillus flavus (a. flavus) sont des agents cancérigènes qui réduisent considérablement la valeur des récoltes de maïs et autres plantes oléagineuses riches comme l’arachide en plus qui posent une menace sérieuse pour la santé humaine et animale. Différentes approches, y compris la reproduction traditionnelle, transgénique expression des protéines de résistance liée et l’interférence ARN (Arni)-base de gène induite par le hôte faire taire des critiques a. flavus gènes cibles, sont envisagées pour augmenter résistance d’aflatoxine dans les cultures sensibles. Des études antérieures ont montré un rôle important de le α-amylase dans la production de pathogénie et d’aflatoxines a. flavus , suggérant cette gène/enzyme est une cible potentielle pour réduire la croissance d’a. flavus et la production d’aflatoxine. À cet égard, la présente étude visait à évaluer l’expression hétérologue (sous contrôle du promoteur CaMV 35 s constitutif) d’une protéine de type inhibiteur de α-amylase Lablab purpureus L. (AILP) chez le maïs contre a. flavus. AILP est une protéine de 36 kDa, qui est un inhibiteur compétitif de l’enzyme α-amylase a. flavus et appartient à la famille de protéine inhibiteur de la lectine – arcelin – α-amylase en commun haricot. Des études in vitro avant les travaux en cours avaient démontré le rôle de AILP dans l’inhibition de l’activité de le α-amylase a. flavus et la croissance fongique. La croissance fongique et la production d’aflatoxine dans les grains mûrs ont été suivis en temps réel en utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus . Ce noyau screening test (KSA) est très simple à mettre en place et fournit des données fiables et reproductibles sur les maladies infectieuses et le degré de propagation qui ont pu être quantifiée pour l’évaluation des ressources génétiques et les lignées transgéniques. La fluorescence de la souche GFP est étroitement corrélés aux champignons de la croissance et, par extension, il est bien corrélé aux valeurs de l’aflatoxine.  Les travaux en cours visait à mettre en œuvre cette connaissance préalable dans une récolte commercialement importante comme le maïs pour augmenter la résistance de l’aflatoxine. Nos résultats montrent une réduction de 35 % à 72 % de croissance d’a. flavus dans les grains transgéniques maïs exprimant l’AILP qui, à son tour, traduit par une réduction de 62 % à 88 % dans les niveaux d’aflatoxine.

Transformation de maïs et de criblage moléculaire des plantes transgéniques
Les embryons immatures de lignées de maïs Hi-II ont été transformées à l’aide d’Agrobacterium tumefaciens EHA101 souche contenant le vecteur de destination final plante exprimant le gène AILP Lablab purpureus sous le contrôle du CaMV 35 s promoteur. Cinq lignées de maïs transformées de façon indépendan...

Nous présentons ici un protocole pour analyser la croissance d’Aspergillus flavus et la production d’aflatoxine dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique.  En utilisant une souche exprimant le GFP a. flavus , nous avons suivi l’infection et la propagation du champignon dans les grains mûrs en temps réel. L’essai est rapide, fiable et reproductible.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Aflatoxin contamination in food and feed crops is a major challenge worldwide. Aflatoxins, produced by the fungus Aspergillus flavus (A. flavus) are ...

Ici, nous présentons un essai simple de criblage de noyau pour analyser la croissance de flavus d’Aspergillus et la production d’Aflatoxin dans les grains de maïs exprimant une protéine antifongique. À l’aide d’une protéine fluorescente verte exprimant la souche Aspergillus flavus, nous surveillons l’infection et la propagation du champignon dans les grains matures en temps réel. Ce simple test fournit un moyen fiable d’évaluer la capacité du grain de maïs à résister à l’infection d’Aspergillus flavus et à la production d’Aflatoxin.Les résultats de cet essai de laboratoire effectués dans des conditions contrôlées sur les grains matures sont en bonne corrélation avec les résultats de l’infection dans des conditions de champ. Le Dr Rajtilak Majumdar, postdoc de notre laboratoire, ainsi que Christine Sickler et David Ambrosio, techniciens en sciences biologiques également de notre laboratoire, démontreront la procédure. Pour commencer, collez des bouchons de 20 deux mm dans une boîte de Pétri pour créer des bouchons KSA.Laisser sécher la colle pendant 48 heures avant d’utiliser les bouchons. Dans une armoire de sécurité biologique pulvériser un plateau de bioassay carré avec 70% d’éthanol dans l’eau. Laisser sécher l’air du plateau.Ajouter du papier chromatographie stérile au plateau sec. Vaporisez neuf des bouchons KSA avec 70% d’éthanol et laissez-les sécher à l’air libre. Ensuite, placez les bouchons sur le plateau de bioassay.Pour chaque lignée de maïs transgénique testée, sélectionnez 20 grains intacts et placez-les dans un tube de centrifugeuse de 50 ml. À l’aide d’un microscope stéréo de table, sélectionnez uniquement les grains intacts pour l’analyse. Les grains endommagés sont plus sensibles à l’attaque d’Aspergillus et produisent plus d’Aflatoxine, faussant ainsi les résultats et ne représentant pas les véritables traits antifongiques ou antimicrobiens de la variété.Ajouter 70 % d’éthanol à chaque tube. Laissez les grains stériliser pendant quatre minutes tout en les secouant parfois doucement. Après cela, versez doucement l’éthanol et rincez doucement les grains dans de l’eau désionisée stérile trois fois.Obtenez une culture de six jours d’Aspergillus flavus tache 70 exprimant GFP cultivé sur V8 moyen. Ajouter 20 ml d’eau déionisée de 0,02 % Triton X-100 dans l’eau déionisée. Et utilisez une boucle stérile pour gratter les spores.Pipette hors de l’inoculum et le transférer à un bécher stérile de 300 ml. Préparez une dilution quintuple avec 0,02 % de Triton X-100 et utilisez un hémocytomètre pour effectuer un nombre de spores. Diluer à nouveau si nécessaire pour obtenir 100 ml avec une concentration de quatre millions de spores par ml.Verser l’inoculum dans un bécher vide. Placer les grains dans un bécher stérile de 300 ml à l’aide d’une barre remuer et remuer pendant trois minutes. À l’aide de forceps transférer les grains dans le plat de bioassay, en s’assurant de ne placer qu’un seul noyau dans chaque bouchon.Ajouter 30 ml d’eau déionisée au fond de chaque plateau de bioassay. Et incuber à 31 degrés Celsius pendant sept jours. Après sept jours d’inoculation avec A.flavus, prenez des photos de quatre grains qui ont été désignés pour l’analyse microscopique et la photographie.Ensuite, utilisez un tissu mou et de l’eau déionisée pour nettoyer l’extérieur des grains. Effectuez des sections longitudinales de grains et prenez immédiatement des photos au microscope fluorescent. Pour préparer les grains à l’analyse, nettoyez l’extérieur des grains restants avec un tissu mou et de l’eau déionisée.Placer quatre grains, qui constituent un représentant, dans un flacon de polycarbonate de 15 ml contenant deux boules d’acier inoxydable. Congelez immédiatement les flacons dans de l’azote liquide et conservez-les à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à procéder à un traitement et à une analyse plus poussées. Une fois prêts, retirer les grains du congélateur et utiliser un homogénéiseur pour les moudre à 1500 rpm pendant trois minutes.Utilisez les mêmes matériaux au sol pour l’analyse GFP, la détermination de l’aflatoxine et l’analyse moléculaire, de sorte que toutes les valeurs soient représentatives des échantillons. Alors qu’un minimum de trois répliques sont recommandées, plus est toujours mieux en fonction de la disponibilité de grains de bonne qualité. Dans cette étude, des embryons immatures de lignées hi-II de maïs sont transformés à l’aide de la souche AGRObacterium tumefaciens EHA101 contenant le vecteur final de destination végétale exprimant le gène Lablab purpureus AILP sous le contrôle du promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur.L’amplification pcr du gène AILP cible a montré un amplicon de 548 bp observé seulement dans les lignées transgéniques de maïs. Le gène AILP a montré l’expression dans les lignes transgéniques tandis qu’aucune expression d’AILP n’a été observée dans les usines témoins. Les spores germinantes à un stade précoce sont exposées à des extraits bruts de feuilles provenant de jeunes plants de maïs transgénique pendant 20 heures.La pleine longueur élevée des spores exposées aux extraits transgéniques de feuille montrent une réduction de 58 à 80% comparée au contrôle négatif. La souche A.flavus utilisée contient un journaliste GFP qui permet la surveillance et la quantification de la croissance fongique en temps réel. Une réduction significative de la fluorescence de GFP est observée dans les grains transgéniques d’AILP comparés au contrôle négatif isogenic.Une réduction significative est observée dans la croissance fongique pour les lignes AILP quatre et cinq, 69% et 72%respectivement. Les autres lignes montrent une réduction de 35 à 60% par rapport aux grains de commande. Une réduction de 62 à 88 % de la teneur en aflatoxine a été observée dans les grains de l’AILP par rapport au contrôle.La ligne quatre est considérée comme la plus faible teneur en aflatoxine à 486 ng par g, suivie par d’autres lignes dont le contenu se situe entre 640 et 1498 ng par g dans les grains. Après cette procédure, d’autres méthodes peuvent être effectuées, comme l’utilisation d’un fluoromètre pour quantifier le GFP et sa croissance fongique. Les kits commerciaux immunobasés ou HPLC ou EPLC peuvent être utilisés pour effectuer la quantitation de l’Aflatoxin.La disponibilité de KSA fournit un moyen rapide et simple de déterminer la résistance à la contamination par l’aflatoxine. Les différentes lignées de reproduction du maïs peuvent être évaluées rapidement à l’aide de cette technique. Bien que l’analyse de criblage du noyau ne soit pas dangereuse, l’opérateur doit se protéger contre l’exposition aux spores d’Aspergillus flavus, utiliser un équipement de protection approprié.

inhibition-aspergillus-flavus-growth-aflatoxin-production-transgenic

Research

Recherche

JoVE Journal

Environment

Environnement

La dévastation des cultures céréalières par moisissures infectant les semences a incité de nombreux efforts de recherche afin de mieux comprendre les interactions plante-pathogène. Pour étudier les semences fongiques interactions dans un environnement de laboratoire, nous avons développé une méthode robuste pour la quantification de la reproduction des champignons, la biomasse et contamination par les mycotoxines en utilisant des essais biologiques du noyau.

Quantification de la colonisation fongique, sporogénèse, et la production de mycotoxines utilisant Bioassays noyau

L’utilisation d’une méthode d’injection d’aiguille pour inoculer le maïs et les plantes de teosinte avec l’agent pathogène biotrophic Ustilago maydis est décrite.  La méthode d’inoculation par injection d’aiguille facilite l’administration contrôlée de l’agent pathogène fongique entre les feuilles de la plante où l’agent pathogène pénètre dans la plante par la formation d’apprésoria. Cette méthode est très efficace, permettant des inoculations reproductibles avec U. maydis.

Une méthode rapide et efficace pour évaluer la pathogénicité d’Ustilago maydis sur les lignées de maïs et de téosinte

Nous démontrons une méthode pour l'analyse des aflatoxines et l'expression du transgène dans les graines d'arachide qui contiennent des signaux ARN interférence pour réduire au silence des gènes de synthèse de l'aflatoxine dans le champignon Aspergillus flavus. Contrôle de l'ARNi médiée par des mycotoxines dans les plantes n'a pas été signalé précédemment.

Contrôle des aflatoxines dans les arachides ARNi médiée: méthode pour analyser la production de mycotoxines et Transgene expression dans la Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystème

Nous décrivons une stratégie de remplacement de gène robuste pour manipuler génétiquement le champignon Ustilago maydis. Ce protocole explique comment générer des mutants de deletion pour enquêter sur les phénotypes d'infection. Elle peut être étendue à modifier les gènes de manière quelconque, par exemple en ajoutant une séquence codant pour une étiquette de protéine fluorescente.

Manipulation génétique de l&#39;agent pathogène des plantes<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Pour étudier la biologie de Fungal and Plant Microbe Interactions

Cet ouvrage décrit le clonage d’une souche de cheval de Troie Ustilago maydis pour la prestation in situe des protéines sécrétées de maïs en trois différents types de tissus de maïs.

À l’aide d’Ustilago maydis comme un cheval de Troie pour la livraison de la protéine maïs In Situ

Les gènes morphogènes végétaux peuvent être utilisés pour améliorer la transformation génétique des génotypes récalcitrants. Décrit ici est un protocole de transformation génétique Agrobacterium-négocié(QuickCorn) pour trois lignées de maïs de maïs public importants consanguins.

Agrobacterium-Transformation d’embryon immature médié des lignées consanguines de maïs récalcitrants utilisant des gènes morphogènes

Un protocole d’injection (agroinjection) à base d’Agrobacterium est présenté pour l’inoculation du virus de la mosaïque de la queue de renard et du virus de la mosaïque de la canne à sucre dans les semis de maïs. L’inoculation de cette manière conduit à une infection virale, à un silençage génique induit par le virus des gènes marqueurs et à une surexpression virale de GFP.

Agroinoculation directe de plants de maïs par injection avec le virus recombinant de la mosaïque de la queue de renard et le virus de la mosaïque de la canne à sucre Clones infectieux

Ce manuscrit détaille un protocole d’inoculation optimisé qui utilise des gaines de feuilles de maïs détachées pour des études cytologiques, physiologiques et moléculaires reproductibles des interactions du maïs avec les agents pathogènes fongiques des plantes. Les gaines foliaires facilitent l’observation en temps réel des interactions cellulaires entre la plante vivante et le champignon dans les tissus non fixés.

Gaines de maïs détachées pour l’imagerie de cellules vivantes d’une infection par des agents pathogènes fongiques foliaires du maïs

Pour parvenir à la suppression de la population d’Aedes aegypti à l’aide du système RIDL® (Libération d’insectes porteurs d’une létalité dominante), un grand nombre de moustiques mâles doivent être relâchés. Cela nécessite l’utilisation de techniques et de technologies d’élevage en masse pour fournir des systèmes fiables permettant d’obtenir le maximum de moustiques mâles de haute qualité.

Production en masse d’Aedes aegypti génétiquement modifié pour les disséminations sur le terrain au Brésil

procédures de microplaques sont décrites pour l'analyse colorimétrique ou fluorimétrique de l'activité enzymatique extracellulaire. Ces procédures permettent l'analyse rapide d'une telle activité dans un grand nombre d'échantillons de l'environnement dans un laps de temps raisonnable.

Détermination de l&#39;activité enzymatique microbienne extracellulaire dans les eaux, les sols et les sédiments de haut débit microplaques dosages

Découvrez un test de criblage de grains simple pour analyser la croissance d'Aspergillus flavus et la production d'aflatoxine dans les grains de maïs transgéniques. Cette méthode utilise une souche GFP pour surveiller l'infection fongique en temps réel.

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L. (Vidéo) | JoVE Journal

Inhibition de la croissance d’Aspergillus flavus et la Production d’aflatoxine dans l’expression de maïs transgénique l’inhibiteur de le α-amylase de Lablab purpureus L.

Explorer plus de vidéos