Name: Isolement des cellules régénératives dérivées adipeuses pour le traitement de la dysfonction érectile après une prostatectomie radicale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Découvrez l'isolement des cellules régénératives dérivées adipeuses pour traiter la dysfonction érectile après prostatectomie radicale. Cette méthode standardisée combine liposuccion, digestion enzymatique et centrifugation pour isoler les ADRCs.

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Ce travail a été fondé par l’hôpital universitaire d’Odense (11/31936), le Centre danois de médecine régénérative (14/50427) et la Société danoise du cancer.

Toutes les méthodes décrites dans le protocole ont été approuvées par le Comité national d’éthique danois (n° 37054), l’Autorité danoise de la santé et des médicaments (numéro EUDRA-CT 2013-004220-11) et l’Agence danoise de protection des données (2008-58-0035). L’étude a été enregistrée à ClinicalTrials.gov (NCT02240823). L’étude a été réalisée conformément à la Déclaration d’Helsinki surveillée par l’unité des bonnes pratiques cliniques (BPC) de l’hôpital universitaire d’Odense. La préparation de l’ADRC a été effectuée dans un établissement de tissus agréé pour la manipulation de tissus et de cellules humains à l’hôpital universitaire d’Odense (Autorité danoise de la santé et des médicaments, autorisation n° 29035).
1. Recrutement des patients/participants
<ol><li>Pour participer à l’essai, recrutez des patients qui remplissent les critères d’inclusion suivants.<ol>
<li>Recruter des patients âgés de plus de 18 ans, sexuellement actifs avant la RP et non infectés par les maladies sexuellement transmissibles, par exemple l’infection par le virus de l’immunodéficience humaine, la syphilis ou l’hépatite.</li>
		<li>Assurez-vous qu’ils souffrent de dysfonction érectile après une RP qui a été effectuée en raison d’un cancer de la prostate. REMARQUE: Dans cette étude, les patients ont été inclus dans l’étude 5 à 18 mois après la RP et ont été inclus quelle que soit la méthode chirurgicale: ouvert / assisté par robot ou nettoyage nerveux / non nerveux.</li>
		<li>S’assurer que la valeur de l’antigène prostatique spécifique (APS) devait être indétectable lors du suivi clinique après la RP.</li>
		<li>Assurez-vous que les patients étaient sexuellement actifs avant la RP et qu’ils exprimaient toujours le souhait de rester sexuellement actifs après la RP. S’assurer qu’une intervention pharmacologique avec un inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (inhibiteur de la PDE5 ) ou un analogue synthétique de la prostaglandine E1 (PGE1) a été essayée avant de participer et jugée insuffisante.</li>
		<li>De plus, assurez-vous que les patients ont suffisamment de graisse sous-cutanée sur l’abdomen ou la cuisse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Exclure les patients de l’essai, s’il y a eu des événements graves sous anesthésie pendant la RP ou s’ils ont été traités avec des anticoagulants.</li>
</ol>2. Liposuccion
REMARQUE: La liposuccion est une opération qui élimine la graisse ou les lipocytes de la région sous-cutanée. Cette partie du protocole est réalisée en tant que liposuccion standard et la procédure est effectuée dans des conditions stériles dans une salle d’opération. Tous les instruments utilisés dans le cadre de la procédure doivent être stériles et le chirurgien doit porter des gommages, une blouse chirurgicale stérile, des gants stériles, un masque chirurgical et un chapeau.
<ol><li>Anesthésier le patient.<ol>
<li>Assurez-vous que le patient est sous anesthésie générale pendant la procédure et que cette partie est effectuée par un anesthésiste.</li>
		<li>Désinfecter la peau de l’abdomen et du scrotum avec de la chlorhexidine à 0,5 % (alcool de clorhexidine, digluconate de chlorhexidine médicamenteux à 96 % à l’éthanol 77 % W/W = 83 % v/v). Utilisez un marqueur chirurgical pour dessiner les zones de l’abdomen où la liposuccion va être effectuée. La zone sera généralement la zone entre la symphyse et l’ombilic.</li>
	</ol></li>
	<li>Faites deux incisions de 6 mm de large dans la peau de l’abdomen avec un scalpel (numéro 11). Placez les incisions symétriquement et latéralement à partir de la zone de liposuccion vers le haut.<ol>
<li>Mettez un peu de lubrifiant tel que de la vaseline sur les incisions, pour vous assurer que la canule d’infiltration glisse facilement dans et hors des incisions pendant la liposuccion.</li>
	</ol></li>
	<li>Introduisez une canule d’infiltration de taille 14 G à travers les incisions de la peau. Injecter la solution de Kleins modifiée par voie sous-cutanée dans les zones marquées parallèles à la surface de la peau. Injectez une telle quantité de la solution que le tissu ciblé devient enflé et ferme, ou tumescent. REMARQUE: La solution de Kleins modifiée se compose d’une solution de 1 000 mL de lactate de Ringers et de 1 mg d’adrénaline (épinéphrine (1:1 000 000)). Ne pas faire d’anesthésie locale à la solution, car cela pourrait avoir un impact négatif sur les ADRC.<ol>
<li>Injecter un volume de solution de Kleins modifiée qui correspond au rapport 1:1 au tissu adipeux.</li>
		<li>Attendez 10 minutes pour maximiser l’effet de l’adrénaline et réduire la quantité de sang dans le tissu adipeux récolté.</li>
	</ol></li>
	<li>Effectuer une liposuccion standard à l’aide d’une liposuccion par perfusion à jet pour prélever 200 à 300 mL de tissu adipeux. Utilisez des canules émoussées creuses, auxquelles un tube de perfusion et une buse sont intégrés. Fixez la canule à un dispositif d’aspiration pour la liposuccion. REMARQUE: Une infusion d’eau continue en forme d’éventail desserre le tissu adipeux en fragments qui peuvent être facilement aspirés par l’ouverture de la canule.<ol>
<li>Introduire une seringue de 3 mm avec une pointe émoussée à travers les incisions sur l’abdomen</li>
	</ol></li>
	<li>Recueillir le tissu adipeux dans un lipo-collecteur pour préserver le lipoaspirat dans un environnement stérile. La lipoaspirat commencera à se séparer de la phase aqueuse.</li>
	<li>Utilisez des seringues stériles de 50 mL pour aspirer le lipoaspirat du lipo-collecteur.<ol>
<li>Minimisez le volume d’eau aspiré dans les seringues et vissez un bouchon sur l’extrémité des seringues pour garder le tissu adipeux stérile.</li>
	</ol></li>
	<li>Placez les seringues avec la pointe vers le bas dans un sac en plastique stérile pour commencer la séparation de la lipoaspirat de la phase aqueuse. Placez le sac dans un récipient stérile encore avec les extrémités orientées vers le bas pour continuer la séparation.<ol>
<li>Couvrez le conteneur avec un drap stérile pour sécuriser l’environnement stérile pendant le transport. REMARQUE: Selon le manuel d’utilisation de la machine utilisée pour l’isolation, le lipoaspirat peut être stocké jusqu’à un maximum de 4 heures avant l’isolement des ADRC, cependant, nous le traitons toujours immédiatement.</li>
	</ol></li>
	<li>Fermez les incisions cutanées avec le matériau de suture préféré des chirurgiens. Placez un vêtement de compression, un liant abdominal, autour de l’abdomen pour réduire l’œdème postopératoire.</li>
	<li>Faire un bloc pénien en injectant 20 mL de bupivacaïne 5 mg/mL contenant 5 μg d’adrénaline.<ol>
<li>Utilisez une seringue de 20 mL et appliquez avec une aiguille de 23 G, de 1 1/4 pouce de long.</li>
		<li>Appliquer 5 mL de bupivacaïne dans chaque quadrant de la sous-cutis.</li>
		<li>Injecter la bupivacaïne à deux sites, l’un placé ventralement et l’autre dorsalement. Introduire l’aiguille sur toute sa longueur dans le tissu sous-cutané en pointant l’aiguille latéralement vers la droite et injecter l’anesthésie au fur et à mesure que l’aiguille est rétractée. Répétez l’injection en pointant l’aiguille vers la gauche. REMARQUE: Le patient peut maintenant être réveillé de l’anesthésie générale par l’anesthésiste.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Isolement des ADRC
REMARQUE: Le processus d’isolement des ADRC est effectué comme décrit en détail dans le manuel d’utilisation suivant l’appareil (voir le tableau des matériaux). Il est important que la procédure soit effectuée dans des conditions stériles pour s’assurer que la lipoaspirat n’est exposée à aucun contaminant lors de la purification des ADRC. Le temps nécessaire à l’isolement des ADRC dépend du volume de lipoaspirat, mais l’ensemble de la procédure prendra environ 2,5 heures à l’aide du dispositif semi-automatique décrit ici.
<ol><li>Placez tous les consommables et enzymes de manière aseptique sur une table recouverte d’une serviette chirurgicale jetable stérile. REMARQUE: Un kit de procédure contient tous les consommables et enzymes nécessaires à l’isolement des ADRC d’un patient. En outre, trois poches de perfusion d’un litre de Ringers lactées de 37 à 39 ° C doivent être disponibles avec des vêtements stériles, des gants et des serviettes et de l’éthanol pour la désinfection. Notez tous les nombres de lots de consommables et d’enzymes ainsi que la température des sonneurs lactés, lorsqu’ils sont connectés au système.<ol>
<li>Essuyez l’appareil avec de l’éthanol et suivez les instructions du fabricant</li>
		<li>Chargez l’ensemble consommable sur l’appareil et connectez un sac de sonneries lactées au système.</li>
		<li>Effectuez la série de tests semi-automatiques (vérification du système et test d’étanchéité) avant d’ajouter le lipoaspirat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Laissez le lipoaspirate reposer dans des tubes de 50 mL pendant que les étapes en 3.1 sont effectuées. Cela permettra à la graisse de se séparer de la phase liquide. Notez la quantité totale (en mL) de tissu adipeux et utilisez-la pour vous assurer que la quantité de graisse chargée sera dans la plage de la capacité de l’appareil.</li>
	<li>Chargez le tissu lorsque l’appareil vous y invite. La machine va maintenant drainer l’excès de liquide et peser la quantité de tissu adipeux chargée avant qu’elle ne soit lavée avec des sonneurs lactés.<ol>
<li>Lorsque le tissu a été lavé et égoutté à nouveau, connectez une nouvelle poche de perfusion avec des sonneurs lactés à 37-39 °C à la demande de la machine.</li>
		<li>Reconstituer l’enzyme disponible dans le commerce contenant du mélange de collagénase et de protéase dans 5 mL de Ringers lactés (un flacon d’enzyme suffit pour des quantités de graisse allant jusqu’à 270 mL).</li>
		<li>Assurez-vous que l’appareil affiche la quantité d’enzyme (en fonction du poids du tissu) à injecter dans le bidon avec le tissu adipeux. Une fois injecté, la digestion enzymatique qui est effectuée sous agitation durera environ 20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Après la digestion des tissus, laissez l’agitateur s’arrêter et vérifiez que le contenu est séparé en deux phases: une phase jaune contenant des lipides supérieurs et une couche rose inférieure contenant les ADRC. Laissez cette dernière couche s’écouler dans la chambre de traitement cellulaire (qui va dans la centrifugeuse intégrée de l’appareil) de l’ensemble consommable, tout en laissant la couche lipidique derrière.</li>
	<li>Laissez les ADRC se concentrer dans la chambre de traitement cellulaire pendant plusieurs cycles de centrifugation. Ajoutez maintenant 10 mL d’Intravase (contient de la DNase, qui permet d’éviter l’agglutination dans la suspension adrc finale) reconstituée dans des sonneurs lactés. La réaction enzymatique dure 10 min après quoi les ADRC sont lavés. REMARQUE: Cette étape est entièrement automatique et la machine vous informera lorsque le processus est terminé.</li>
	<li>Lorsque l’isolement des ADRC est terminé, remettez en suspension les cellules dans 5 mL de lactate de Ringer. Aspirer la solution dans une seringue de 5 mL.</li>
	<li>Montez un verrou Luer femelle à 3 voies sur la seringue de 5 mL contenant les ADRC et aspirez 4 mL d’ADRC dans une autre seringue stérile de 5 mL.</li>
	<li>Transférer les 1 derniers mL dans une seringue de 1 mL. Utilisez ce 1 mL pour la caractérisation des ADRC, par exemple, le nombre de cellules, la viabilité cellulaire, l’analyse des marqueurs de surface par cytométrie en flux et la capacité de différenciation adrc.</li>
	<li>Mettez une aiguille de 25 G sur la seringue de 5 mL contenant les 4 mL d’ADRC avant qu’elle ne soit emballée dans un drap stérile. Utilisez les ADRC pour injection dans le receveur. Dans ce cas, la solution d’ADRC contiendra en moyenne 8,4 à 32,7 millions de cellules.</li>
</ol>4. Implantation des ADRC dans les corps caverneux
REMARQUE: Il s’agit d’une procédure stérile. Tous les instruments doivent être stériles et la personne qui injecte la solution contenant les cellules souches dans les corps caverneux doit porter des gants stériles. Le patient est éveillé pendant cette procédure et recevra ses propres cellules souches. Les ADRC sont injectés sans compter les cellules avant l’injection.
<ol><li>Gardez la solution d’ADRC homogène en inclinant doucement la seringue jusqu’à ce qu’elle soit injectée dans les corps caverneux.</li>
	<li>Placez un drapé d’ouverture sur le pénis. Placez un garrot à la racine du pénis en utilisant une boucle de vaisseau en silicone. Serrez la boucle et fixez-la avec des pinces incurvées pean. Faites le garrot assez serré pour arrêter le flux sanguin du pénis.</li>
	<li>Utilisez deux échanges antiseptiques pour désinfecter la peau du pénis au site d’injection (site latéral des corps caverneux). Injecter 1 mL de la solution contenant des ADRC, dans un angle direct dans les corps caverneux du côté droit à deux endroits différents, répéter cette étape ensuite dans le corps caverneux gauche. Le volume total des ADRC injectés est de 4 mL.</li>
	<li>Attendez 30 min, puis retirez le garrot.</li>
	<li>Libérer le patient après 2 h d’observation après l’injection d’ADRC, pour s’assurer que le patient est bien rétabli après l’anesthésie.</li>
</ol>5. Soins postopératoires
<ol><li>Recommandez au patient de ne pas faire de performance physique qui peut augmenter la pression artérielle au cours de la première semaine, pour prévenir le développement d’hématomes.</li>
	<li>Recommandez au patient de porter le liant abdominal pendant 24 heures les 14 premiers jours après la chirurgie et ensuite pendant 14 jours pendant la journée.</li>
	<li>Traiter la douleur postchirurgicale avec de l’acétaminophène par voie orale (p. ex., paracétamol; 1 000 mg, 4 fois par jour) et des anti-inflammatoires oraux (p. ex. ibuprofène; 400 mg 3 fois par jour).</li>
</ol>

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</ol>

L’auteur Søren P. Sheikh est PDG de Blue Cell Therapeutics, Copenhague, Danemark.

La procédure présentée pour isoler les ADRC ne se limite pas à être utilisée uniquement pour le traitement de la dysfonction érectile, mais peut être utilisée dans de multiples autres formes de traitement et d’expériences. Notre essai a montré que les ADRC autologues fraîchement isolés sont sûrs à utiliser, et le traitement est bien tolérable dans un suivi de 12 mois.
Avant d’utiliser la procédure, il y a quelques considérations à prendre en compte. Un inconvénient de cette procédure est que le patient doit être sous anesthésie générale pendant la liposuccion. La liposuccion est possible sous anesthésie locale, mais un essai précédent a montré qu’une combinaison d’anesthésiques locaux et d’adrénaline peut avoir un impact négatif sur la croissance cellulaire des fibroblastes20. Le risque d’être sous anesthésie générale est généralement faible, mais un résultat négatif est toujours observé. Ce risque doit être pris en compte lorsque les patients sont sélectionnés pour le traitement. La liposuccion est une intervention chirurgicale et, par conséquent, comportera toujours un risque de complications. Comme pour toutes les autres interventions chirurgicales, il existe un risque de saignement postopératoire entraînant la formation d’hématomes et un risque d’infection. Certains de nos patients ont également signalé une sensibilité transitoire réduite de la peau abdominale. Une complication immédiate de la liposuccion est le saignement. On sait que les patients risquent de contracter des complications systémiques lorsque de grandes quantités de tissu sont enlevées. La liposuccion dans cette procédure était relativement petite et n’était donc pas considérée comme un facteur de risque.
Les complications de l’injection de cellules sont rapportées comme une rougeur transitoire, une sensibilité et des hématomes.
Le dispositif utilisé pour l’isolation des ADRC, a été choisi parce que le système est homologué CE. Au Danemark, il est obligatoire d’utiliser un équipement approuvé CE parce que les autorités classent le traitement avec des cellules souches comme un essai de dépistage de drogue, lorsque l’ADRC est utilisé pour l’injection chez l’homme.
L’appareil présente des avantages tels que l’ensemble de la procédure étant normalisé et exécuté dans un environnement stérile fermé sans nécessiter un laboratoire hautement classifié. Le risque de contamination est donc réduit. Cela garantit que la procédure est uniforme et reproductible, et que la qualité du produit final est toujours la même à chaque fois (cependant, cela dépend également de la qualité du tissu d’entrée). Effectuer l’isolation sur l’appareil est facile et ne nécessite pas d’opérateurs spécialement formés.
Une limitation de l’appareil est que l’entrée minimale dans la machine est de 100 g de lipoaspirat drainé. Comme la liposuccion est complètement terminée avant le début du traitement cellulaire (et dans notre cas, à un endroit différent, pas dans la salle d’opération) selon notre expérience, cela nécessitera que la quantité de lipoaspirat soit d’au moins 125 mL en utilisant la mesure approximative des seringues de 50 mL. Sinon, il y a un risque qu’il n’y ait pas assez de matériel pour que la machine puisse continuer. En outre, l’utilisation de la limite supérieure (l’entrée maximale est de 425 mL) entraînerait une très longue procédure d’isolement.
Les cellules souches adultes du tissu adipeux et de la moelle osseuse semblent avoir une capacité d’auto-renouvellement et de différenciation comme les cellules souches embryonnaires. L’un des avantages des ADRC par rapport aux cellules souches hémopoïétiques est un rendement 100 à 500 fois plus élevé par volume tissulaire par rapport à la moelle osseuse21,22, et, par conséquent, les ADRC n’ont pas besoin d’être cultivés. De plus, les cellules souches hémopoïétiques sont plus difficiles et plus douloureuses à prélever sur le patient que le tissu adipeux. Dans de nombreuses situations, le tissu adipeux n’est qu’un déchet après la chirurgie. Il est possible de cultiver des cellules souches pour donner un rendement plus élevé adapté à l’angiogenèse, mais les ADRC fraîchement isolés peuvent avoir un potentiel angiogénique plus élevé quele 23 cultivé.

Les cellules souches ont la capacité de se différencier en différents types de cellules, et elles sécrètent des facteurs paracrines qui sont censés favoriser le processus de guérison dans les tissus endommagés 1,2,3,4. Ils sont donc attrayants dans le domaine de la médecine régénérative, car ils peuvent représenter un traitement curatif possible.
La prostatectomie radicale (RP) est le traitement curatif doré pour les patients atteints d’un cancer de la prostate localisé à risque faible / intermédiaire et d’une espérance de vie > 10 ans. Le but de la chirurgie est l’éradication du cancer, mais elle a plusieurs effets secondaires. La prévalence de l’incontinence post-prostatectomie varie de 2 à 60% et la dysfonction érectile (DE) est ressentie par 20 à 90% des patients5. La technique d’épargne nerveuse est une option chez certains patients (score de Gleason < 7, faible risque de maladie extracapsulaire)5. Cette technique épargne les nerfs responsables de l’érection, mais même si cela est possible, de nombreux patients signalent encore une dysfonction érectile postopératoire.
Les options de traitement pour la rééducation du pénis après RP consistent principalement en un traitement avec des inhibiteurs de la PDE-5, une thérapie par injection ou instillation et des pompes à vide. Les médicaments utilisés pour la rééducation du pénis diffèrent pharmacologiquement, mais leur mécanisme d’action comprend la relaxation des cellules musculaires lisses dans le corps caverneux. Cependant, de nombreux patients connaissent un échec de traitement et n’obtiennent jamais un effet du médicament qui permet les rapports sexuels6.
On pense que la dysfonction érectile qui se produit après la RP est due à des changements structurellement irréversibles7. Ces changements se produisent dans le tissu caverneux et comprennent l’apoptose des cellules musculaires lisses et endothéliales et la fibrose. Le mécanisme veino-occlusif qui est responsable d’une partie centrale de l’érection, est altéré par les changements, ce qui entraîne un remplissage et une dureté plus faibles du pénis7.
De nombreux patients rapportent que la dysfonction érectile qu’ils subissent a un impact négatif sur leur qualité de vie8. Ils ne sont pas prêts à abandonner leur activité sexuelle après la chirurgie et, par conséquent, une thérapie curative pour la dysfonction érectile est attrayante, lorsque les autres traitements disponibles pour la rééducation du pénis échouent.
Dans des essais antérieurs, y compris des essais sur des animaux et des essais de phase 1 sur des humains, les cellules souches ont montré des résultats prometteurs en tant que traitement alternatif de la dysfonction érectile 2,9,10,11,12. Les résultats montrent qu’il est sûr d’utiliser des ADRC et que la fonction érectile est significativement améliorée après une seule injection dans le corps caverneux 2,9,10,11,12. On pense que les cellules régénératives dérivées des adipeux (ADRC) soutiennent la régénération tissulaire par des mécanismes paracrines grâce à la libération de multiples hormones, de facteurs de croissance neurotrophiques et autres, de cytokines et éventuellement de micro-ARN13. En outre, les ADRC sont capables de se différencier en plusieurs types de cellules matures, y compris les cellules musculaires endothéliales et vasculaires, les cellules cartilagineuses, les ostéocytes et les neurones14,15. Ces propriétés rendent les cellules souches intéressantes pour le développement d’un nouveau traitement permanent contre la dysfonction érectile.
Les cellules souches sont divisées en plusieurs groupes, essentiellement ceux dérivés de l’embryon précoce (cellules souches embryonnaires) et ceux du tissu adulte (cellules souches adultes). Les cellules souches adultes comprennent les cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont multipotentes et peuvent être trouvées dans la moelle osseuse, le tissu adipeux, le sang de cordon ombilical, le placenta et la pulpe dentaire17.
Les cellules souches du tissu adipeux sont faciles d’accès, contrairement aux cellules souches dérivées de la moelle osseuse. Le prélèvement de cellules souches dans la moelle osseuse est une procédure risquée et douloureuse par rapport à la liposuccion. Le nombre de cellules possibles à prélever dans la moelle osseuse sera limité, tandis que seuls les dépôts de tissu adipeux du patient fixent la limite du nombre de cellules pouvant être récoltées. Il est donc possible d’isoler une grande quantité de cellules souches du tissu adipeux sans qu’il soit nécessaire de cultiver les cellules pour obtenir une quantité satisfaisante. Les cellules régénératives dérivées des adipeux, également appelées fraction vasculaire stromale (VSF), sont composées de nombreux types de cellules, y compris les CSM, les cellules endothéliales, les péricytes, les cellules immunitaires et les progéniteursdont 18. Ceux-ci peuvent tous jouer un rôle dans le processus de régénération.
L’objectif de la présente étude est d’étudier l’effet des cellules souches sur la dysfonction érectile après RP en utilisant 4 mL d’ADRC autologues isolés du tissu adipeux fraîchement récolté après injection dans les corps caverneux.

<table><tbody><tr><td><forte>liposuccion</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Ceinture abdominale</td><td>Dale</td><td></td><td>Taille dépendant du patient</td></tr><tr><td>Serviette OP-adhérente</td><td>M&ouml ; lnlycke Soins de santé</td><td>906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Adrénaline 1 mg/ml</td><td>Amgros I/s</td><td>74 44 23</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Fournitures OP de base</td><td>M&ouml ; lnlycke Health Care</td><td>97010873-07</td><td></td></tr><tr><td>Lame en acier au carbone 11</td><td>Swann-Morton</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chlorhixidine Ethanol</td><td>Faarborg Pharma</td><td>5 % coloré</td><td></td></tr><tr><td>Set jetable Lipocollector 3</td><td>Human Med</td><td>670200</td><td></td></tr><tr><td>Tuyaux d’extension</td><td>Extrudan</td><td></td><td>5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M de long</td></tr><tr><td>Gaze Rags</td><td>Barrier</td><td>175201</td><td>30x45 cm</td></tr><tr><td>Jelonet</td><td>Smith and Nephew Medical Ltd</td><td>90509225</td><td>10 x 10 cm</td></tr><tr><td>Marcaine 5 mg/ml + Adrénaline 5 micrigramme</td><td>Astra Zeneca</td><td></td><td>20 mL</td></tr><tr><td>Mesorb</td><td>Bandage M&ouml ; lnlycke Health Care</td><td>677001</td><td>10x13 cm</td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td>18 G + 23 G</td></tr><tr><td>Suture monocryl</td><td>Ethicon</td><td></td><td>04:00</td></tr><tr><td>Ringer-lactat</td><td>Fresinus Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gants stériles</td><td>Gammex</td><td>330052065</td><td></td></tr><tr><td>Blouse chirurgicale</td><td>M&ouml ; lnlycke Health Care</td><td>690103-01</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur chirurgical</td><td>Richard-Allan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Masque chirurgical</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Codan Medical</td><td>6,28,402</td><td>50/60 ml embout de cathétérisme</td></tr><tr><td></td><td>Seringue Becton Dickinson</td><td>700016181</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>WAL- Applikator pour canules 25/30 cm</td><td>Human Med</td><td>REF 500001</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fort>Isolement des ADRC</FORT></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml Seringue</td><td>Becton Dickinson</td><td>REF 303172</td><td></td></tr><tr><td>robinet d’arrêt 3 voies</td><td>One Med</td><td>REF 10554-01</td><td></td></tr><tr><td>Serviette OP-adhésive</td><td>M&ouml ; lnlycke Health Care AB</td><td>REF 906677</td><td>90x75 cm</td></tr><tr><td>Cytori Celution 800IV appareil</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Désinfection swaps</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Microlance</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>25G (0,5*25 mm)</td></tr><tr><td>Nitril Gants</td><td>Abena</td><td></td><td>Sans poudre</td></tr><tr><td>OU drapé Feuille, 2 couches</td><td>Lohmann & Rauscher</td><td>REF 33005</td><td></td></tr><tr><td>Ringers Lactate</td><td>Fresinus Kabi</td><td>06756 (DK)</td><td></td></tr><tr><td>Gants</td><td></td><td></td><td></td>stériles</tr><tr><td>Blouse</td><td></td><td></td><td></td>stérile</tr><tr><td>Kit supplémentaire pour Cytori Celution 800IV devise</td><td>Cytori</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Termometer</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>traçable</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Injection of ADRC’s</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aperture drape</td><td>One Med</td><td>REF1565-01</td><td>75*90 cm</td></tr><tr><td>Desinfection swap</td><td>Mediq Danmark</td><td>3340010</td><td></td></tr><tr><td>Pean</td><td>Leibinger</td><td>32-01257</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Vessel Loop</td><td>Purple Surgical</td><td>REF PS3203</td><td></td></tr><tr><td>Gants</td> <td>stérilesSempermed</td><td></td><td>Ou utilisez votre favori</td></tr></tbody></table>

isolement des cellules régénératives dérivées adipeuses pour le traitement de la dysfonction érectile après une prostatectomie radicale

Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

Les cellules souches sont utilisées dans de nombreux domaines de recherche en médecine régénérative, en partie parce que ces traitements peuvent être curatifs plutôt que symptomatiques. Les cellules souches peuvent être obtenues à partir de différents tissus et plusieurs méthodes d’isolement ont été décrites. La méthode présentée pour l’isolement des cellules régénératives dérivées de l’adipeuse (ADRC) peut être utilisée dans de nombreux domaines thérapeutiques car la méthode est une procédure générale et, par conséquent, ne se limite pas au traitement de la dysfonction érectile (DE). La dysfonction érectile est un effet secondaire fréquent et grave de la prostatectomie radicale (RP), car la dysfonction érectile n’est souvent pas bien traitée avec un traitement conventionnel. L’utilisation des ADRC comme traitement de la dysfonction érectile a suscité un grand intérêt en raison des premiers résultats positifs après une seule injection de cellules dans le corps caverneux. La méthode utilisée pour l’isolement des ADRC est un processus simple et automatisé, reproductible et garantissant un produit uniforme. De plus, la stérilité du produit isolé est assurée car l’ensemble du processus se déroule dans un système fermé. Il est important de minimiser le risque de contamination et d’infection puisque les cellules souches sont utilisées pour l’injection chez l’homme. L’ensemble de la procédure peut être effectué dans les 2,5 à 3,5 heures et ne nécessite pas de laboratoire classé, ce qui élimine le besoin d’expédier des tissus hors site. Cependant, la procédure présente certaines limites puisque la quantité minimale de lipoaspirat drainé pour que le dispositif d’isolement fonctionne est de 100 g.

La procédure présentée a été utilisée pour un essai clinique ouvert de phase 1 portant sur 21 patients19. Le critère d’évaluation principal de l’essai était l’innocuité de l’utilisation des ADRC chez l’homme et le critère d’évaluation secondaire était l’effet des ADRC sur la fonction érectile.
Vingt et un hommes ont été inclus dans l’essai avec un âge moyen de 60 ans (intervalle 46-69) et une érection normale et une vie sexuelle active avant la RP en raison d’un cancer de la prostate. Ils ont tous souffert de dysfonction érectile après la RP, sans aucun signe de guérison des médicaments disponibles pour la rééducation du pénis. Six hommes souffraient d’incontinence comme effet secondaire de la RP. Tous les hommes ont reçu une seule injection intracaverneuse d’ADRC isolée avec la méthode présentée.
Les 21 hommes ont été suivis de 4 visites à la clinique externe 1, 3, 6 et 12 mois après l’injection. La fonction sexuelle a été évaluée à l’aide de questionnaires validés – l’indice international de la fonction érectile-5 (IIEF-5) et le score de dureté de l’érection (EHS) (joints en annexe).
Aucun événement grave ne s’est produit au cours de l’observation. Huit hommes ont signalé une rougeur transitoire et un gonflement aux sites d’injection, trois ont signalé une réaction dans la région du pénis. Huit événements mineurs réversibles liés à la liposuccion ont été rapportés, tels qu’une légère gêne abdominale et des hématomes abdominaux mineurs. Aucun patient n’a signalé d’inconfort au suivi de 1 mois. Huit sur quinze (53%) dans le groupe continent ont déclaré que la fonction érectile était suffisante pour les rapports sexuels à 12 mois. Le groupe de 6 hommes incontinents n’a montré aucune amélioration de la fonction érectile.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Continent</td>
			<td>Incontinent</td>
		</tr>
<tr>
<td>Patients inclus</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Effet significatif</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Le tableau montre les différences d’effet significatif du traitement entre les patients continentaux et incontinents.

La divulgation précise des méthodes et des protocoles est cruciale pour l’adoption à grande échelle des thérapies à base de cellules souches. Ici, nous présentons un protocole pour isoler les cellules régénératives dérivées de l’adipose, utilisées pour une seule injection intracaverneuse comme traitement de la dysfonction érectile (DE) après une prostatectomie radicale (RP).

Isolement des cellules régénératives dérivées adipeuses pour le traitement de la dysfonction érectile après une prostatectomie radicale

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

Cette technique d’isolement peut être utilisée pour explorer si les cellules souches adipeuses peuvent aider les patients à régénérer la fonction érectile après une prostatectomie radicale. Cette méthode n’est pas limitée pour une maladie spécifique. Il pourrait être utilisé dans tous les domaines de la recherche sur les cellules souches adipeuses.Les cellules souches isolées sont utilisées pour traiter la dysfonction érectile, mais la technique d’isolement est une procédure générale et les cellules souches peuvent être utiles dans d’autres domaines de la recherche sur les cellules souches. Commencez par désinfecter la peau de l’abdomen et du scrotum avec 0,5% de chlorhexidine. Utilisez un marqueur chirurgical pour dessiner les zones de l’abdomen où la liposuccion va être effectuée, généralement la zone située entre la synthèse et l’ombilic.Faites deux incisions de six millimètres de large dans la peau de l’abdomen avec un scalpel numéro 11. Placez les incisions symétriquement et latéralement à partir de la zone de liposuccion. Placez un peu de lubrifiant sur les incisions pour vous assurer que la canule d’infiltration glisse facilement dans et hors des incisions pendant la liposuccion.Introduisez ensuite une canule d’infiltration de calibre 14 à travers les incisions de la peau. Injecter la solution de Klein modifiée par voie sous-cutanée dans les zones marquées parallèles à la surface de la peau jusqu’à ce que le tissu ciblé devienne enflé et ferme ou tumescent. Injecter un volume de solution de Klein modifiée dans un rapport de un pour un au tissu adipeux.Attendez 10 minutes pour maximiser les effets de l’adrénaline et réduire la quantité de sang dans le tissu adipeux récolté. Effectuer une liposuccion par perfusion à jet standard pour récolter 200 à 300 millimètres de tissu adipeux. Utilisez des canules émoussées qui sont creuses avec un tube de perfusion et une buse intégrés.Fixez la canule à un dispositif d’aspiration pour la liposuccion. Introduisez une seringue de trois millimètres avec une pointe émoussée à travers les incisions sur l’abdomen et collectez le tissu adipeux dans le Lipo Collector pour préserver la lipoaspirat dans un environnement stérile. La lipoaspirat commencera à se séparer de la phase aqueuse.Utilisez des seringues stériles de 50 millilitres pour aspirer le lipoaspirat du LipoCollector, minimisant ainsi le volume d’eau aspiré dans les seringues. Vissez un bouchon sur l’extrémité des seringues pour garder le tissu adipeux stérile. Placez les seringues avec la pointe vers le bas dans un sac en plastique stérile pour commencer la séparation de la lipoaspirat de la phase aqueuse.Ensuite, placez le sac dans un récipient stérile. Couvrez le conteneur avec un drap stérile pour sécuriser l’environnement stérile pendant le transport. Fermez les incisions cutanées avec le matériau de suture préféré du chirurgien.Placez un vêtement de compression autour de l’abdomen pour réduire l’œdème postopératoire. Pour faire un bloc pénien, injectez la bupivacaïne à deux sites, l’un placé ventralement et l’autre dorsalement. Introduisez l’aiguille entière dans le tissu sous-cutané, en la pointant latéralement vers la droite, et injectez l’anesthésie lorsque l’aiguille est rétractée.Répétez l’injection en pointant l’aiguille vers la gauche. Placez tous les consommables et enzymes de manière aseptique sur la table recouverte d’une serviette chirurgicale jetable stérile. Essuyez l’appareil avec de l’éthanol et chargez l’ensemble de consommables.Ensuite, connectez un sac de sonneries lactées au système. Effectuez la série de tests semi-automatiques avant d’ajouter le lipoaspirate. Pendant la préparation de l’appareil, laissez le lipoaspirat reposer dans un tube de 50 millilitres pour permettre à la graisse de se séparer de la phase liquide.Notez la quantité totale de tissu adipeux et utilisez-la pour vous assurer que la quantité totale de graisse chargée sera dans la plage de la capacité de l’appareil. Chargez le tissu lorsque l’appareil vous y invite. La machine drainera l’excès de liquide.Pesez la quantité de tissu adipeux et lavez-la avec des sonneurs lactés. Lorsque le tissu a été lavé et drainé, branchez une nouvelle poche de perfusion avec des sonneurs lactés de 37 à 39 degrés Celsius. Reconstituer l’enzyme disponible dans le commerce contenant du mélange de collagénase et de protéase dans des anneaux lactés de cinq millilitres.Assurez-vous que l’appareil affiche la quantité d’enzyme à injecter dans le bidon avec le tissu adipeux. Une fois injecté, la digestion enzymatique durera environ 20 minutes. Après la digestion des tissus, vérifiez que le contenu est séparé en un lipide supérieur contenant une phase jaune et une couche rose inférieure contenant les cellules régénératives dérivées adipeuses, ou ADRC.Laissez la couche rose s’écouler dans la chambre de traitement cellulaire de l’ensemble consommable, en laissant la couche lipidique derrière. Permettre aux ADRC de se concentrer dans la chambre de traitement cellulaire pendant plusieurs cycles de centrifugation. Ajoutez ensuite 10 millilitres d’intrabase reconstitués dans les anneaux lactés.La réaction enzymatique dure 10 minutes et les ADRC sont lavés par la suite. Une fois l’isolement des ADRC terminé, remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de lactate de Ringer et aspirez la solution dans une seringue de cinq millilitres. Montez un verrou Luer femelle à trois voies sur la seringue et aspirez quatre millilitres d’ADRC dans une autre seringue stérile de cinq millilitres.Transférer le dernier millilitre d’ADRC dans une seringue d’un millilitre. Utilisez cette aliquote pour les analyses de caractérisation de l’ADRC, telles que le nombre de cellules, la viabilité cellulaire, l’analyse des marqueurs de surface par cytométrie en flux et la capacité de différenciation de l’ADRC. Placez une aiguille de calibre 25 sur la seringue de cinq millilitres contenant les quatre millilitres d’ADRC.Ensuite, emballez-le dans un drap stérile. Cette solution d’ADRC sera injectée dans le receveur et devrait contenir en moyenne 8,4 à 32,7 millions de cellules. Assurez-vous que la solution d’ADRC reste homogène en inclinant doucement la seringue jusqu’à ce qu’elle soit injectée dans les corps caverneux.Placez un drapé d’ouverture sur le pénis. Et un garrot à la racine du pénis avec une boucle de vaisseau en silicone. Resserrez la boucle et fixez-la avec une pince, en rendant le garrot suffisamment serré pour arrêter le flux sanguin du pénis.Utilisez deux écouvillons antiseptiques pour désinfecter la peau du pénis au site d’injection. Injectez ensuite un millilitre de la solution ADRC dans un angle direct dans les corps caverneux, sur le côté droit à deux endroits différents. Répétez cette étape dans le corps caverneux gauche, en injectant un volume total de quatre millilitres.Cette méthode a été testée dans un essai clinique ouvert de phase un sur 21 hommes avec un âge moyen de 60 ans et une érection normale et une vie sexuelle active avant une prostatectomie radicale. Six des hommes souffraient également d’incontinence. Tous les hommes ont reçu une seule injection inter caverneuse d’ADRC isolés et ont été suivis de quatre visites à la clinique externe aux 1, 3, 6 et 12 mois après l’injection.Aucun événement grave ne s’est produit pendant la période d’observation. Huit hommes ont signalé une rougeur transitoire et un gonflement aux sites d’injection, et trois ont signalé une réaction dans la région du pénis. Huit hommes ont connu des événements mineurs réversibles liés à la liposuccion, tels qu’une légère gêne abdominale et des hématomes abdominaux mineurs.Aucun patient n’a signalé d’inconfort au cours du suivi d’un mois. Leur fonction sexuelle a été évaluée avec l’indice international de la fonction érectile cinq et le score de dureté de l’érection. Huit hommes sur 15 du groupe continent ont déclaré que leur fonction érectile était suffisante pour les rapports sexuels à 12 mois.Le groupe de six hommes incontinents n’a montré aucune amélioration de la fonction érectile Lors de la tentative de ce protocole, gardez à l’esprit que les enzymes utilisées pendant la procédure d’isolement doivent être sorties du congélateur ou du réfrigérateur deux heures avant le début de la procédure. Les résultats de cette technique ont ouvert la voie à un ECR où les effets des cellules souches adipeuses sont explorés à plus grande échelle.

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