Name: Isoler la maligne et cellules B Non-Malignant de lck:eGFP poisson-zèbre (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez l'isolation de cellules B malignes et non malignes chez le poisson-zèbre lck:eGFP. Cette méthode permet d'étudier le développement lymphocytaire et les leucémies aiguës lymphoblastiques B et T.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous tenons à remercier Megan Malone-Perez pour les soins de poisson-zèbre et le noyau de cytométrie de flux OUHSC. Ce travail a été soutenu par des subventions de Hyundai Hope sur roues, le centre de l’Oklahoma pour l’avancement des sciences et de technologie (HRP-067), une sentence de projet pilote de NIH/NIGM INBRE (P20, GM103447). JKF détient le E.L. & Thelma Gaylord Endowed Chair en hémato-oncologie pédiatrique de la fondation de l’hôpital des enfants.

Toutes les procédures impliquant le poisson-zèbre ont été approuvées par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) à l’University of Oklahoma Health Sciences Center.
1. isoler Non-malignes B et les Lymphocytes T de transgéniques lck:eGFP poissons
<ol><li>Anesthésier les poissons à l’aide de 0,02 % de tricaïne (MS-222) dans l’eau du système de poissons.</li>
	<li>Examiner les poissons de 2 à 6 mois pour thymi fluorescent, qui se trouvent dans l’aspect dorsomédian de la cavité branchiale de poissons zèbres et autres téléostéens14. Utiliser un microscope à épifluorescence (470/40 onde d’excitation et d’émission 525/50 filtre) pour détecter la GFP.</li>
	<li>Préparer à l’avance 50 mL de stérilisée par filtration 1 x Roswell Park Memorial Institute Medium (RPMI) contenant 1 % fœtale bovine sérique et 1 % la pénicilline-streptomycine (tri médias). Médias tri inutilisés peuvent être stockés à 4 ° C pendant 2 mois.</li>
	<li>Euthanasier le poisson en le plaçant dans un bécher contenant 0,2 % Tricaïne pendant environ 5 min, suivie d’immersion de bain de glace. Confirmer la mort par la cessation du mouvement operculaire (gill).</li>
	<li>Placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et disséquer les organes lymphoïdes d’intérêt, en utilisant le microscope à fluorescence à disséquer la GFP+ thymi14et paramètres de microscopie de champ lumineux de disséquer la moelle osseuse et la rate de rein15. Les résultats présentés ici ont été obtenus à l’aide de 3 mois poissons. Proportion de lymphocytes et de chiffres absolus varient selon l’âge et le génotype (voir pour plus de détails).</li>
	<li>Placer chaque organe découpé dans un tube de 1,5 mL contenant 500 µL de froid tri médias.</li>
	<li>Homogénéiser le tissu sur la glace à l’aide d’un homogénéisateur de micro-tube de pilon.</li>
	<li>Passez tissu homogénéisé à travers un filtre de maille de 35 µm pour générer une suspension monocellulaire. Garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.</li>
</ol>2. isoler les Lymphocytes malignes de Double-transgéniques rag2:hMYC ; lck:eGFP poisson-zèbre
<ol><li>
Commençant à 2-4 mois, écran au microscope de rag2:hMYC; LCK:eGFP pêchez modèles anormaux de GFP. Remarque : les cellules B sont GFPlo dans le fond de lck:eGFP , alors B-ALL nécessite pratique de reconnaître ; T-ALL est évidente, parce que les cellules T sont GFPSalut. En conséquence, l' rag2:hMYC, lck:eGFP ligne double-transgéniques a deux phénotypes : brillamment fluorescent T-ALL, qui habituellement proviennent du thymus et s’étendent dans le corps et faiblement fluorescentes B-ALL.<ol>
<li>À l’aide d’un microscope à fluorescence, écran les poissons à l’aide des paramètres « faible exposition » (200 ms, 2,4 x gain) pour identifier les lumineux T-ALL (Figure 1 a) et « exposition élevée » (1,5 s, gain x 3,4) pour identifier dim B-ALL (Figure 1 a). Contrôles WT et poissons pré leucémique ont GFP localisée uniquement dans le thymus (Figure 1 b).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Une anesthésie et d’examiner le poisson comme décrit aux points 1.1, 1.2.</li>
	<li>Classer le poisson basé sur la mesure de la fluorescence GFP, à l’aide d’un système simple de trois catégories : Remarque : Niveau 1 : Fluorescence apparaît comme une tumeur thymique avec seulement limitée diffusion locale. Niveau 2 : Fluorescence apparaît au-delà du thymus, impliquant < 50 % du corps. Niveau 3 : Fluorescence dépasse 50 % du corps.</li>
	<li>Séparez les poissons avec l’ensemble de ceux sans cancer. Surveiller des leucémiques poissons (c.-à-d. sans tumeurs GFP+ ) une fois tous les mois pour le développement de tout nouveau. Par ~ 9 mois, tous les rag2:hMYC, lck:eGFP poissons développent T-ALL, B-ALL, ou les deux.</li>
	<li>Pour tout T - ou B cellule d’isolement, sélectionnez niveau 3 poissons (tous impliquant > 50 % du corps), qui produisent plus de 2 x 106 toutes les cellules et généralement beaucoup plus.</li>
	<li>Euthanasier le poisson comme à l’étape 1.4. Remarque : Il existe deux méthodes pour obtenir toutes les cellules : corps entier homogénéisation et un lavage péritonéal technique16. Les méthodes diffèrent dans le nombre absolu de cellules recueillies pour le tri, et ainsi, les montants des FACS fois requis et coût (voir pour plus de détails).</li>
	<li>Pour chaque méthode, tout d’abord placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et à l’aide d’une lame de rasoir, retirez la tête y compris la région du thymus. Cela peut être traitée séparément, si vous le souhaitez, ou utilisés pour la coloration histologique.</li>
	<li>
Méthode de lavage péritonéal
	<ol>
<li>À l’aide d’une pipette P1000, laver la cavité péritonéale de poisson avec 500 µL de froid tri médias, collecte des cellules et des médias dans un tube de 5 mL.</li>
		<li>Avec une pointe de nouvelle pipette, injecter un µL de 200-300 supplémentaires de médias tri froid dans la cavité du corps. Puis, à l’aide de l’embout de la pipette, appliquez une légère pression sur le corps de poisson pour extruder les cellules dans la cavité du corps. Recueillir ce média et ajouter dans le tube de 5 mL.</li>
		<li>Répétez l’étape 2.8.2 2 à 3 fois. Garder les cellules recueillies dans le tri des médias sur la glace.</li>
		<li>Filtrer la suspension cellulaire mais un maillage de 35 µm filtrer avant écoulement cytometry/FACS et garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Homogénéisation de l’ensemble du corps
	<ol>
<li>Après avoir enlevé la tête de poisson, placer le corps dans un tube de 1,5 mL contenant 200 µL de tri médias.</li>
		<li>Homogénéiser le corps à l’aide d’un homogénéisateur de micro-tube de pilon.</li>
		<li>Ajouter une supplémentaire 300 µL de froid tri médias. Filtrer la suspension cellulaire si un filtre de maille de 35 µm. Ajouter des éléments multimédias tri selon les besoins pour laver toutes les cellules à travers le filtre, jusqu'à ce que seulement les débris tissulaires reste sur le filtre. Garder les cellules sur la glace jusqu'à l’analyse.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. par cytométrie en flux analyse des Lymphocytes B normaux ou maligne
<ol><li>Définissez la cytométrie et/ou des FACS paramètres selon le guide du fabricant.</li>
	<li>
Acquérir le nombre désiré d’événements pour caractériser au départ l’échantillon. Analyser 1 x 104 à 5 x 104 événements avant le tri à la détermination des portails spécifiques pour les étapes suivantes de tri.
	<ol>
<li>Déterminer les portes : définir des lymphocytes et l’ancêtre portes de cellule à l’aide de forward scatter (FSC) et les paramètres de diffusion (SSC) de côté, à l’exclusion des débris cellulaires (Figure 2 a- C)17. FSC et SSC correspondent à la taille/diamètre de la cellule et la granularité, respectivement. Remarque : GFP–, GFPloet GFPSalut cellules diffèrent de 10 à 100-fois en fonction de leur intensité de fluorescence GFP, rendant la séparation de ces populations simples (Figures 2-5). Mort en direct-discrimination peut être évaluée à ce stade, à l’aide de propidium iode (PI) ou 7-aminoactinomycine D (7-Abdellah) viabilité coloration. Des expériences antérieures avec PI démontrent généralement > viabilité de 95 % des cellules GFP+ après FACS.</li>
		<li>Exclure les doublets de la cellule, selon les paramètres de la machine de FACS utilisé.</li>
		<li>Intérieur des portes lymphoïdes ou précurseur, déterminer le nombre et le pourcentage de cellules GFP+ .</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser la phycoérythrine (PE) et l’intensité de la GFP, définir les porte pour GFP– vs GFPlo vsSalut cellules GFP. Remarque : Cellules B pièce dim fluorescence GFP et cellules T montrent des GFP lumineux en lignes de lck:eGFP . Nombreux organes lymphoïdes ou des échantillons de tumeur contiennent les deux populations de GFP+ . Lignée B cellules/B-ALL sont GFPlo et T-lignée lla/T-cellules sont GFPSalut. Définir gates faire la distinction entre GFP–, GFPloethi cellules GFP et recueillir ces populations séparément (Figure 2 a-C, Figure 3 a-C, Figure 4 a et Figure 5 a).</li>
	<li>Le tri de chaque population de cellules dans des tubes en polypropylène différents 15 mL contenant 2 mL de tri médias ou directement dans des tubes de différentes 1,5 mL contenant un tampon approprié pour des analyses plus poussées (p. ex., ARN, ADN ou extraction de protéine, allo-greffe, etc.).</li>
	<li>Garder les cellules purifiées sur la glace avant d’approfondir les analyses.</li>
</ol>

<ol><li>Paik, E. J., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+development+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic development in the zebrafish.</a> International Journal of Developmental Biology. 54 (6-7), 1127-1137 (2010).</li>
<li>Kasheta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+T+reg-like+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of T reg-like cells in zebrafish.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (12), 3519-3530 (2017).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+B+Cell+Development+without+a+Pre-B+Cell+Stage%2C+Revealed+by+CD79+Fluorescence+Reporter+Transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Zebrafish B Cell Development without a Pre-B Cell Stage, Revealed by CD79 Fluorescence Reporter Transgenes.</a> Journal of Immunology. 199 (5), 1706-1715 (2017).</li>
<li>Page, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionarily+conserved+program+of+B-cell+development+and+activation+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An evolutionarily conserved program of B-cell development and activation in zebrafish.</a> Blood. 122 (8), e1-e11 (2013).</li>
<li>Schorpp, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+functions+of+Ikaros+in+vertebrate+lymphocyte+development%3A+genetic+evidence+for+distinct+larval+and+adult+phases+of+T+cell+development+and+two+lineages+of+B+cells+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Conserved functions of Ikaros in vertebrate lymphocyte development: genetic evidence for distinct larval and adult phases of T cell development and two lineages of B cells in zebrafish.</a> Journal of Immunology. 177 (4), 2463-2476 (2006).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+T+cell+development%2C+ablation%2C+and+engraftment+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of T cell development, ablation, and engraftment in transgenic zebrafish.</a> Proceedings of National Academy of Sciences U S A. 101 (19), 7369-7374 (2004).</li>
<li>Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+to+understand+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish to understand immunity.</a> Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).</li>
<li>Frazer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heritable+T-cell+malignancy+models+established+in+a+zebrafish+phenotypic+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Heritable T-cell malignancy models established in a zebrafish phenotypic screen.</a> Leukemia. 23 (10), 1825-1835 (2009).</li>
<li>Rudner, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shared+acquired+genomic+changes+in+zebrafish+and+human+T-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL.</a> Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).</li>
<li>Gutierrez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pten+mediates+Myc+oncogene+dependence+in+a+conditional+zebrafish+model+of+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Pten mediates Myc oncogene dependence in a conditional zebrafish model of T cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Journal of Experimental Medicine. 208 (8), 1595-1603 (2011).</li>
<li>Borga, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+B+and+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemias+in+zebrafish+driven+by+transgenic+MYC%3A+implications+for+oncogenesis+and+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Simultaneous B and T cell acute lymphoblastic leukemias in zebrafish driven by transgenic MYC: implications for oncogenesis and lymphopoiesis.</a> Leukemia. , (2018).</li>
<li>Haferlach, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+utility+of+microarray-based+gene+expression+profiling+in+the+diagnosis+and+subclassification+of+leukemia%3A+report+from+the+International+Microarray+Innovations+in+Leukemia+Study+Group%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Clinical utility of microarray-based gene expression profiling in the diagnosis and subclassification of leukemia: report from the International Microarray Innovations in Leukemia Study Group.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (15), 2529-2537 (2010).</li>
<li>Novershtern, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Densely+interconnected+transcriptional+circuits+control+cell+states+in+human+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Densely interconnected transcriptional circuits control cell states in human hematopoiesis.</a> Cell. 144 (2), 296-309 (2011).</li>
<li>Menke, A. L., Spitsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+anatomy+and+histology+of+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Pathology%22%5BJournal%5D)">Normal anatomy and histology of the adult zebrafish.</a> Toxicology Pathology. 39 (5), 759-775 (2011).</li>
<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li>
<li>Pruitt, M. M., Marin, W., Waarts, M. R., de Jong, J. L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Side+Population+in+Myc-induced+T-cell+Acute+Lymphoblastic+Leukemia+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (37), (2017).</li>
<li>Traver, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+and+in+vivo+imaging+of+multilineage+engraftment+in+zebrafish+bloodless+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transplantation and in vivo imaging of multilineage engraftment in zebrafish bloodless mutants.</a> Nature Immunology. 4 (12), 1238-1246 (2003).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Tang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+hematopoietic+and+renal+cell+heterogeneity+in+adult+zebrafish+at+single-cell+resolution+using+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dissecting hematopoietic and renal cell heterogeneity in adult zebrafish at single-cell resolution using RNA sequencing.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (10), 2875-2887 (2017).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Nous avons mis au point et fournir un protocole visant à isoler les cellules de B de lck:eGFP zebrafish transgénique, ajoutant cela à d’autres modèles de d. rerio lignée B étiquettes3,4. Étonnamment, l’identification des GFPlo B cellules dans cette rangée est passé inaperçue depuis sa description en 2004. Généralement, lck est considéré comme spécifique à la cellule T6, mais des études récentes trouven...

Poisson zèbre offrent des attributs puissants, tels que la manipulation génétique, forte fécondité, translucidité optique et un développement rapide qui facilitent l’étude du développement des vertébrés en utilisant des approches génétiques. Ces avantages, ainsi que les caractéristiques partagées de l’hématopoïèse téléostéens et chez les mammifères, font d. rerio idéal pour l’analyse in vivo de la lymphopoïèse et lymphocyte function, depuis leur première apparition chez les larves tout au long de l’âge adulte. Développement de sang chez le poisson zèbre s’appuie sur des processus génétiques bien conservées qui sont partagés avec les mammifères, et ceux-ci portent le système immunitaire adaptatif. En outre, les mécanismes moléculaires qui régissent le développement lymphoïde sont remarquablement conservées entre les mammifères et poissons zèbres1.
Depuis 2 décennies, transgénique d. rerio lignes cette étiquette spécifique sang lignages et lignées mutantes déficientes dans ces lignées ont été créées par2,3,4,5. L’une d'entre elles, la lignée transgénique lck:eGFP , utilise le promoteur zebrafish lymphocytaire protéine tyrosine kinase (lck) pour piloter la GFP expression6. Ce gène, qui est fortement exprimé par les précurseurs de la lignée T et les lymphocytes T matures, permet in vivo par FACS7de suivi du développement des lymphocytes de T thymiques et ex vivo purification de cellules de la lignée T. Auparavant, nous avons utilisé cette ligne dans un écran de mutagenèse ENU avance-génétique pour identifier des mutants de lignée germinale sujettes à T-ALL et d’étudier les phénomènes génétiques somatiquement acquis liés à lymphocytes T oncogenèse8,9.
Récemment, notre laboratoire a prorogé l’utilité du poisson-zèbre de lck:eGFP . Double-transgéniques rag2:hMYC (MYC humain), lck:eGFP D. rerio qui sont connus pour développer lla- 10, nous avons découvert que lignée B se produisent également11. Contrairement au T-ALL dans ce modèle, qui réagissent en couleurs vives en raison de la forte expression de la GFP, B-ALL sont faiblement fluorescentes en raison de faibles niveaux GFP, permettant aux poissons avec B-ALL à distinguer nettement de celles avec T-ALL par microscopie à fluorescence. Cette expression différentielle de la GFP permet aussi la séparation des celluleslo B-ALL GFP de GFPSalut FACS11des cellules T-ALL. En outre, faible lck expression n’est pas unique à poisson zèbre B-ALL, comme humains B-tout aussi express faibles niveaux de LCK11,12. De même, les cellules normales de lignée B de d. rerio, les souris et les humains expriment aussi des faibles niveaux de lck/Lck/LCK, avec des cellules B immatures ayant la plus haute expression11,13. Sur une base par cellule, cellules de la lignée B en lignes de poisson-zèbre ou un dérivé lckeGFP expriment 1-10 % autant GFP comme les lymphocytes T. Ces GFPlo cellules express caractéristique ARNm de lymphocytes B tels que pax5, cd79b, blnk, btk, ighm, ighzet autres et peut être purifié de la moelle osseuse, thymus, la rate ou périphérique 11de sang. Donc, les deux B-T-lignée et cellules peuvent être isolées du poisson-zèbre de lckeGFP et dans le cas de rag2hMYC, les lckeGFP animaux, les cellules B et T-ALL ainsi11.
Ici, nous présentons notre protocole efficacement FACS-purifier non malignes cellules B de lck:eGFP poisson-zèbre et bénignes ou malignes des cellules de B de rag2hMYC; LCK:eGFP poissons, à l’aide de divers tissus de source. Ces cellules peuvent même être quantifiées par cytométrie en flux sans isolement de FACS, si vous le souhaitez. Découverte d’expression faible lck - et par conséquent, faible expression de la GFP-par B cellules ouvre de nouvelles portes de possibilités expérimentales de lckeGFP poisson-zèbre, tels que les études sur le développement de cellules in vivo B. Ainsi, cette lignée transgénique, pour la première fois en 2004, a nouvelle vie alors que nous cherchons à utiliser pour glaner des nouvelles perspectives relatives à l’immunité adaptative de poisson-zèbre.

<table><tbody><tr><td>35 et micro ; m mesh</td><td>Sefar Technologie de filtrage</td><td>7050-1220-000-13</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Polystyrène tube à fond rond avec capuchon de filtre</td><td>Falcon Corning Brand</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>VWR international</td><td>525-0448</td><td></td></tr><tr><td>AZ APO 100 Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytoflex</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Qi1MC camara</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate méthansésulfonate ; MS-222</td><td>Sigma</td><td>E-10521</td><td></td></tr><tr><td>FACSJazz</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fisher</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>em>lck :eGFP</td><td></td><td></td><td>Voir Langeneu et al., 2004</td></tr><tr><td>Logiciel NIS Elements</td><td>Nikon</td><td>Version 4.13</td><td></td></tr><tr><td>Péniciline-Streptomycine</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateurs de microtubes à pilons Microscopie</td><td>électronique Sciences</td><td>64788-20</td><td></td></tr><tr><td>Transfert de plastique Pippetes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>rag2 :hMYC-ER</td><td></td><td></td><td>Voir Gutierrez et al., 2011</td></tr><tr><td>RPMI Media 1640 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11835-030</td><td></td></tr></tbody></table>

isoler la maligne et cellules b non-malignant de lck:egfp poisson-zèbre

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Poisson zèbre (Danio rerio) sont un puissant modèle pour étudier le développement des lymphocytes. Comme les mammifères, d. rerio possèdent un système immunitaire adaptatif qui inclut des lymphocytes B et T. Études de poisson-zèbre lymphopoïèse sont difficiles parce que les anticorps reconnaissant d. rerio marqueurs de surface cellulaire ne sont généralement pas disponibles, ce qui complique l’isolement et la caractérisation de populations de lymphocytes différents, y compris la lignée B cellules. Des lignées transgéniques avec expression fluorophore lignée spécifiques sont souvent utilisées pour contourner ce problème. La ligne transgéniques lck:eGFP a été utilisée pour étudier le développement des lymphocytes T d. rerio et a également été utilisée pour le développement des lymphocytes T modèle et de la leucémie lymphoblastique aiguë (lla-T). Bien que les poissons de lck:eGFP ont été largement utilisées pour analyser la lignée T, ils n'ont pas servi à étudier des cellules B. Récemment, nous avons découvert que beaucoup de poisson-zèbre B cellules exprime également lck, quoiqu’à des niveaux inférieurs. En conséquence, les cellules de lck:eGFP B expriment même faibles niveaux de GFP. Fondé sur cette conclusion, nous avons développé un protocole pour purifier les cellules de la lignée B de lck:eGFP poisson-zèbre, dont nous présentons ici. Notre méthode explique comment utiliser un trieur de cellules fluorescentes-activé (FACS) pour purifier les cellules de B de lck:eGFP poisson ou les lignes associées, telles que double-transgéniques rag2:hMYC; LCK:eGFP poissons. Dans ces lignes, cellules B, cellules de B particulièrement immatures, GFP expresse aux niveaux bas mais détectable, leur permettant d’être distingué de lymphocytes T, qui expriment la GFP hautement. B cellules peuvent être isolées de la moelle osseuse, thymus, rate, sang ou d’autres tissus. Ce protocole prévoit une nouvelle méthode pour purifier les cellules B d. rerio , permettant des études axées sur des sujets comme le développement des lymphocytes B et lymphocytes B malignes.

Nous avons utilisé la cytométrie de flux pour analyser et FACS pour isoler la GFPlo et GFPSalut cellules du thymus, moelle des reins et la rate de lck:eGFP zebrafish transgénique. Analyse des poissons âgés de 3 mois a révélé que le thymus contenaient principalement des lymphocytes GFP+ . Cellules GFP+ étaient largement confinées à la porte lymphoïde précédemment décrite par Traver Al.17. Deux populations distinct...

Poisson zèbre transgéniques lck:eGFP express GFP fortement dans les lymphocytes T et ont été utilisés pour étudier le développement des lymphocytes T et la leucémie aiguë lymphoblastique. Cette ligne permet aux cellules d’étude B, qui expriment lck aux niveaux inférieurs. Ce protocole décrit la purification de cellules de B malignes et bénignes du poisson-zèbre de lck:eGFP .

Isoler la maligne et cellules B Non-Malignant de lck:eGFP poisson-zèbre

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

Nous avons récemment constaté que de nombreuses cellules B dans le poisson zèbre LCK GFP expriment de faibles niveaux de GFP. Cela fait de cette ligne un outil utile pour l’étude des cellules B ainsi que des cellules T. Le principal avantage de cette technique est que maintenant nous pouvons étudier les cellules B et les cellules T du poisson zèbre LCK GFP ou nous pouvons étudier les cellules B-ALL et T-ALL à partir de poissons atteints de cancer.Ces méthodes permettent le développement des cellules B et des études B-ALL chez le poisson zèbre. Qui sont pertinents pour comprendre le système immunitaire adaptatif et ses malignités communes dans le cancer pédiatrique. Si vous n’avez jamais fait ces dissections avant que vous puissiez vouloir affiner votre technique à quelques reprises jusqu’à ce que vous puissiez obtenir de bons échantillons de thymus et de moelle.La démonstration visuelle aidera les téléspectateurs à reconnaître le fluor et le B-ALL chez les poissons et à choisir les bons réglages pour discriminer les cellules B et T pour leur isolement. Après anesthésie avec 0,02%Tricaine dans l’eau du système de poissons utiliser le filtre GFP sur un microscope d’épifluorescence pour examiner le poisson zèbre de deux à six mois pour thymi fluorescent à l’aspect médial dorsale de la cavité branchiale. Après avoir localisé le thymus placer le poisson euthanasié dans une boîte de Pétri et utiliser le microscope fluorescent pour enlever le thymi positif GFP.Et les paramètres de microscopie brightfield pour récolter la moelle rénale et la rate. Placer chaque organe recueilli dans un tube de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de milieu de tri à froid et utiliser un homogénéisateur de microtube de pilon pour homogénéiser les tissus sur la glace. Ensuite, filtrer le tissu homogénéisé à travers un filtre à mailles de 35 micromètres pour générer une suspension cellulaire unique et placer les cellules sur la glace.À partir de deux à quatre mois, utilisez un microscope fluorescent pour dépister les poissons EGFP à double transgénique2:hMYC LCK utilisant des paramètres de faible exposition pour identifier la leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T ou T-ALL et les milieux d’exposition élevés pour identifier les animaux b-all faibles. Les poissons de type sauvage et pré-leucémiques n’ont gfp localisé que dans le thymus. Catégoriser le poisson en fonction de l’étendue de la fluorescence GFP à l’aide d’un système simple à trois catégories.Les poissons de niveau un démontrent un signal fluorescent comme tumeur thymique avec seulement une diffusion locale limitée. Les poissons de niveau deux démontrent un signal fluorescent au-delà du thymus impliquant moins de 50% du corps. Et les poissons de niveau trois démontrent un signal fluorescent s’étendant au-delà de 50% du corps.Séparez le poisson avec ALL de ceux qui n’ont pas de cancer. Et surveiller les poissons pré-leucémiques sans tumeurs positives GFP une fois par mois pour le développement de la nouvelle ALL. Pour l’isolement cellulaire T ou B-ALL, utilisez une lame de rasoir pour enlever la tête et la région thymique d’un poisson de niveau trois euthanasié et placer le corps dans une boîte de Pétri.Utilisez une pipette P-1000 pour laver la cavité péritonéale du poisson avec 500 microlitres de milieu de tri à froid, en recueillant les cellules et le milieu dans un tube de cinq millilitres. À l’aide d’une pointe de pipette fraîche injecter deux à trois volumes supplémentaires de 200 à 300 microlitres de milieu de tri à froid dans la cavité du corps et utiliser le bout de la pipette pour appliquer une pression douce sur le corps du poisson pour extruder les cellules de la cavité du corps dans le tube de cinq millilitres. Ensuite, filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 35 microlitres.Et placez les cellules sur la glace jusqu’à leur analyse par cytométrie d’écoulement. Pour l’homogénéisation du corps entier utiliser un homogénéiseur microtube pilon pour homogénéiser le corps du poisson et ajouter 300 microlitres supplémentaires de milieu de tri à froid au tube. Filtrer la suspension cellulaire à travers un filtre à mailles de 35 micromètres, en lavant le filtre avec un milieu de tri supplémentaire si nécessaire jusqu’à ce que seuls les débris tissulaires restent sur le filtre.Ensuite, placez les cellules sur la glace jusqu’à leur analyse. Pour l’analyse cytométrique de flux des cellules isolées définir les paramètres du cytomètre d’écoulement selon les lignes directrices du fabricant. Et acquérir 10 000 à 50 000 événements pour définir les paramètres avancés de dispersion et de dispersion latérale pour définir les portes des lymphocytes et des cellules progénitrices et exclure les débris cellulaires.Exclure les doublets cellulaires et utiliser les portes lymphoïdes et/ou précurseurs pour déterminer le nombre et le pourcentage des cellules positives du GFP. L’utilisation de la phycoerythrine et des intensités GFP définissent les portes pour les cellules gfp négatives par rapport aux cellules élevées GFP. Il est essentiel d’apprendre où placer les barrières pour isoler les cellules hautes GFP et GFP pour obtenir des populations pures de cellules B et T.Deux populations positives distinctes de GFP, des cellules de bas B de GFP et des cellules hautes de T de GFP peuvent être obtenues du thymus. Les cellules B résidant dans la moelle rénale du poisson zèbre de trois mois expriment de faibles niveaux de GFP. Les cellules élevées de GFP sont rares cependant, indiquant que seulement un petit pourcentage des lymphocytes de T sont présents dans la moelle à trois mois d’âge.De même, les échantillons spléniques montrent des pourcentages plus élevés de GFP faible que les cellules élevées GFP. Chez les poissons double-transgéniques qui n’ont pas encore développé de leucémie lymphoblastique aiguë, l’expression du GFP dans le thymus, la moelle et la rate est similaire à celle observée chez les poissons EGFP LCK mono transgéniques. Cependant, le nombre de lymphocytes par organe est augmenté.Vraisemblablement, en raison de l’expansion entraînée par myc des populations immatures de cellules B et T dans lesquelles le promoteur rag2 est actif. Chez les poissons double-transgéniques avec B et ou T-ALL qui ont développé des cancers fluorescents de six mois B-ALL sont des cancers faiblement fluorescents contenant principalement des cellules faibles GFP. En revanche, les poissons brillamment fluorescents peuvent abriter des populations isolées de T-ALL ou mixtes des cellules GFP low B-ALL et GFP high T-ALL.En effet, tel qu’évalué par l’analyse quantitative de réaction en chaîne de polymése GFP les cellules basses expriment des niveaux plus élevés des transcriptions de cellules de B. Et les cellules élevées GFP expriment des niveaux plus élevés de gènes des cellules T, LCK et le marqueur GFP. Il est essentiel d’apprendre à reconnaître les poissons avec B-ALL par microscopie.Et comment bien définir les barrières de cytométrie de flux pour séparer les populations faibles et GFP élevées. Après cette procédure, vous pouvez isoler l’ADN, l’ARN ou les protéines des cellules hautes GFP faible et GFP pour pcr, séquençage, ce qui est dans le sang ou des expériences de transplantation in vivo. Une fois que nous avons appris que les poissons LCK GFB ont des cellules B fluorescentes en plus des cellules T, nous avons pu étudier les deux types de cellules du même animal pour évaluer B et T-ALL.

isolating-malignant-and-non-malignant-b-cells-from-lckegfp-zebrafish

Research

Recherche

JoVE Journal

Medicine

Médecine

Limitation des dosages de dilution transplantation de cellules sont utilisées pour déterminer la fréquence des tumeurs des cellules propager. Ce protocole décrit une méthode pour générer le poisson-zèbre syngéniques qui développent une leucémie marqués à la fluorescence et les détails la façon d'isoler et de transplanter ces cellules leucémiques à limiter la dilution dans la cavité péritonéale du poisson zèbre adulte.

Quantifier la fréquence des tumeurs se propageant Cellules utilisant Limiter la greffe de cellules syngéniques de dilution dans Zebrafish

Une méthode est décrite pour photoactiver cellules individuelles contenant une protéine fluorescente utilisant cage absorption à deux photons à partir d'un Ti: saphir oscillateur laser femtoseconde. Pour mapper le destin de la cellule photoactivé, l'immunohistochimie est utilisée. Cette technique peut être appliquée à n'importe quel type de cellule.

Simple cartographie du destin cellulaire chez le poisson zèbre

Ce protocole décrit la technique d’isolement des cellules tumorales de leucémie aiguë lymphoblastique à cellules T marquées par fluorescence (LAL-T) d’un poisson-zèbre adulte et de leur quantification à l’aide d’un colorant bleu trypan.

Isolement de cellules T-ALL marquées par fluorescence : une méthode pour isoler des cellules T-ALL d’un poisson-zèbre adulte

Ici, nous présentons un protocole pour la transplantation cellulaire du muscle squelettique du poisson zèbre et du rhabdomyosarcome embryonnaire (ERMS) dans un poisson zèbre mutant homozygote rag2E450fs immunodéprimé adulte. Ce protocole permet l’analyse efficace de la régénération et de la transformation maligne des cellules musculaires.

Transplantation des cellules musculaires normales et malignes dans immunodéprimés adultes poisson zèbre

Ce protocole décrit une méthode pour isoler des cellules uniques à partir d’embryons de poisson-zèbre, enrichir pour des cellules d’intérêt, capturer des cellules de poisson-zèbre dans des systèmes de multiplexage de cellules uniques basés sur la microfluidique, et évaluer l’expression génique à partir de cellules uniques.

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

Nous décrivons ici une technique pour isoler les cellules de la population de côté d'un modèle de poisson zèbre leucémie aiguë lymphoblastique T myc induite (T-ALL). Ce test de population côté est très sensible et est décrit pour T-ALL zebrafish, mais il peut être applicable à d'autres types de cellules malignes et non zebrafish malignes.

L&#39;isolement de la population latérale dans la leucémie lymphoblastique aiguë de cellules T induite par Myc dans le poisson zèbre

Ici, nous montrons le processus de création d’une ligne de poisson-zèbre de journaliste tension électrique cellulaire afin de visualiser le développement embryonnaire, mouvement, et des cellules de tumeur de poissons in vivo.

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Cet article présente la méthode de développement, de caractérisation et de suivi en temps réel des métastases tumorales dans le modèle de poisson zèbre du neuroblastome, en particulier dans la ligne transgénique de poisson-zèbre avec surexpression de MYCN et LMO1, qui développe des métastases spontanément.

Modèle de poisson-zèbre de métastases de neuroblastome

Ce travail décrit un protocole pour le système modulaire de transgénèse Tol2, une méthode de clonage basée sur une passerelle pour créer et injecter des constructions transgéniques dans des embryons de poisson zèbre.

Le système Tol2 du poisson zèbre : une approche de transgénèse modulaire et flexible basée sur une passerelle

Nous avons utilisé la coloration de prolifération cellulaire pour identifier les cellules quiescentes dans le modèle de leucémie lymphoblastique aiguë T-poisson zèbre. La coloration est conservée dans les cellules non divisées et réduite pendant la prolifération cellulaire, ce qui permet de sélectionner les cellules dormantes pour une interrogation plus approfondie. Ce protocole fournit un outil fonctionnel pour étudier l’auto-renouvellement dans le contexte de la quiescence cellulaire.

Identification de cellules quiescentes dans un modèle de leucémie lymphoblastique aiguë à cellules T de poisson-zèbre à l’aide de la coloration de la prolifération cellulaire 

Découvrez l'isolation de cellules B malignes et non malignes chez le poisson-zèbre lck:eGFP. Cette méthode permet d'étudier le développement lymphocytaire et les leucémies aiguës lymphoblastiques B et T.

Isoler la maligne et cellules B Non-Malignant de lck:eGFP poisson-zèbre

Explorer plus de vidéos