Name: Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Découvrez le criblage yeast one-hybrid amélioré pour identifier les facteurs de transcription liés à l'ADN humain. Cette méthode permet d'évaluer plus de 1000 TFs en une seule expérience.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health [R35-GM128625 à J.I.F.B.].

1. les préparatifs
<ol><li>
SC −U −H boîtes (150 mm pétri) Remarque : Ces plaques serviront pour les souches de levure ADN-appâts de plus en plus.<ol>
<li>Dissoudre le mélange de l’abandon, levure azote base (YNB), adénine hemisulfate et sulfate d’ammonium à 920 mL d’eau et le pH à 5,9 avec 5 M NaOH (environ 1 mL / litre de médias ; voir le tableau 2 pour la composition). Verser dans un flacon de 2 L et ajouter un.</li>
		<li>Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 950 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).</li>
		<li>Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.</li>
		<li>Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole. Ajouter le glucose, mélanger bien sur une plaque de remuer et laisser refroidir à 55 ° C dans un bain d’eau.</li>
		<li>Ajouter la leucine et le tryptophane aux médias. Mélanger bien sur une plaque de remuer et verser dans les plats de pétri stérile de 150 mm (~ 80 mL par plat). Sécher pendant 3 à 5 jours à température ambiante, envelopper dans des sacs en plastique et conserver à température ambiante pendant 6 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Plaques rectangulaires YAPD Remarque : Ces plaques serviront pour la culture de la pelouse pour la souche ADN-appât et pour s’accoupler avec la collection de tableau TF.<ol>
<li>Dissoudre les poudres (voir le tableau 3 pour la composition), à l’exception de l’agar, en 950 mL d’eau dans un flacon de 2 L et ajouter un.</li>
		<li>Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 950 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).</li>
		<li>Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.</li>
		<li>Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole.</li>
		<li>Ajouter le glucose, mélange bien sur une assiette pour remuer et laisser refroidir à 55 ° C. Introduire des médias dans les boîtes rectangulaires (voir Table des matières; ~ 70 mL par plaque) à l’aide d’une pompe péristaltique (5 mL/s) et un tube de 6 mm. Sec 1 nuit à température ambiante, envelopper dans des sacs en plastique et stocker dans la chambre froide jusqu'à 6 mois. Remarque : Bien que le volume de médias suggérée est 70 mL par plaque, 50 à 80 mL par plaque peut être utilisé. Les trois éléments essentiels à considérer quelle battante plaques sont 1) qu’ils sont mis à niveau afin que le milieux gélosés a tout au long de la plaque de la même épaisseur (utiliser une table nivelé ou la surface pour le coulage de la plaque et ne pas verser dans les piles de plus de sept assiettes) 2) pour assurer l’absence de bulles dans l’agar médias (bulles doivent être sautés à l’aide d’une aiguille stérile) et 3) séchage des plaques pour une seule journée et les plaques d’emballage dans des sacs en plastique pour éviter les échecs en épinglant la levure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −Trp et plaques rectangulaires de Sc −U −Trp Remarque : Ces plaques serviront pour la culture de la collection de tableau TF (Sc −Trp) et de sélectionner des levures diploïdes après l’accouplement (Sc −U −Trp).<ol>
<li>Dissoudre le mélange de l’abandon, YNB, adénine hemisulfate et sulfate d’ammonium à 920 mL d’eau et le pH à 5,9 avec NaOH 5M (environ 1 mL par litre de médias) (voir le tableau 4 pour la composition). Verser dans un flacon de 2 L et ajouter un.</li>
		<li>Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 950 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).</li>
		<li>Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.</li>
		<li>Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole. Ajouter le glucose, mélanger bien sur une plaque de remuer et laisser refroidir à 55 ° C.</li>
		<li>Ajouter la leucine, histidine et uracile (omettre l’uracile pour les plaques de −Trp Sc −U).</li>
		<li>Mélanger bien sur une plaque de remuer et verser dans des plaques rectangulaires (~ 70 mL par plaque) à l’aide d’une pompe péristaltique (5 mL/s) et le tube de 6 mm. Sécher pendant 1 journée à température ambiante, envelopper les plaques dans des sacs en plastique et ranger dans la chambre froide jusqu'à 3 mois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
SC −U −H −Trp + 3AT + plaques rectangulaires X-gal Remarque : ces plaques serviront de plaques d’affichage pour des dosages eY1H.<ol>
<li>Dissoudre le mélange de l’abandon, YNB, adénine hemisulfate et sulfate d’ammonium dans 850 mL d’eau (voir tableau 5 pour la composition). Ne pas le pH. Verser dans un flacon de 2 L et ajouter un.</li>
		<li>Dans un deuxième flacon de 2 L, ajoutez l’agar à 850 mL d’eau (ne pas ajouter une barre de remuer ce qui provoquerait l’agar à ébullition à feu à l’autoclave).</li>
		<li>Stériliser pendant 40 minutes à 15 lb/po2 sur un cycle de liquid.</li>
		<li>Préparer 10 x BU sels (1L) en combinant 900 mL d’eau, 70 g de Na2HPO4∙7H2O et 34,5 g NaH2PO4∙H2Mix O. utilisation d’une barre de remuer pour dissoudre les poudres et ajuster le pH à 7.0 à l’aide de 5 M de NaOH. Ajouter l’eau pour porter à 1 L et autoclave.</li>
		<li>Préparer la solution de X-gal en ajoutant 3,5 g de poudre de X-gal à un tube en plastique de 50 mL contenant 42,5 mL de diméthylformamide. Ajouter la poudre de X-gal au diméthylformamide se dissoudre plus facilement (cela prend 30 min). Conserver la solution stock dans l’obscurité (utilisation opaque 50 ml tube ou couvercle en aluminium). Conserver à-20 ° C.</li>
		<li>Versez immédiatement le contenu du premier ballon, y compris la barre de l’émoi, dans la gélose contenant la fiole. Ajouter le glucose et le 10 x sels BU (voir tableau 5 pour la composition), mélanger bien sur une plaque de remuer et laisser refroidir à 55 ° C.</li>
		<li>Ajouter la leucine 3AT et X-gal (voir tableau 5 pour la composition).</li>
		<li>Mélanger bien sur une plaque de remuer et verser dans les plaques rectangulaires (~ 70 mL par plaque) à l’aide d’une pompe péristaltique (5 mL/s) et un tube de 6 mm. Sec 1 nuit à température ambiante, envelopper dans des sacs en plastique et stocker dans la chambre froide, couverte de papier d’aluminium (3AT et X-gal sont sensibles à la lumière) pendant environ 1 mois.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. repérer un tableau TF
<ol><li>
Dégel du tableau TF-proie
	<ol>
<li>Décongeler les plaques stock de glycérol de levure avec le tableau de TF-proie sur la glace. Remarque : Tableaux de TF-proies peuvent être générées comme précédemment publié10,12,13,18.</li>
		<li>Remettre en suspension de la levure à l’aide d’une pipette de 12 canaux 1 – 3 min avant l’étape suivante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Repérer la levure en Sc −Trp plaques rectangulaires
	<ol>
<li>Dans le robot HDA (voir Table des matières), sélectionnez 96 plaques puits multiples comme source, 96 plaques d’agar comme cible et tapis de goujon long 96. Remarque : Pin pads ne sont pas réutilisables et doivent être jetés.</li>
		<li>Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup pour faire deux copies par plaque à 96 puits. Ne pas utiliser la corbeille ou revoir les options pour éviter la contamination des stocks congelés de dos.</li>
		<li>Sélectionnez l’option pour l’agiter de haut en bas dans la source de mélanger la levure.</li>
		<li>Sac le tableau tacheté et incuber les agar-à 30 ° C pendant 2 à 3 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Génération de 384 tableaux de colonie en plaques rectangulaires de Sc −Trp
	<ol>
<li>Dans le robot, sélectionnez 96 plaques d’agar comme source, 384 gélose comme cible et 96 broches courtes plaquettes.</li>
		<li>Sélectionnez le programme tableau 1:4 . De cette façon, des plaques de quatre 96 colonie (contenant chacune un TF différente) seront regroupés en plaque une 384 colonie. Ne pas utiliser la corbeille ou revoir les options pour éviter toute contamination entre les différentes plaques.</li>
		<li>Sac les plaques et incuber le tacheté tableau 384-colonie agar-à 30 ° C pendant 2 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Générant des baies de la colonie 1 536 en plaques rectangulaires de Sc −Trp Remarque : Cela se traduira par des tableaux qui contiennent quatre colonies pour chaque TF-proies.<ol>
<li>Dans le robot, sélectionnez 384 boîtes de gélose comme source, les géloses 1 536 comme cible et 384 tampons pieu court.</li>
		<li>Sélectionnez le programme de source unique de dosage de 1:4. L’objectif consiste à copier chaque colonie dans quatre colonies pour obtenir quadruplicates. Utilisez la corbeille et revoir les options car il implique la copie des quatre fois chaque colonie.</li>
		<li>Sac les plaques et incuber le tacheté 1536-colonie tableau agar-à 30 ° C pendant 3 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplifier le tableau de la colonie 1 536 en plaques rectangulaires de Sc −Trp
	<ol>
<li>Dans le robot, sélectionnez 1 536 géloses comme source, 1 536 géloses comme cible et 1 536 tampons de pieu court.</li>
		<li>Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup de reproduire des copies de 3 – 4. Utilisez la corbeille et revisiter l’option, mais jeter le patin lors du passage à une assiette différente du tableau pour éviter la contamination croisée.</li>
		<li>Sac les plaques et incuber le tacheté 1536-colonie tableau agar-à 30 ° C pendant 3 jours à utiliser pour l’accouplement des étapes (voir ci-dessous). Après cela, gardez les plaques à température ambiante et copie à nouveau après 7 jours pour un nouveau cycle de projection.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. eY1H écran
<ol><li>
Préparation des pelouses de souche ADN-appât pour accouplement
	<ol>
<li>Repérer la levure souches ADN-appât sur une plaque −H −U Sc et pousse pendant 3 jours à 30 ° C.</li>
		<li>Ensemencer la levure dans un 15 cm plaque −H −U Sc à l’aide d’un cure-dent stérile, afin que chaque plaque s’adapte à différentes souches 12 – 16. Incuber un jour à 30 ° C.</li>
		<li>Ensemencer la levure dans un 15 cm plaque −H −U Sc à l’aide d’un cure-dent stérile, afin que chaque assiette correspond à 4 souches différentes. Incuber pendant une journée à 30 ° C.</li>
		<li>Grattez la levure à l’aide d’un cure-dent stérile, en veillant pas à gratter tout agar et ajouter dans un tube de 1,5 avec 500 µL d’eau stérile.</li>
		<li>Ajouter des perles de verre stérile de 10 – 15 sur une plaque rectangulaire de YAPD. Ajouter la suspension de levure sur la plaque et secouer énergiquement dans toutes les directions pendant 1 min pour s’assurer que la levure se propage à travers toute la plaque.</li>
		<li>Inverser la plaque immédiatement et tapoter afin que les perles aller au couvercle. Enlever et recycler les perles.</li>
		<li>Sac les plaques et incuber agar-côté vers le bas pendant 1 à 2 jours à 30 ° C. Puis passez à l’étape correspondante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Accouplement de levure ADN-appâts et TF tableau souches
	<ol>
<li>Transférer le tableau TF dans une plaque rectangulaire de YAPD avec le robot. Sélectionnez la gélose 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup . Chaque plaque de tableau TF peut être utilisé pour transférer aux plaques de YAPD de 3 – 4 (selon le nombre de plaques dans le tableau). Les plaques de tableau TF utilisés pour l’accouplement doivent être âgé de 2 à 3 jours mais pas plus que l’accouplement peuvent être inefficace.</li>
		<li>Transférer la pelouse d’une souche ADN-appât pour les plaques YAPD contenant déjà le tableau TF avec le robot. Sélectionnez la gélose 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme Répliquer beaucoup . Utilisent un décalage aléatoire dans la source d’un rayon de ~0.6 mm pour éviter de prendre la levure au même endroit et mélanger à la cible pour faciliter le contact entre les souches de levures. Utiliser la pelouse contenant les souches d’ADN-appâts (section 3.1) comme source, et les plaques YAPD contenant le tableau TF repéré à l’étape 3.2.1 comme cible.</li>
		<li>Sac les plaques et incuber les agar-à 30 ° C pendant 1 nuit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sélection de levure diploïde
	<ol>
<li>Transférer la levure collée sur les plaques YAPD aux plaques de −Trp Sc −U avec le robot. Sélectionnez la gélose 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme à répliquer . Mélanger sur la source et cible.</li>
		<li>Sac les plaques et incuber les agar-à 30 ° C pendant 2 – 3 jours (plus longue incubation mène à activité de journaliste de fond élevé).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transfert aux plaques de lecture
	<ol>
<li>Transférer la levure diploïde des plaques −Trp Sc −U au lecture plaques rectangulaires Sc −U −H −Trp + 5mM 3AT + 0,4 mM X-gal à l’aide du robot. Sélectionnez les géloses 1 536 comme source et cible et le tampon de 1 536 pieu court. Sélectionnez le programme à répliquer .</li>
		<li>Sac les plaques et incuber les agar-à 30 ° C pendant 7 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Imagerie des plaques de lecture
	<ol>
<li>Pour les souches d’ADN-appât avec activité de journaliste de haut fond, prendre des photos 2, 3 et 4 jours. Sinon, prendre des photos 4 et 7 jours. Des interactions positives sont identifiées par la couleur bleu et la croissance des colonies levure et peuvent être vérifiées manuellement, ou il peut être déterminé à l’aide de logiciels d’analyse image.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

L’approche de dépistage accouplement eY1H robotique décrit ici grandement augmente le débit afin d’identifier l’ensemble des TFs qui se lient à une région d’intérêt, par rapport à la précédente projection de bibliothèque ou approches de dépistage déployèrent basées sur la transformation de l’ADN. En outre, les interactions ADN-TF détectées par eY1H les dosages sont hautement reproductibles comme 90 % des interactions détectées sont positifs pour tous les quatre colonies testées par TF, et 90 % des interactions retester d...

Un problème central dans le domaine biomédical consiste à déterminer les mécanismes par lequel chaque gène humain est réglementé. La transcription est la première étape dans le contrôle des niveaux d’expression de gène, et elle est régulée par des ensembles de facteurs de transcription (TFs) qui sont uniques à chaque gène. Étant donné que les humains codent pour > 1 500 TFs1,2, identifier l’ensemble des TFs qui contrôlent l’expression de chaque gène reste un défi ouvert.
Deux types de méthodes permet de mapper des interactions ADN-TF : méthodes TF-centrée et axée sur l’ADN3 (Figure 1 a). Dans les méthodes axées sur la TF, TF d’intérêt est sondé pour lier à des régions d’ADN génomiques ou pour déterminer sa spécificité de liaison de l’ADN. Ces méthodes incluent immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) suivie de séquençage haut-débit, protéine liant microarrays et SELEX4,5,6. Dans les méthodes axées sur l’ADN, une séquence d’ADN d’intérêt est sondée pour déterminer l’ensemble des TFs qui se lient à la séquence d’ADN. La plus largement appliquée de telles méthodes est essais (Y1H) de levure un hybride, quelles interactions entre TFs et ADN régions sont testées dans le milieu du noyau de la levure à l’aide de gènes de journaliste pour7,8,9.
Y1H essais comportent deux volets : un « ADN-appât » (p. ex., promoteurs, exhausteurs, silencieux, etc.) et une « TF-proie, » ce qui peut être projetée pour le journaliste gene activation9,10 (Figure 1 b). L’ADN-appât est cloné en amont du reporter deux gènes (LacZ et HIS3) et les deux constructions de DNA-bait::reporter sont intégrées dans le génome de la levure pour générer des chromatinized « ADN-appât souches. » La TF-proie, encodée dans un plasmide qui exprime une TF fusionné au domaine d’activation (AD) de la levure Gal4 TF, est introduite dans la souche ADN-appât pour pêcher des interactions ADN-TF. Si la TF-proie se lie à la séquence de l’ADN-appât, puis l’annonce présente dans la TF-proie entraînera l’activation de ces deux gènes rapporteurs. Ainsi, les cellules avec une interaction positive peuvent être sélectionnés pour la croissance sur plaques manque histidine, mais aussi de surmonter un inhibiteur compétitif, 3-Amino-1,2,4-triazole (3-AT) et visualisées comme colonies bleues en présence de le X-gal. Parce que la levure puissante Gal4 AD est utilisé, Y1H essais peuvent détecter des interactions impliquant des activateurs de la transcriptionnelles, mais aussi des répresseurs. En outre, étant donné que TF-proies sont exprimés à partir d’un promoteur fort levure (ADH1), des interactions peuvent être détectées même pour TFs qui ont des niveaux de faible expression endogènes, qui sont difficiles à détecter par puce11,12.
Plus les protocoles publiés pour effectuer des essais de Y1H reposent sur introduction TF-proies dans les souches de levure ADN-appât en transformant regroupées TF-proie bibliothèques, suivies par la sélection, la colonie cueillette et séquençage d’identifier l’interaction TF ou par transformer des clones8,9. Voici les protocoles chronophages, limitant le nombre de séquences d’ADN qui peuvent être testés par chercheur. Une amélioration récente des essais de Y1H, appelé enhanced Y1H (eY1H), a considérablement accru le débit de dépistage à l’aide d’une plateforme robotique de haute densité (HDA) de tableau se pour accoupler des souches de levures ADN-appât avec une collection de souches de levures, chacune exprimant un autre TF-proie10,13 (Figure 1). Ces écrans emploient une colonie 1 536 format permettant de tester TFs plus humaines en quatre exemplaires, à l’aide de seulement trois besants. En outre, étant donné que les interactions ADN-TF sont analysées d’une manière par paires, cette approche permet de comparer les interactions entre l’ADN-appâts (par exemple, deux variantes de nucléotides non codantes) et entre différents TFs ou TF variantes11,12 ,,14.
Utilisant l’eY1H, nous avons délimité l’homme plus grand et Caenorhabditis elegans TF-ADN ADN-centrée interactions entre réseaux à ce jour. En particulier, nous avons identifié 2 230 interactions entre 246 exhausteurs de développement humains et 283 TFs12. En outre, nous avons utilisé des épreuves d’eY1H pour découvrir la liaison TF modifiée à 109 variantes non codantes nucléotide, associées à des maladies génétiques telles que la malformation du développement, le cancer et des troubles neurologiques. Plus récemment, nous avons utilisé eY1H pour délimiter un réseau comprenant 21 714 interactions entre 2 576 promoteurs de gènes de c. elegans et 366 TFs11. Ce réseau a contribué à révéler le rôle fonctionnel de dizaines de c. elegans TFs.
Les protocoles pour générer des taches de l’ADN-appâts et évaluer les niveaux d’activité de journaliste de fond ont été signalés ailleurs15,16,17. Nous décrivons ici un pipeline eY1H qui peut être utilisé pour n’importe quelle région d’ADN génomique humaine contre un tableau de 1 086 TFs humaines de l’écran. Une fois une levure souche ADN-appât est générée et un tableau de TF-proies est repéré sur les plaques correspondantes, l’ensemble du protocole peut être effectué en deux semaines (tableau 1). Plus important encore, le protocole peut être parallélisé afin qu’un seul chercheur peut dépister 60 séquences ADN-appât en même temps. Pour illustrer le protocole, les auteurs ont criblé les promoteurs des deux gènes de cytokines CCL15 et IL17F. En outre, nous montrons résultats à partir des écrans ayant échouées pour illustrer les types de problèmes qui peuvent survenir lors de l’exécution des essais eY1H et comment les résoudre.

<table><tbody><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td><td>Sigma</td><td>A8056-100G</td><td>Inhibiteur compétitif pour les produits du gène HIS3</td>Sulfate</tr><tr><td>d’adénine (hémisulfate), dihydraté</td><td>US Biologicals</td><td>A0865</td><td>Nécessaire pour une bonne croissance de la levure</td></tr><tr><td>Gélose Haute résistance du gel - Qualité bactériologique</td><td>American International Chemical</td><td>AGHGUP</td><td>Milieu nutritif pour la croissance de la levure</td>Sulfate d’ammonium</tr><tr><td></td><td>US Biologicals</td><td>A1450</td><td>Source d’azote dans un milieu de levure synthétique</td></tr><tr><td>D+ Glucose Anhydre</td><td>US Biologicals</td><td>G3050</td><td>Nécessaire pour la croissance de la levure</td></tr><tr><td>Drop-Out Mix moins His, Leu, Tryp et Uracil, riche en adénine sans base d’azote de levure</td><td>US Biologicals</td><td>D9540-02</td><td>Milieu complet synthétique requis pour</td></tr> le bord de croissance de la levure <tr><td>pH multiparamètre</td><td>Hanna Instruments</td><td>HI2020-01</td><td>Pour mesurer le pH d’un milieu sélectif</td></tr><tr><td>Cure-dents plats 750 ct</td><td>Diamant</td><td></td><td>Pour strier les levures sur les pétrix</td></tr><tr><td>Perles de verre</td><td>Walter Stern</td><td>100C</td><td>Pour spreger les levures lors de la fabrication des pelouses</td></tr><tr><td>Glycérol &ge ; 99 %</td><td>Millipore Sigma</td><td>G9012-1L</td><td>Nécessaire pour fabriquer des souches de levure congelées</td></tr><tr><td>L-Histidine</td><td>US Biologicals</td><td>H5100</td><td>Pour la sélection de la croissance de la levure dans un milieu sélectif</td></tr><tr><td>L-Leucine</td><td>US Biologicals</td><td>L2020-05</td><td>Pour la sélection de la croissance de la levure dans un milieu sélectif</td></tr><tr><td>L-Tryptophane</td><td>Sigma</td><td>T-0254</td><td>Pour la sélection de la croissance de la levure dans un milieu sélectif</td></tr><tr><td>N, N-Diméthylformamide</td><td>Sigma</td><td>319937-1L</td><td>Pour faire une solution X-gal</td></tr><tr><td>Omnipense Elite</td><td>Wheaton</td><td>W375030-A</td><td>Pour distribuer des volumes précis de milieux dans des plaques Singer</td></tr><tr><td>Peptone, Bactériologique</td><td>Américain International Chimique</td><td>PEBAUP</td><td>Source de protéines nécessaire à la croissance de la levure</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri, 150 mm x15 mm</td><td>VWR</td><td>10753-950</td><td>Pour la culture d’appâts à levure pour criblage</td></tr><tr><td>PlusPlates</td><td>Singer Instruments</td><td>PLU-003</td><td>Pour fabriquer des plaques de gélose rectangulaires à utiliser avec Singer</td></tr><tr><td>Robot Precision Low Temperature BOD Incubateur réfrigéré</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PR205745R</td><td>Pour incuber des plaques de levure à température constante</td></tr><tr><td>RePads 1 536</td><td>shorts Singer Instruments</td><td>REP-005</td><td>Pour transférer le réseau TF-proie, la levure d’accouplement et la levure de transfert vers des plaques de sélection et de lecture diploïdes</td></tr><tr><td>RePads 384 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-004</td><td>Pour transférer le réseau TF-proie de 384 à 1 536 format de colonie</td></tr><tr><td>RePads 96 long</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-001</td><td>Pour transférer le réseau TF-proie du stock de glycérol à la plaque de gélose</td></tr><tr><td>RePads 96 short</td><td>Singer Instruments</td><td>REP-002</td><td>Pour le transfert d’un réseau de proies TF de 96 à 384 colonies</td></tr><tr><td>Robot Singer HDA RoToR</td><td>Singer Instruments</td><td></td><td>Pour le transfert de levures à haut débit</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (granulés/certifié ACS)</td><td>Fisher</td><td>S318-1</td><td>Pour ajuster le pH des milieux sélectifs</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique heptahydraté</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-203402C</td><td>Requis pour l’activité du rapporteur LacZ sur X-gal&nbsp;</td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique monohydraté</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202342B</td><td>Requis pour l’activité du rapporteur LacZ sur X-gal&nbsp ;</td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Sigma</td><td>U0750-100G</td><td>Pour la sélection de la croissance des levures dans des milieux sélectifs</td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>X4281C100</td><td>&beta ;-galactosidase devient bleu X-gal incolore pour détecter l’interaction protéine-ADN</td></tr><tr><td>Extrait de levure</td><td>US Biologicals</td><td>Y2010</td><td>Milieu nutritif pour la croissance et la propagation de la levure</td></tr><tr><td>Base d’azote de levure (poudre) sans AA, glucides et sans AS&nbsp ;</td><td>US Biologicals</td><td>Y2030</td><td>Requis pour une croissance vigoureuse des levures</td></tr></tbody></table>

Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de transcription lie à des séquences de l’adn humain

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

Identifier les ensembles de facteurs de transcription (TFs) qui régissent chaque gène humain est une tâche ardue qui nécessite l’intégration de nombreuses approches expérimentales et informatiques. Une de ces méthodes est l’essai (Y1H) un hybride de levure, quelles interactions entre TFs et ADN régions sont testées dans le milieu du noyau de la levure à l’aide de gènes rapporteurs. Y1H essais comportent deux volets : un « ADN-appât » (par exemple., promoteurs, exhausteurs, silencieux, etc.) et une « TF-proie, » qui peut être projetée pour l’activation du gène rapporteur. Plus les protocoles publiés pour l’exécution de Y1H écrans sont basées sur la transformation des bibliothèques TF-proies ou des tableaux dans les souches de levures ADN-appât. Ici, nous décrivons une canalisation, appelée Y1H améliorée (eY1H) essais, où les interactions ADN-TF sont interrogées par l’accouplement d’ADN-appât souches avec une collection déployèrent de souches de TF-proies à l’aide d’une matrice haute densité plate-forme de robotique (HDA) qui permet le dépistage dans un 1 536 format de la colonie. Ce qui permet une augmentation dramatique du débit (60 séquences ADN-appâts contre > 1 000 TFs prend deux semaines par chercheur) et reproductibilité. Nous illustrons les différents types de résultats escomptés en testant les séquences promoteur humain contre un tableau de 1 086 TFs humaines, ainsi que des exemples des problèmes qui peuvent survenir pendant les écrans et comment les résoudre.

Trois facteurs principaux sont à considérer lorsque analyse résulte d’essais d’eY1H : l’activité de journaliste d’arrière-plan de la souche ADN-appât, la force de l’activité de journaliste, correspondant à des interactions ADN-TF et le nombre de colonies positives. L’activité de journaliste d’arrière-plan (p. ex., autoactivity) de la souche ADN-appât se réfère à la croissance globale et la couleur des colonies de levure la plaque de lecture, même en l’absence d’un TF-proie. Idéalement, non-autoactive souches présentent u...

Nous présentons ici une levure améliorée hybride un filtrage de protocole afin d’identifier les facteurs de transcription (TFs) qui peuvent se lier à une région d’ADN humaine d’intérêt. Cette méthode utilise un pipeline de criblage à haut débit qui peut interroger la liaison de > 1 000 TFs dans une expérience simple.

Écrans un hybride levure améliorée afin d’identifier le facteur de Transcription lie à des séquences de l’ADN humain

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

L’objectif des tests hybrides à levures améliorées est d’identifier l’ensemble des facteurs de transcription qui se lient à une séquence d’ADN d’intérêt. L’avantage de cette technique est que la levure améliorée un-hybride analyses peuvent évaluer plus de 1000 facteurs de transcription dans une seule expérience. Inversement, l’immunoprécipitation de la chromatine n’évalue qu’un seul facteur de transcription à la fois.Cette méthode constitue un outil clé pour la génomique fonctionnelle afin d’identifier le répertoire des facteurs de transcription qui se lient aux promoteurs et exhausteurs de gènes et d’identifier les facteurs de transcription modifiés se liant aux variantes non codantes. La démonstration de la procédure sera le Dr Xing Liu un postdoc de mon laboratoire. Décongeler les plaques de bouillon de glycérol de levure avec le tableau des proies TF sur la glace.Resuspendez la levure à l’aide d’une pipette à 12 canaux et passez à l’étape suivante dans un délai de 1 à 3 minutes. Pour repérer la levure dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, utilisez un robot de tableau à haute densité pour sélectionner multiwell 96 plaques comme source, 96 plaques d’agar comme cible, et 96 longs tampons d’épingle. Les tablettes ne sont pas réutilisables et doivent être jetées.Sélectionnez le programme Spot Many pour faire deux copies par plaque de puits 96. N’utilisez pas les options de recyclage ou de revisiter pour éviter la contamination arrière des stocks congelés. En outre, sélectionnez l’option de tourbillonner de haut en bas dans la source pour mélanger la levure.Suivez les instructions pour où et quand placer les plaques et permettre au robot de repérer la levure dans sc moins les plaques rectangulaires tryptophane. Sac le tableau tacheté et l’incuber côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 2 à 3 jours. Pour générer 384 rangées de colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, sélectionnez 96 plaques d’agar comme source, 384 plaques d’agar comme cible et 96 tampons à broches courtes.Sélectionnez ensuite le programme source unique de 1:4 tableau. De cette façon, quatre 96 plaques de colonie seront regroupées en une seule plaque de 384 colonies. N’utilisez pas les options de recyclage ou de revisiter pour éviter la contamination entre différentes plaques.Sac les plaques et incuber le tacheté 384 colonie array agar côté jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 2 jours. Pour générer 1536 rangées de colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, sélectionnez 384 plaques d’agar comme source, les plaques d’agar de 1536 comme cible et 384 tampons à broches courtes. Sélectionnez ensuite le programme source unique d’analyse 1:4.L’objectif est de copier chaque colonie en quatre colonies pour obtenir des quadruplicates. Utilisez les options de recyclage et de revisiter car il s’agit de copier chaque colonie 4 fois. Suivez les instructions du robot et permettre au robot de repérer la levure dans les plaques avant d’ensachage et d’incubation de la colonie repérée 1536 bord de colonie côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 3 jours.Pour amplifier le tableau de 1536 colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane, sélectionnez 1536 plaques d’agar comme source, 1536 plaques d’agar comme cible et 1536 tampons à broches courtes. Sélectionnez le programme Replicate Many pour reproduire 3 à 4 copies. Utilisez l’option recycler et revoir, mais jetez le tampon lors du passage à une plaque différente du tableau pour éviter la contamination croisée.Permettre au robot d’amplifier le tableau de 1536 colonies dans les plaques rectangulaires sc moins tryptophane. Enfin, sac les plaques et incuber le tacheté 1536 colonie array agar côté jusqu’à 30 degrés Celsius pendant 3 jours à utiliser pour les étapes d’accouplement. Pour préparer les pelouses souches d’appâts d’ADN pour l’accouplement, repérer les souches d’appâts de levure d’ADN sur une plaque sc moins uracil et histidine et de croître pendant 3 jours à 30 degrés Celsius.Stries de la levure dans un 15 centimètre Sc moins uracil et plaque d’histidine à l’aide d’un cure-dent stérile de sorte que chaque plaque s’adapte à 12 à 16 souches différentes. Incuber la plaque un jour à 30 degrés Celsius. Le lendemain, stries de la levure dans un 15 centimètre Sc moins uracil et plaque d’histidine à l’aide d’un cure-dent stérile de sorte que chaque plaque s’adapte à 4 souches différentes.Incuber la plaque pendant une journée à 30 degrés Celsius. Après l’incubation, racler la levure à l’aide d’un cure-dent stérile, en s’assurant de ne pas gratter toute agar. Ajouter la levure dans un tube de 1,5 millilitre avec 500 microlitres d’eau stérile.Maintenant, ajoutez 10 à 15 perles de verre stériles et la suspension de levure sur une plaque rectangulaire YAPD. Agiter soigneusement dans toutes les directions pendant une minute pour s’assurer que la levure est étalée dans toute la plaque. Inversez immédiatement la plaque et appuyez sur pour que les perles aillent au couvercle.Retirer et recycler les perles. Sac les assiettes et les incuber côté agar vers le bas pendant 1 à 2 jours à 30 degrés Celsius. Ensuite, passez à l’étape de l’accouplement.Pour accoupler les souches d’appâts d’ADN de levure et de réseau TF, transférez le tableau TF à une plaque rectangulaire YAPD avec le robot. Sélectionnez la plaque d’agar de 1536 comme source et cible, ainsi que le tampon à broches courtes de 1536. Sélectionnez le programme Replicate Many.Sélectionnez 4 plaques sources et recyclez et revisitez les options. Chaque plaque de tableau TF peut être utilisée pour transférer 3 à 4 plaques YAPD. Les plaques de tableau TF utilisées pour l’accouplement doivent avoir de 2 à 3 jours, mais pas plus car l’accouplement peut être inefficace.Pour transférer la pelouse d’une souche d’appât d’ADN aux plaques de YAPD contenant déjà le tableau de TF, sélectionnez la plaque d’agar de 1536 comme source et cible et la garniture courte de 1536 goupilles courtes. Sélectionnez le programme Replicate Many. Utilisez un décalage aléatoire dans la source avec un rayon d’environ 0,6 millimètre pour éviter de prendre de la levure au même endroit et sélectionnez Mix on Target pour faciliter le contact entre les souches de levure.Utilisez la pelouse contenant les souches d’appâts d’ADN comme source, et les plaques yapd contenant le tableau tacheté TF comme cible avant d’ensachage des plaques et de les incuber côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pendant une journée. Pour la sélection de levure diploïde, sélectionnez la plaque d’agar de 1536 comme source et cible, et sélectionnez le tampon de 1536 broches courtes. Sélectionnez le programme Replicate.Sélectionnez Mix sur Source et sur Target. Permettre au robot de transférer la levure accouprée des plaques YAPD à l’uracil Sc moins et les plaques de tryptophane avant d’ensachage des plaques et de les incuber côté agar vers le haut à 30 degrés Celsius pendant 2 à 3 jours. Maintenant, sélectionnez les 1536 plaques d’agar comme source et cible et le bloc-goupille court de 1536.Sélectionnez le programme Replicate. Transférer la levure diploïde de l’uracil Sc moins et les plaques de tryptophane à la lecture rectangulaire 3-AT et X-gal contenant des plaques à l’aide du robot. Sac les assiettes et les incuber côté agar jusqu’à 30 degrés Celsius pour un jusqu’à 7 jours.Pour les souches d’appâts d’ADN avec l’activité de journaliste de fond élevé, prenez des photos les jours 2, 3 et 4. Sinon, prenez des photos aux jours 4 et 7. Gardez les plaques de tableau TF à température ambiante et copiez à nouveau après 7 jours pour une nouvelle série de dépistage.Pour illustrer le type de résultats qui peuvent être obtenus à l’aide d’analyses hybrides à levures améliorées, les régions promotrices des gènes CCL15 et IL17F ont été examinées contre un éventail de 1086 TF humains. Le promoteur du CCL15 est un exemple d’appât d’ADN non autoactif, où les interactions, même faibles, peuvent être facilement détectées. Le promoteur il17F est un exemple d’appât d’ADN autoactif avec une activité inégale de reporter de fond où certaines interactions peuvent être détectées, tandis que pour plusieurs FT, il n’est pas certain que l’activité du journaliste est plus élevée que l’arrière-plan.Il ya plusieurs problèmes qui peuvent se produire lors de l’exécution de levure améliorée un-hybride analyses. Dans ce cas, les colonies sont trop petites et n’ont pas été transférées. En règle générale, environ 95 % des colonies de proies de la FO affichent une croissance normale.Dans cet exemple, il n’y a pas de croissance de levure dans une partie de la plaque. Ce problème est généralement lié à une défaillance dans l’étape d’accouplement si le tampon de goupille 1536 ne parvient pas à entrer en contact avec la levure dans la pelouse de souche d’appât d’ADN, dans le tableau de TF, ou dans la plaque d’accouplement. Dans ces deux exemples, aucune interaction n’est détectée.Ce problème est souvent lié soit à des mutations involontaires inactivant dans les gènes de reporter, en particulier LacZ, ou à une autoactivité trop élevée qui masque les interactions. Dans ce cas, la plaque présente des taches bleues aléatoires qui sont souvent liées à la contamination bactérienne. La chose la plus importante à considérer est la préparation appropriée de plaque.S’assurer que tous les composants sont ajoutés et que la hauteur de l’agar est uniforme car toutes les étapes ultérieures en dépendent. Bien que la plupart des reagents ne soient pas dangereux, il est important de porter des gants en tout temps pour éviter la contamination des échantillons et des assiettes. Comme pour tout test de liaison de l’ADN, il est important de valider les interactions identifiées à l’aide d’analyses fonctionnelles telles que des analyses de journaliste, le knockdown de facteur de transcription ou ko, suivi de la mesure de l’expression du gène cible.Cette méthode a permis d’identifier les facteurs de transcription qui régulent les gènes impliqués dans des processus biologiques particuliers ainsi que les facteurs de transcription avec une liaison alternative aux variantes associées à la maladie non codant.

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