Name: Utilisation de la diffusion améliorée par Nanoplasmon et imagerie microscopique à faible grossissement pour quantifier les exosomes dérivés de tumeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Découvrez l'essai nPES pour quantifier rapidement les exosomes dérivés de tumeurs sans purification préalable. Cette méthode nanoplasmonique permet l'analyse de biomarqueurs sur de petits échantillons cliniques.

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Le travail a été principalement appuyé par le financement de la recherche fourni par NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 et R21Al126361-01), la Commission de recherche biomédicale de l’Arizona (ABRC) Young enquêteur Award.

1. préparation des sondes de nanoparticles
Note: ce dosage utilise des nanorods d’or fonctionnalisés (aunrs; 25 nm de diamètre x 71 nm de longueur) qui sont conjugués façon covalente avec des polymères de neutravidine (AV) et ont un pic de résonance de Plasmon de surface qui produit un signal de diffusion rouge (641 Nm crête) sur DFM illumination.
<ol><li>Laver 40 μL d’AuNR-AV (2,56 x 1011 particules) trois fois avec 200 ΜL de PBS (pH 7,0) par centrifugation et aspiration (8 500 x g à 4 ° c pendant 10 minutes), suivie d’une centrifugation finale et d’une étape d’aspiration après laquelle le granule aunr-AV est suspendu en 40 μL de PBS.</li>
	<li>Mélanger cette suspension AuNR-AV avec 10 μL d’anticorps biotinylés (0,5 mg/mL) spécifique pour un antigène à la surface du sous-type d’intérêt exosome et 150 μL de PBS, puis mélanger à 4 ° c pendant 2 h à l’aide d’un mélangeur pour permettre la fixation de la neutravidine-biotine pour atteindre l’achèvement.</li>
	<li>Laver les AuNRs (AuNR-IgG) conjugués par anticorps résultant trois fois par centrifugation et par aspiration (6 500 x g à 4 ° c pendant 10 minutes), puis les suspendre dans 200 ΜL de PBS et les entreposer à 4 ° c jusqu’à leur utilisation. Remarque: la technique stérile et les temps de stockage courts doivent être utilisés pour éviter la contamination et la dégradation de l’AuNR-IgG. Il est préférable d’utiliser des AuNRs conjugués aux anticorps dans les 24 heures suivant leur conjugaison.</li>
</ol>2. préparation des diapositives de capture EV
<ol><li>Diluer les anticorps de capture d’exosome sélectionnés à 0,025 mg/mL dans le PBS et ajouter 1 μL/puits de cette dilution sur une glissière A/G de protéine multi-puits, puis incuber cette lame à 37 ° c pendant 1 h dans une chambre humidifiée pour permettre la liaison d’anticorps de capture à la protéine A/G immobilisée sur la diapositive.</li>
	<li>Aspirer les puits pour éliminer les anticorps non liés et laver les puits trois fois par addition et aspiration de 1 μL/puits de PBS, puis charger chaque puits avec 1 μL de tampon bloquant (voir tableau des matériaux) et incuber la glissière pendant 2 h à 37 ° c dans une chambre humidifiée pour b verrouiller les autres sites de fixation des protéines.</li>
	<li>Aspirer les puits pour enlever le tampon bloquant, laver les puits trois fois par l’addition et l’aspiration de 1 μL/puits de PBS, et utiliser immédiatement les glissières bloquées pour la capture et l’analyse des exosome.</li>
</ol>3. préparation de la courbe standard
<ol><li>Pour quantifier précisément l’abondance absolue ou relative d’un sous-type spécifique d’exosome, l’utilisateur doit générer une courbe standard avec une population exosome pure qui exprime uniformément le biomarqueur de surface exosome d’intérêt. Cette étude analyse l’abondance des exosomes exprimant une protéine membranaire associée à une métastase, le récepteur de l’éphrine a2, qui a une relation rapportée avec le stade du cancer pancréatique et le pronostic6,18. NOTE: la lignée de cellules cancéreuses pancréatiques humaines PANC-1 et ses exosomes sont connues pour exprimer cette protéine et les exosomes isolés de cette lignée cellulaire ont été utilisés pour générer une courbe standard pour quantifier le nombre d’exosomes qui expriment cette protéine dans l’exosome complexe Échantillons.</li>
	<li>Cellules de culture pendant 48 heures à 37 ° c dans des milieux de culture sans sérum pour permettre l’accumulation d’exosome dans les milieux, puis isoler les surnageants de culture cellulaire par centrifugation des cultures de suspension ou aspiration directe de milieux de culture à partir de cultures cellulaires adhérentes.</li>
	<li>Centrifugez le support recueilli à 2000 x g pendant 30 min pour enlever les débris et récupérer le surnageant.</li>
	<li>Filtrer le surnageant de culture clarifiée à l’aide d’une unité de filtration à faible teneur en protéines de 0,45 μm de capacité appropriée (p. ex. une unité de filtrage sous vide polyéther de 250 mL).</li>
	<li>Concentrer le filtrat résultant par centrifugation à 3200 x g à l’aide d’un système de filtre de limite de poids moléculaire nominal 100 000 à 250 μl de volume final. Recueillir le volume retenu de ce filtre, puis laver le filtre avec 200 μL de PBS, et combiner ce volume de lavage avec le volume d’échantillon d’exosome collecté.</li>
	<li>Centrifugez cet échantillon à 21 000 x g pendant 45 minutes et récupérez soigneusement le surnageant, en prenant soin de ne pas prélever de matière précipitée.</li>
	<li>Centrifuger le surnageant récupéré à 100 000 x g pendant 3 heures pour précipiter les exosomes. Aspirer le surnageant et recueillir le culot exosome dans 100 μL de PBS.</li>
	<li>Conserver les suspensions exosome obtenues à 4 ° c si elles sont utilisées dans les 24 heures ou à-80 ° c pour un entreposage à long terme. Remarque: ne pas soumettre d’échantillons d’exosome pour répéter les cycles de gel-dégel.</li>
	<li>Quantifier une aliquote de la suspension exosome après mélange par mesurage direct de nombres exosome (par exemple, par analyse de suivi des nanoparticules ou par détection d’impulsions résistives réglables ou par mesure de la concentration protéique des lysats exosome par micro-bicinchoninique dosage de l’acide, ou une méthode équivalente, comme moyen d’estimer la quantité d’exosome)16,19.</li>
	<li>Générez un ensemble de dilutions sérielles de la suspension d’exosome pour permettre la comparaison du signal de nanoparticules à l’entrée du nombre exosome ou de la teneur en protéines.</li>
	<li>Transférer 1 μL de chaque étalon exosome à chacun de ses puits répliqués sur la plaque de dosage. Remarque: les courbes standard peuvent être utilisées pour calculer la pente de la ligne de corrélation entre le signal de nanoparticules et la concentration d’exosome à (1) évaluer la performance du dosage et (2) déterminer la concentration relative des exosomes cibles dans les échantillons expérimentaux.</li>
</ol>4. traitement des échantillons plasmatiques ou sériques humains
<ol><li>Prélever des échantillons de plasma ou de sérum par des méthodes standard et conserver à-80 ° c jusqu’à ce que nécessaire pour l’analyse exosome. Décongeler rapidement les échantillons dans un bain d’eau à température ambiante. Mélanger à plusieurs reprises les échantillons décongelés par inversion pour favoriser une suspension homogène. NOTE: les résultats des échantillons de sérum et de plasma peuvent ne pas être équivalents, car il y a une libération importante d’exosomes pendant la réaction de coagulation.</li>
	<li>Centrifuger les échantillons de plasma ou de sérum à 500 x g pendant 15 min pour précipiter les agrégats protéiques et autres débris. Transférer une aliquote de l’échantillon de plasma ou de sérum dans un tube frais et ajouter du PBS pour générer une dilution 1:1. Mélanger l’échantillon dilué par Vortex doux ou par inversion, selon le cas. Transférer 1 μL de chaque suspension plasmatique ou sérique dans chacun de ses puits répliqués sur la plaque de dosage.</li>
</ol>5. capture et détection d’exosome
<ol><li>Chargez les puits d’une glissière de capture EV bloquée avec 1 μL/puits d’échantillon d’exosome, en utilisant 8 répétitions par échantillon, et incubez la diapositive pendant la nuit à 4 ° c dans une chambre humidifiée. Aspirer tous les puits d’échantillonnage, puis ajouter 1 μL/puits de PBS pour laver les puits et enlever les exosomes non liés et autres contaminants de l’échantillon d’exosome chargé.</li>
	<li>Charger les puits d’échantillonnage avec 1 μL/puits d’une suspension AuNR-IgG préalablement préparée (voir section 1 ci-dessus) et incuber la glissière pendant 2 h à 37 ° c dans une chambre humidifiée. Aspirer la solution de nanoparticules et laver la lame en PBS additionnée de 0,01% de Tween-20 (PBST) pendant 10 min à l’aide d’un mélangeur, puis aspirer et laver tous les puits d’échantillonnage avec de l’eau désionisée pendant 10 min à l’aide d’un mélangeur rotatif et sécher à l’air pour les images ultérieures de LMDFM. NOTE: les coefficients de variation inter-essais (CVs) sont évalués à partir de huit répétitions du même échantillon. Les échantillons qui présentent des CV > 20% sont considérés comme non informatifs et devraient être répétés, s’il y a suffisamment d’échantillons.</li>
</ol>6. capture d’image DFM
<ol><li>Capturer des images pour la quantification d’exosome sous un éclairage cohérent à l’aide d’un appareil photo numérique attaché à un microscope équipé d’un condenseur à champ sombre (1,2 < NA < 1,4) et d’un objectif 4x employant une durée d’exposition de 1/220 s.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel de capture d’image. Remarque: nous utilisons le logiciel d’imagerie de microscope NIS-Elements (voir le tableau des matériaux) pour le protocole décrit ci-dessous, mais il est possible d’utiliser un autre logiciel qui peut correspondre à ses paramètres de capture d’image. Le logiciel d’imagerie NIS-Elements Viewer est un programme autonome gratuit pour afficher les fichiers d’image et les jeux de données qui contiennent des outils d’analyse, de visualisation et d’archivage. Les paramètres ci-dessous sont également pour un microscope avec autofocus et une étape automatisée qui permet à plusieurs images d’être automatiquement capturées et cousues dans une seule image.</li>
	<li>Placez la glissière à l’envers au niveau du microscope, ajustez la position de la glissière et appliquez une petite goutte d’huile à immersion à l’arrière de la glissière, où l’objectif du condenseur contacte la glissière.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Live dans l’interface du logiciel, et réglez le temps d’exposition par rapport à une norme de concentration élevée bien pour s’assurer que l’image n’est pas saturée.</li>
	<li>Ouvrez la fenêtre numériser grande image à partir de l’onglet acquérir et définissez les paramètres de l’interface logicielle comme suit: macro image optique conf = Current; Objectif: 2:10x, balayage optique conf = courant, objectif: 2:10x; Chevauchement de coutures = 20%; Coutures via = chemin optimal.</li>
	<li>Choisissez Create large image, fermez l’obturateur actif pendant le mouvementde la scène, attendez avant chaque capture: 20 ms, focus manuellement au début, et Utilisez le focus étape par étape tous les 20 champs. Ces paramètres seront sauvegardés avec les images numérisées.</li>
	<li>Déplacez l’étape du microscope pour définir les limites inférieures gauche en haut à droite du champ de numérisation cible. Ajustez la mise au point pour obtenir une image claire sur le moniteur et ajustez les paramètres du condenseur et l’éclairage environnemental si nécessaire pour minimiser les irrégularités d’éclairage dans l’image ciblée.</li>
	<li>Nommez le fichier de sortie d’image dans le logiciel. Cliquez sur le bouton numériser et laissez le microscope numériser et créer et enregistrer une image cousue de la diapositive entière.</li>
	<li>Ouvrez l’image enregistrée avec le logiciel de capture d’image que vous utilisez et enregistrez-la à l’échelle 1/8 pour une analyse ultérieure sur le plugin DSM dans ImageJ.</li>
</ol>7. analyse d’image DFM
<ol><li>Téléchargez le programme ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Installez le plugin d’algorithme DSM dans ImageJ en utilisant les instructions répertoriées à https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel ImageJ, puis définissez les paramètres d’entrée suivants dans l’algorithme DSM: seuil de contour (CT) = 253,020, type = rouge, échelle (S) centrale = 0,8, limite de quantification basse (LT)/haute (HT) = 0/62.</li>
	<li>Ouvrez l’image enregistrée à partir de la section 6,8 avec ImageJ. Choisissez le bouton Scan DSM dans l’onglet plugins , puis définissez le nombre de colonnes et de lignes en fonction de l’image ouverte. Le programme peut reconnaître les zones de détection et l’analyse de l’intensité de dispersion de nanoparticules dans les zones d’après automatiquement. Définissez les paramètres d’entrée suivants dans la fenêtre DSM Scan : redimensionner le pourcentage = 25, diamètre du spot (en pixels) = 190 – 200, plage de diamètre = 32, diamètre d’incrément (en pixels) = 8, configuration DSM-faible Limit = 0, limite élevée = 62, distance adjacente = 100, soustraction du biais = 0. NOTE: les résultats de l’intensité de dispersion des nanoparticles reflètent la quantité d’exosomes liés sur la diapositive.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les exosomes proviennent d’invaginations réglementées de la membrane endosome externe qui produisent des corps multivésiculaires, un sous-ensemble spécialisé d’endosomes qui contiennent un grand nombre de vésicules intraluminales qui subissent une fusion avec la membrane plasmique pour libérer la maturité exosomes dans l’espace extracellulaire. En raison de cette voie de biogenèse, les exosomes peuvent transporter des facteurs liés à la membrane associés à des fractions membranaires qui comprennent ou fusionnent avec la membrane endosome, ainsi que plusieurs types différents de composants cytosoliques, et contiennent donc des cargaisons de protéines, d’ADN et divers sous-types d’ARN (mRNA, microRNAs, RNAs à long non-codage) qui peuvent refléter le phénotype de leur cellule d’origine20. Étant donné que les exosomes sont sécrétés par la plupart sinon tous les types de cellules, peuvent présenter une augmentation de la sécrétion de cellules malades ou malignes, et s’accumulent dans la plupart des fluides corporels, les exosomes font l’objet d’une investigation exhaustive et systématique comme une promesse minimale des moyens invasifs pour détecter des pathologies spécifiques et surveiller leurs réponses au traitement21.
L’isolement d’exosome, qui est nécessaire pour la plupart des analyses exosome actuelles, est une procédure longue et intensive en main-d’œuvre, limitant la traduction clinique des biomarqueurs associés à l’exosome avec une pertinence médicale potentielle. De nombreuses méthodes d’isolement courantes (ultracentrifugation, taille-exclusion, précipitation, etc.) ne distinguent pas assez souvent les exosomes (30 – 100 nm) des micro-vésicules (100 – 1000 nm) et des corps apoptotiques (100 – 5000 nm) en raison de chevauchements dans leurs gammes de taille ou Propriétés physiques ou peuvent endommager l’intégrité de l’exosome15. De nouvelles approches sont en cours d’élaboration qui peuvent permettre des analyses plus rapides de l’exosome, mais il n’est pas clair comment il peut être possible de mettre en œuvre un grand nombre de ces plateformes dans des contextes cliniques dus.
Dans ce rapport, nous présentons une nouvelle approche qui permet la quantification de l’exosome à haut débit à base de nanoparticles à l’aide d’images microscopiques de champ sombre à faible grossissement. Cette méthode ne nécessite pas de purification d’exosome, d’équipement dédié coûteux ou de nouvelle expertise technique et devrait donc être susceptible d’être traduite rapidement dans la plupart des milieux de recherche et cliniques. Notre dosage peut être appliqué pour quantifier précisément la concentration d’une population exosome cible portant un biomarqueur spécifique lorsque les résultats de l’analyse sont comparés à une courbe standard, puisque nos résultats montrent qu’il y a une forte corrélation linéaire (R2 = 0,99) entre la réponse optique et la concentration exosome. Pour démontrer le potentiel réel de cette approche, nous avons fourni des données où nous avons utilisé cette méthode pour quantifier la concentration d’un biomarqueur exosome associé au cancer pancréatique dans des échantillons sériques obtenus chez des patients avec et sans cancer pancréatique.
Dans LMDFM, le puits de l’échantillon entier est imagé pour éviter le biais de sélection trouvé dans les analyses DFM à fort grossissement, où les utilisateurs doivent choisir directement les champs d’échantillon à capturer pour l’analyse d’image ultérieure, mais est soumis à des artefacts de diffusion de la lumière de la surface irrégularités, y compris les rayures et les débris d’échantillon. Cet arrière-plan peut être réduit pour détecter le signal dérivé de l’exosome cible en utilisant notre algorithme de réduction du bruit DSM qui fonctionne sur le programme d’analyse d’image NIH, ImageJ, mais il faut toujours prendre soin d’éviter d’introduire de tels artefacts qui peuvent réduire la plage dynamique de le dosage.
Matériaux utilisés dans ce dosage:
Des lames multi-puits SuperProtein A/G contenant 1 μL/puits ont été achetées chez ArrayIt Corporation (AGMSM192BC). Des nanoparticules ont été obtenues à partir de Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). Les images DFM ont été capturées avec un appareil photo numérique Nikon DiR2 attaché à un microscope Nikon TI-Eclipse, avec un éclairage cohérent et un temps d’exposition de 1/220 s. La lignée de cellules PANC-1 utilisée dans cette étude a été achetée à l’American Type Culture Collection.

Les exosomes sont libérés de la plupart des types cellulaires et jouent un rôle clé dans les communications entre cellules, y compris les processus pathophysiologiques associés à diverses maladies, car ils peuvent être à la maison à des tissus spécifiques ou des types de cellules, et contiennent une variété d’acides nucléiques , les protéines et les lipides qui reflètent leur cellule d’origine et peuvent exercer des effets réglementaires sur leurs cellules réceptrices1,2,3,4. Les exosomes sont souvent sécrétés à des niveaux élevés dans les États de la maladie, peuvent interagir avec les cellules adjacentes et éloignées, et se trouvent à une concentration relativement élevée dans la circulation ainsi que la plupart des autres fluides corporels, y compris la salive, l’urine, pancréatique et la bile jus, et le liquide de lavage bronchoalvéolaire5,6,7,8,9,10,11. Cette abondance et la stabilité des exosomes dans les fluides corporels humains, couplés à leur nature riche en informations, en font des biomarqueurs idéaux pour le diagnostic de la maladie et la surveillance du traitement.
Cela inclut les exosomes dérivés de tumeurs (TDEs), qui contiennent des facteurs spécifiques à la tumeur ou sélectifs, qui peuvent servir de biomarqueurs de la maladie, y compris les allèles mutants associés aux tumeurs. Les TDEs peuvent participer à la retouche du microenvironnement tumoral pour faciliter le développement des tumeurs et les métastases, et réguler les réponses anti-tumorales12. La sécrétion accrue de TDE est un phénotype commun de la plupart des cancers et plusieurs caractéristiques du microenvironnement tumoral, y compris l’hypoxie, le pH acide et l’inflammation, sont connues pour favoriser la sécrétion d’exosome. Étonnamment, étant donné le nombre de cellules qui sécrètent des exosomes, une augmentation du niveau total d’exosome peut, elle-même, fonctionner comme un biomarqueur du cancer. Par exemple, une étude récente a révélé que la concentration totale de EV dans le jus de bile discrimine malignes et non malignes chez les patients atteints de sténose du canal biliaire commun avec 100% de précision7. Des résultats similaires ont été trouvés avec des études utilisant d’autres fluides corporels, y compris le plasma. Cependant, en raison de la possibilité de variations de sujets et d’autres facteurs confusionnels, la plupart des études sur les exosomes comme biomarqueurs de la maladie se sont concentrées sur la détection de biomarqueur qui sont sélectivement associés aux TDEs au lieu de l’exosome total Numéros.
Cependant, traduire les biomarqueurs exosome en pratique clinique demeure difficile, car la plupart des approches d’essais exosome signalées exigent des procédures d’isolement chronophages et intensives en main-d’œuvre 13. Les méthodes d’isolement d’exosome couramment utilisées incluent l’ultracentrifugation, les gradients de densité, la taille-exclusion, la co-précipitation, la capture d’affinité et les approches d’isolement microfluidique. Ultracentrifugation est la méthode "Gold standard", et est le plus couramment utilisé pour les isolations exosome, mais cette procédure est chronophage et entraîne des dommages exosome et exosome membrane clustering, et produit des échantillons d’exosome qui sont contaminés par protéines, lipoprotéines et autres facteurs pouvant influencer les analyses ultérieures14. La plupart des méthodes d’isolement exosome, y compris l’ultracentrifugation, ne peuvent séparer les exosomes (30 – 150 nm) des micro-vésicules (100 – 1000 nm) et des corps apoptotiques (100 – 5000 nm), qui surviennent par différents mécanismes et ont des fonctions différentes, en raison de la taille chevauchement entre ces groupes, et la diversité des populations exosome15. De nouvelles approches sont nécessaires pour améliorer la sensibilité et la reproductibilité des essais d’exosome en améliorant la récupération des exosome tout en réduisant les dommages et la contamination des exosome, bien que tout dosage basé sur ces méthodes devra également être optimisé pour les rendre adapté à la traduction vers des applications en milieu clinique.
Plusieurs études récentes ont proposé d’utiliser des plateformes intégrées pour capturer et analyser des exosomes directement à partir de fluides corporels. Ces méthodes emploient la microfluidique, l’électrocinétique, la capture d’affinité, et diverses autres méthodes pour l’isolement d’exosome, et l’électrochimie, la résonance de Plasmon de surface, et d’autres méthodes pour détecter les exosomes capturés. On ne sait pas très bien dans quelle mesure ces approches seront réalisables dans des contextes cliniques, en raison de leur complexité, de leurs dépenses, de leur faible débit ou d’autres problèmes.
Nous avons développé un dosage rapide et peu coûteux qui peut être utilisé pour la quantification sensible et spécifique des exosomes totaux et des sous-types spécifiques de l’exosome, y compris les exosomes associés à la maladie, tels que les TDEs, qui ne nécessitent qu’une petite quantité d’échantillon et qui utilise un workflow rationalisé adapté aux environnements cliniques. Dans ce dosage, une diapositive est recouverte d’anticorps qui lient soit un marqueur spécifique à l’exosome ou spécifique à la maladie, exprimé sur la surface de l’exosome, afin de capturer directement les exosomes cibles présents dans les échantillons plasmatiques ou sériques de faible volume appliqués aux puits sur le glisser. Les exosomes capturés sont ensuite hybridés avec un nanoparticules conjugué aux anticorps qui reconnaît le biomarqueur de l’intérêt sur ces exosomes, qui peut être soit un marqueur exosome général, soit un facteur spécifique pour un sous-type d’exosome d’intérêt. Les images de ces puits d’échantillonnage sont ensuite capturées à l’aide d’un microscope à champ sombre (DFM) et analysées pour mesurer la lumière diffusée à partir de nanoparticules liées à des exosomes d’intérêt capturés dans chaque échantillon puits6,16,17. En particulier, l’imagerie d’un puits d’échantillonnage entier par DFM à faible grossissement (LMDFM) évite un biais de sélection rencontré avec des analyses DFM à grossissement élevé lorsque les utilisateurs doivent choisir directement les champs à capturer pour une analyse d’image ultérieure. L’analyse d’image LMDFM est sujette à des artefacts de dispersion de la lumière des irrégularités de surface, y compris les rayures et les débris d’échantillon, mais ce fond peut être réduit en utilisant un algorithme simple de réduction du bruit que nous avons développé pour fonctionner sur le programme d’analyse d’image NIH, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Cet algorithme applique d’abord un seuil de contour d’entrée qui est utilisé pour détecter les limites du puits de l’échantillon pour définir la région de l’image pour une analyse ultérieure. La région définie par cette zone de contour est ensuite divisée en un signal distinct présent dans les canaux rouge, bleu et vert de l’image et le canal bleu est soustrait du canal rouge pour supprimer le signal provenant des artefacts de surface et de l’éclairage irrégulier de nanotige signal.
Cet article décrit comment utiliser ce dosage pour quantifier rapidement soit des niveaux totaux ou spécifiques d’exosome dans des échantillons plasmatiques ou sériques.

<table><tbody><tr><td>Eppendorf Repeater stream</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-401-040</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus</td><td>Eppendorf</td><td>3120000011</td><td>0.1 &ndash ; 2.5 &ndash ; L, gris foncé</td></tr><tr><td>Nanotiges d’or fonctionnalisées</td><td>Nanopartz</td><td>C12-25-650-TN-DIH-50-1</td><td>Fonctionnalisation in vitro du polymère de neutravidine</td></tr><tr><td>HulaMixer Mélangeur d’échantillons</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15920D</td><td></td></tr><tr><td>Incu-shaker 10L</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H1010</td><td></td></tr><tr><td>Microscope de recherche inversé</td><td>Nikon</td><td>Ti-DH</td><td>Avec condenseur à fond noir, caméra DS-Ri2 et support universel Ti-SH-U, et platine motorisée</td></tr><tr><td>NIS-Elements</td><td>Logiciel d’imagerie de microscope</td><td>Nikon</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (1X)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30256.02</td><td>HyClone</td></tr><tr><td>Protein A/G Treated Glass Substrate Slides</td><td>Arrayit Corp.</td><td>AGMSM192BC</td><td>Substrat de micropuce Premium</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td>Qsonica, LLC</td><td>Q500-110</td><td>Avec sonde standard (#4220)</td></tr><tr><td>Tampon de blocage Superblock</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

utilisation de la diffusion améliorée par nanoplasmon et imagerie microscopique à faible grossissement pour quantifier les exosomes dérivés de tumeurs

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Les cellules infectées ou malignes sécrètent fréquemment plus d’exosomes, conduisant à des niveaux élevés d’exosomes associés à la maladie dans la circulation. Ces exosomes ont le potentiel de servir de biomarqueurs pour le diagnostic de la maladie et de surveiller la progression de la maladie et la réponse au traitement. Cependant, la plupart des procédures d’analyse exosome exigent des étapes d’isolement et de purification d’exosome, qui sont généralement chronophages et laborieuses, et donc d’utilité limitée dans les milieux cliniques. Ce rapport décrit une procédure rapide pour analyser des biomarqueurs spécifiques sur la membrane externe des exosomes sans nécessiter d’isolement séparé et des étapes de purification. Dans cette méthode, les exosomes sont capturés sur la surface d’une diapositive par des anticorps spécifiques à l’exosome, puis hybridés avec des sondes d’anticorps conjuguées aux nanoparticles spécifiques à une maladie. Après l’hybridation, l’abondance de la population exosome cible est déterminée par l’analyse des images du microscope à champ foncé à faible grossissement (LMDFM) des nanoparticules liées. Cette approche peut être facilement adoptée pour la recherche et l’utilisation clinique pour analyser les biomarqueurs exosome associés à la membrane liés à la maladie.

Les lames enrobées de protéine A/G (figure 1a) ont été fonctionnalisées avec un anticorps anti-EPHA2 puis utilisées pour capturer spécifiquement des exosomes EPHA2-positifs à partir d’échantillons sériques de patients avec et sans cancer pancréatique (1 μl/puits) et incubés avec des nanotiges d’or conjugués avec un anticorps anti-CD9 (figure 1b). Des images DFM de lumière dispersées de ces nanoparticules ont été analysées en utilisant le plugin DSM dans le logiciel ImageJ pour quantifier les exosomes positifs EphA-2 liés dans chaque puits. L’algorithme DSM définit automatiquement la limite d’un puits d’échantillonnage, filtre le bruit des artefacts, calcule le signal dispersé de chaque puits et génère ces informations (figure 2). L’algorithme DSM atténue fortement les artefacts de diffusion de la lumière à partir des rayures ou des débris présents dans l’échantillon et améliore la sensibilité et la reproductibilité de la détection des nanopartifices et peut traiter automatiquement un lot d’images de diapositives pour un débit élevé utiliser. Cet algorithme utilise les commandes ImageJ et les paramètres d’entrée par l’utilisateur pour soustraire l’arrière-plan de l’image, calculer le signal de diffusion de chaque puits et générer un fichier de données et d’image (figure 3). Les régions d’intérêt sont définies par les limites de puits de haute intensité dans l’image de capture en utilisant la fonction de seuil de contour du programme de macro ImageJ. Les analyses d’images utilisent un seuil prédéfini de contour et des paramètres d’image pour calculer l’intensité de la dispersion des nanoparticles pour chaque puits.
Comme indiqué dans nos travaux précédents (renseignements supplémentaires de Liang et coll.6), les exosomes isolés des cultures cellulaires de Panc-1 caractérisées par la microscopie électronique à transmission et la tache occidentale présentaient la gamme de taille, la morphologie et le marqueur protéique expression cohérente avec un échantillon d’exosome de haute pureté. Les exosomes PANC-1, préparés avec la même procédure que nos travaux précédents, ont été utilisés ici pour valider notre dosage des NPE pour la quantification de l’exosome. Ce dosage a utilisé un anticorps anti-EphA2 pour capturer une grande population d’exosomes de la population exosome totale et un anticorps contre la protéine générale exosome CD9 pour détecter les exosomes capturés. Les résultats obtenus à l’aide d’échantillons d’exosome PANC-1 dilués en série, avec des concentrations protéiques variant de 0,24 à 1,2 μg/μL, ont montré une bonne reproductibilité dans les puits répliqués (figure 4a) et une forte corrélation linéaire entre la réponse de dispersion et la concentration de protéines exosome (figure 4b).
Pour démontrer l’application potentielle de cette méthode, des échantillons sériques de patients avec ou sans cancer pancréatique ont été analysés afin de détecter l’abondance d’exosomes sériques exprimant le biomarqueur EphA2 associé au cancer, en utilisant un anticorps anti-EphA2 pour capturer directement les exosomes cibles à partir de sérum et de nanoparticules conjugués avec un anticorps anti-CD9 pour détecter les exosomes liés. Cette analyse a révélé que les échantillons sériques des patients atteints de cancer pancréatique avaient des niveaux significativement plus élevés d’exosomes EphA2 + (figure 5) que leurs témoins.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig1.jpg"> Figure 1: schéma de quantification exosome. (A) schéma des lames A/G protéinées à plusieurs puits (192 puits) utilisées dans ce dosage. (B) les exosomes cibles sont directement capturés à partir d’échantillons, y compris le sérum et le plasma, par immobilisation de surface sur l’anticorps de capture (par exemple, anticorps anti-EPHA2) liés à la diapositive, puis incubés avec des nanotiges d’or conjugués avec une détection anticorps (p. ex. anticorps anti-CD9) avant analyse par analyse d’image DFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig2.jpg"> Figure 2: quantification de l’exosome en appliquant l’algorithme DSM aux images LMDFM. Les images à faible grossissement sont traitées avec l’algorithme DSM pour éliminer le signal d’arrière-plan et les artefacts de signal qui peuvent résulter de rayures, de mélanges de vides, de débris et d’un éclairage d’échantillon irrégulier pour permettre une détection robuste du signal nanotige d’or, qui en corrélation avec la concentration d’exosome. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Sun, D. et coll. méthode de réduction du bruit pour quantifier la dispersion de la lumière de nanoparticle dans les images de champ lointain de microscope à faible grossissement. Chimie analytique. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) société chimique américaine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig3.jpg"> Figure 3: schéma des commandes et des sorties de l’algorithme DSM. Les étapes indiquées utilisent des commandes natives d’ImageJ et tous les paramètres d’entrée sont sélectionnés en fonction des exigences des expériences via l’interface utilisateur graphique. Ce chiffre a été adapté avec la permission de Sun, D. et coll. méthode de réduction du bruit pour quantifier la dispersion de la lumière de nanoparticle dans les images de champ lointain de microscope à faible grossissement. Chimie analytique. 88 (24), 12001-12005 (2016). Copyright (2016) société chimique américaine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig4.jpg"> Figure 4: images nPES LMDFM représentatives et données de sortie DSM. (A) image lmdfm d’un essai de NPE analysant un gradient de concentration d’exosomes de Panc-1 et (B) la corrélation linéaire du signal optique et de la concentration d’exosome de cette diapositive (de gauche à droite: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 μg/μL respectivement pour chaque colonne). Les données sont présentées en tant que moyenne ± SE, n = 6, avec un coefficient de corrélation de Pearson R2 = 0,99 et un coefficient de variation pour les répétitions de chaque concentration &lt; 0,2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig5.jpg"> Figure 5: le signal LMDFM de EphA2+ exosomes diffère dans le sérum des patients avec et sans cancer pancréatique. Les échantillons sériques analysés par les NPE à l’aide d’un anticorps anti-EphA2 (associé au cancer) et d’un anticorps anti-CD9 (marqueur exosome général) ont montré une différence significative dans la concentration des exosomes EphA2 + dans les échantillons sériques des patients atteints et sans cancer pancréatique (N = 7/groupe). Les résultats sont présentés en moyenne ± SE. * *p = 0,002 par Mann-Whitney U-test (recto-verso). Ce chiffre a été modifié à partir de [Sun, D. et al. méthode de réduction du bruit pour quantifier la dispersion de la lumière de nanoparticle dans les images de champ lointain microscopiques à faible grossissement. Chimie analytique. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

La traduction clinique de biomarqueurs dérivés d’exosome pour les cellules malades et malignes est entravée par l’absence de méthodes de quantification rapides et précises. Ce rapport décrit l’utilisation d’images de microscope à champ sombre à faible grossissement pour quantifier des sous-types spécifiques d’exosome dans des échantillons de sérum ou de plasma à petit volume.

Utilisation de la diffusion améliorée par Nanoplasmon et imagerie microscopique à faible grossissement pour quantifier les exosomes dérivés de tumeurs

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

La diffusion nanoplasmonique améliorée, ou nPES, est une alternative simple et non invasive à la biopsie chirurgicale qui peut sauter des étapes de purification exosome longues et laboriculaires, élargissant l’application de l’analyse exosome aux arrangements cliniques. Cet essai nPES est une procédure rapide pour analyser des biomarqueurs spécifiques sur la membrane externe des exosomes qui ne nécessite pas d’étapes distinctes d’isolement et de purification. Nous avons seulement besoin d’un très petit échantillon clinique pour cet essai.Par conséquent, cette méthode peut étendre l’utilisation du nPES à l’étude de modèles de souris génétiquement modifiés ou PDX. Il y a quelques étapes dans ce protocole qui peuvent sembler intimidantes. Cependant, avec quelques courses de pratique, tous ceux qui ont des compétences de base en laboratoire humide peuvent apprendre à effectuer avec succès nPES.Pour commencer la procédure, combinez 40 microlitres d’une suspension de nanorods d’or fonctionnalisés par NeutrAvidin avec 200 microlitres de solution saline froide et tamponnée de pH sept. Centrifuger le mélange à 8500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes, et enlever le surnatant. Répétez ce processus de lavage deux fois plus, puis résuspendez les nanorods dans 40 microlitres de PBS froid.Ensuite, ajoutez 150 microlitres de PBS froid et 10 microlitres d’une solution de 0,5 milligramme par millilitre des anticorps biotinylés appropriés à la suspension. Mélanger à quatre degrés Celsius pendant deux heures pour obtenir des nanorods d’or conjugués aux anticorps. Lavez les nanorods trois fois par centrifugation dans des portions de 200 microlitres de PBS froid à 6500 fois g à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes chacune.Par la suite, resuspendez les nanorods conjugués aux anticorps lavés dans 200 microlitres de PBS froid, et conservez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à 24 heures. Pour commencer à préparer la diapositive, diluer les anticorps de capture exosome désirés à 025 milligrammes par millilitre dans PBS. Pipette un microlitre de cette solution dans chaque puits d’une protéine A / G traitée diapositive soutenue avec du verre de qualité optique.Ensuite, transférez la lame dans une boîte humidifiante pour vous assurer que les puits ne se dessèchent pas pendant l’incubation. Incuber la glissade à 37 degrés Celsius pendant une heure pour immobiliser les anticorps de capture. Ensuite, aspirez la solution restante pour éliminer les anticorps non liés.Lavez les puits en ajoutant et en aspirant trois fois un microlitre de PBS. Ensuite, chargez rapidement chaque puits avec un microlitre de tampon de blocage à base de PBS, et incuber la glissière à 37 degrés Celsius pendant deux heures. Lors de l’exécution d’environ 15 échantillons, nous devons utiliser une pipette à canal unique pour charger le tampon bloquant sur 120 puits en moins de cinq minutes pour éviter l’évaporation de l’agent bloquant.Commencez à préparer une solution de nanorods d’or conjugués aux anticorps pendant le blocage des glissières. Environ 30 minutes avant la fin du blocage, décongelez rapidement des échantillons de plasma ou de sérum dans un bain d’eau à température ambiante. Vortex les échantillons décongelés pendant 30 secondes pour s’assurer que les suspensions sont homogènes.Ensuite, centrifugez les échantillons à 500 fois g pendant 15 minutes pour précipiter les agrégats de protéines et d’autres débris. Transférez des aliquots de 10 microlitres du supernatant sur des tubes frais et faites des dilutions en tête-à-tête avec PBS. Mélanger les échantillons dilués par vortex doux ou inversion le cas échéant.Lorsque le blocage des glissières est terminé, aspirez le tampon de blocage et lavez les puits trois fois avec des portions d’un microlitre de PBS. Chargez immédiatement les échantillons dans les puits avec un microlitre par puits et huit répliques par échantillon. Chargez les normes exosome dans les puits appropriés de la même manière.Incuber la lame de 12 à 18 heures au réfrigérateur à quatre degrés Celsius. Ensuite, aspirez les puits et lavez-les une fois avec un microlitre de PBS. Chargez un microlitre de la suspension nanorod or conjuguée aux anticorps dans chaque puits et incubez la glissière à 37 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, aspirer la suspension nanorod, et laver la lame en PBS complétée par 1% polysorbate 20 pendant 10 minutes à l’aide d’un mélangeur. Ensuite, aspirez les puits et lavez la lame dans de l’eau déionisée pendant 10 minutes sur un mélangeur rotatif. Retirer l’eau et laisser sécher à l’air libre dans une boîte de Pétri propre avant d’amener la lame au microscope à champ foncé.Installez un microscope inversé équipé d’un condenseur d’immersion d’huile en champ sombre, d’un objectif 4x et d’un stade motorisé. Connectez le microscope à un ordinateur via un appareil photo numérique et ouvrez le logiciel d’imagerie. Ensuite, placez la glissière de l’échantillon à l’envers sur l’étape du microscope, et appliquez une petite goutte d’huile d’immersion où la lentille du condenseur entre en contact avec la diapositive.Affichez la vue à travers le microscope dans le logiciel d’imagerie. Ajustez bien le temps d’exposition par rapport à une norme de concentration élevée pour vous assurer que l’image ne sera pas saturée. Ensuite, ouvrez l’outil pour la numérisation de grandes images, et réglez le grossissement objectif à 10x.Choisissez de fermer l’obturateur actif pendant le mouvement de la scène et d’attendre 20 millisecondes avant chaque capture. Réglez le chevauchement de couture à 20% et sélectionnez couture via le chemin optimal. Choisissez de créer une grande image à partir de l’analyse.Réglez la caméra pour qu’elle se concentre manuellement au début de l’analyse et activez la mise au point automatique étape par étape tous les 20 champs. Ensuite, choisissez de définir les limites gauche, droite, haut et bas pour le champ d’analyse cible, et de définir la zone de balayage en déplaçant l’étape du microscope à chacune des limites souhaitées. Ensuite, ajustez la mise au point, le condenseur et l’éclairage de la zone pour obtenir une image claire et bien éclairée.Nommez le fichier d’image à créer et démarrez l’analyse. Quand il se termine, ouvrez l’image et enregistrez-la à l’échelle 1/8. Ouvrez le logiciel d’analyse d’image.Ensuite, ouvrez le menu Plugins, cliquez sur DSM Scan, définissez le nombre de colonnes et de lignes, réglez le pourcentage de resize à 25, définissez le diamètre de la tache, en pixels, à 190 à 200, réglez la plage de diamètre à 32, et définissez le diamètre d’incrément, en pixels, à huit. Réglez les limites de DSM basses et élevées à zéro et 62, la distance adjacente à 100, et le biais de soustraction à zéro. Exécutez l’algorithme DSM et enregistrez les données qui en résultent.La technique d’analyse DSM a montré une bonne reproductibilité à travers des échantillons d’exosome PANC-1 dilués en série allant de 0,24 à 1,2 microgramme par microlitre. Une forte corrélation linéaire a été observée entre la réponse de dispersion des nanorods d’or et la concentration exosome de protéine. Une différence significative dans l’abondance des exosomes de sérum exprimant le biomarqueur cancer-associé EphA2 a été observée entre les patients présentant le cancer pancréatique et les patients en bonne santé.À partir de l’ajout d’un agent bloquant, il est essentiel d’obtenir un tuyautage rapide et précis pour éviter l’évaporation des échantillons, l’introduction d’une contamination croisée et le grattage de la surface de la glissière. Après cette procédure, nous effectuons une analyse statistique pour étudier toute corrélation entre l’expression du biomarqueur exosomal d’intérêt et le stade différent de la maladie qui est à l’étude. Après avoir établi cette technologie, et nous sommes en mesure de trouver des biomarqueurs exosomaux pour les cancers du pancréas à un stade précoce.À l’heure actuelle, nous étendons cette découverte à d’autres types de cancers et de maladies infectieuses. Habituellement, les échantillons manipulés dans ce test sont soit des échantillons de patients ou des échantillons d’exosome purifiés provenant de lignées de cellules cancéreuses, ce qui nécessite une formation spéciale en matière de sécurité.

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