Name: Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Découvrez la culture d'entéroïdes humains pour modéliser l'entérocolite nécrosante en utilisant des cellules souches intestinales néonatales. Cette méthode permet d'étudier les réponses inflammatoires et de tester des agents thérapeutiques.

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Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Institute, de diabète et Digestive et rénale maladie Grant (K08DK106450), le Jay Grosfeld le prix de l’Association américaine de chirurgie pédiatrique de C.J.H.

Approbation du Conseil d’examen de l’établissement a été obtenue (CISR #2013-15152) pour la collecte d’échantillons de tissus de patients devant subir une résection de l’intestin à Ann et Robert H. Lurie Children Hospital de Chicago, Chicago, Illinois. Tous les protocoles ont été effectuées conformément aux lignes directrices nationales et institutionnelles et règlements pour le bien-être de l’humanité. Consentement parental éclairé écrit était requise et obtenu avant le prélèvement des échantillons dans tous les cas.
1. préparation du réactif
<ol><li>Préparer la solution mère de milieux de Culture pour la collection de tissus entiers : 1 L de Dulbecco modifié Eagle (DMEM), 110 mL de fœtale Bovine sérique (FBS), 11 mL de pénicilline-streptomycine (concentration finale de 1 %) et 1,1 mL d’insuline stérilisée par filtration (concentration finale de 0,1 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer la chélation tampon #1 : 30 mL de milieu de Culture (comme décrit au point 1.1), 600 µL de 0,5 M d’acide Tétraacétique (EDTA) (concentration finale 10 mM), 300 µL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer la chélation tampon #2 : 30 mL de milieu de Culture (comme décrit au point 1.1), 300 µL de 0,5 M EDTA (concentration finale de 5mM), 300 µL de gentamicine (concentration finale de 1 %) et 60 µL d’amphotéricine B (concentration finale de 0,2 %). Stocker la solution-mère à 4 ° C.</li>
	<li>Préparer les milieux de Minigut humaine : 41,4 mL de DMEM/F-12, 5 mL de FBS (derniers 10 %), 500 µL de pénicilline-streptomycine (concentration finale 1 %), 500 µL de L-glutamine (concentration finale 1 %), 500 µL de gentamicine (concentration finale 1 %), 100 µL de l’amphotéricine B (final concentration 0,2 %), 500 µL de 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonique (HEPES) (concentration finale 10 mM), supplément de 500 µL de 100 x N-2 et 1 mL de 50 x B-27 supplément moins de vitamine A pour un volume total de 50 mL. Solution stock de la boutique à-20 ° C.</li>
	<li>Préparer les humains Minigut Media Complete : 10 mL d’humain Minigut Media (préparée en 1.4), 10 µL de 100 µg/mL Wnt3a (concentration finale 100 ng/mL), 10 µL de 100 µg/mL caboche (concentration finale 100 ng/mL), 10 µL de 1 mg/mL R-Spondin (concentration finale 1 µg/mL) , 10 µL de 500 µg/mL de facteur de croissance épidermique (EGF) (concentration finale 50 ng/mL), 10 µL de 1 M N-acétylcystéine (concentration finale de 1 mM), 10 µL de 10 mM Y-27632 (concentration finale 10 µM), 10 µL de 500 µM A-83 (concentration finale 500 nM), 10 µL de 10 mM (final SB202190 concentration de 10 µM), 100 µL de 1 M Nicotinamide (concentration finale 10 mM) et 1 µL de 100 µM [leu] 15-gastrine 1 (concentration finale 10 nM). Volume total 10 mL. Stocker la solution-mère à 4 ° C. Remarque : Des solutions doivent être utilisées sous 48 h.</li>
</ol>2. crypte Isolation et le placage du tissu entier
<ol><li>
Au moment de la collecte dans la suite du dispositif, placer l’échantillon de tissu intestinal petit humain dans de Dulbecco froid Phosphate Buffered Saline (SPD). Laver l’échantillon au SPD froid jusqu’au clair de selles et de sang. Stocker l’échantillon à 4 ° C dans un milieu RPMI 1640 jusqu’au moment de l’isolement de la crypte. Remarque : Les tissus ne peuvent être stockés plus de 24h.<ol>
<li>S’assurer que l’échantillon est clair de selles et de sang. À l’aide de ciseaux de dissection délicate, enlever tout excès graisses ou chirurgicales agrafes etc.. Peser l’échantillon. Remarque : Viser une pièce environ 0,75 à 2,5 g.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Couper l’échantillon en morceaux de 0,5 cm et placer dans 30 mL de tampon de chélation #1 (tel qu’établi à l’étape 1.2).
	<ol>
<li>Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 ° C.</li>
		<li>Tissu filtrer sur un tamis de cellule 100 µm et jeter les traversent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Ajouter le tissu à 30 mL de tampon de chélation #2 (tel qu’établi à l’étape 1.3).
	<ol>
<li>Agiter à basse vitesse pendant 15 min à 4 ° C.</li>
		<li>Filtre tissu à travers un tamis de cellule de 100 µm et jeter les traversent.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Décongelez les 500 mL de matrice de la membrane basale sur la glace pour une utilisation à l’étape 2.8.</li>
	<li>
Ajouter des tissus à 10 mL de DMEM froid dans un tube conique de 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.
	<ol>
<li>Filtrer à travers un tamis de cellule de 100 µm et recueillir le débit à travers (étiquette #1). Maintenir le tube #1 sur la glace.</li>
		<li>Ajouter des tissus pour un autre 10 mL de DMEM froid dans un tube conique séparé 50 mL et agiter vigoureusement à la main pendant 10 s.</li>
		<li>Filtrer à travers un tamis de cellule de 100 µm et recueillir les flux à travers (label #2).</li>
		<li>Répéter deux fois jusqu'à ce qu’il y a quatre tubes coniques avec accréditives (tubes étiquetés #1-4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Filtre tube #1 solution à travers un 100µm cellule crépine et transfert traversent dans tube conique 15 mL (étiquette #1). Répétez de #2 à 4.
	<ol>
<li>Centrifuger 15 mL tubes #1-4 à 200 x g pendant 15 min à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dans la hotte à flux laminaire, retirez le surnageant de tubes #1-4 et jetez-le. Ne pas perturber le nuage des tissus immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser certains surnageant.
	<ol>
<li>Mélanger ensemble en pipettant également, lentement, le culot avec les restes du surnageant dans les tubes #1-4.</li>
		<li>Transférer le mélange des tubes #1-4 dans un tube conique unique de 2 mL.</li>
		<li>Centrifuger le tube conique à 200 x g pendant 20 min à 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Retirez le surnageant et resuspendre le culot dans 500 µL de matrice de la membrane basale. Remarque : garder la matrice de la membrane basale sur glace en tout temps et travailler rapidement pour les prochaines étapes. Ce produit polymérise très rapidement à la température ambiante.<ol>
<li>Appliquer 50 µL de spécimen/basement membrane matrice suspension au centre d’un puits dans une plaque 24 puits. Elle devra figurer en forme de dôme. Remarque : Utilisation de pointes de pipette réfrigérés favorise transfert plus lisse de la suspension, réduisant au minimum la polymérisation.</li>
		<li>Répéter 9 fois pour remplir 10 puits de totales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Placer la plaque 24 puits à 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant 30 min permettre la polymérisation.</li>
	<li>Ajouter 500 µL de Human Minigut Media complet (tel qu’établi à l’étape 1.5) dans chaque puits. Remplacer tous les 2 jours.</li>
	<li>Recueillir des enteroids après 5-10 jours, quand le bourgeonnement est visualisé. Voir les étapes 4 et 5 pour obtenir des instructions de la collection.</li>
</ol>3 induction of Experimental NEC
<ol><li>Ajouter 10 µL de 5 mg/mL de lipopolysaccharides (LPS) à 500 µL de Human Minigut Media complet (tel qu’établi à l’étape 1.5) dans chaque puits au jour 0. Remplacer tous les 2 jours jusqu'à la collection.</li>
</ol>4. préparation pour l’enrobage de paraffine
<ol><li>
Retirez délicatement les médias.
	<ol>
<li>Ajouter 1 mL de PBS et pipetez doucement haut et bas pour dissoudre la matrice de la membrane basale avec soin ne pas pour lyser les enteroids.</li>
		<li>Centrifuger PBS/enteroid mélange à < 300 x g pendant 5 min à pellet et supprimer les PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajoutez 4 % paraformaldéhyde à difficulté à température ambiante pendant 1 h.</li>
	<li>
Centrifuger à < 300 x g pendant 5 min pour pellet, puis supprimer les PBS.
	<ol>
<li>Laver délicatement avec 1 mL de PBS et centrifuger à < 300 x g pendant 5 min pour pellet, puis supprimer les PBS.</li>
		<li>Répétez l’étape 4.3.1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Faire fondre un volume suffisant du tissu traitement gel (environ 300 µL) en plaçant la quantité désirée dans un tube conique et le réchauffement dans un incubateur bain sec à 65 ° C pendant 3 à 10 min jusqu'à ce que liquide.
	<ol>
<li>Ajouter le tissu traitement gel au culot et mélanger doucement.</li>
		<li>Sur un lamelle couvre-objet, placez un petit anneau de clonage.</li>
		<li>Pipeter le tissu mélange de gel et enteroid de traitement dans un anneau de clonage monté sur un lamelle couvre-objet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Laisser le tissu mélange de gel et enteroid à se solidifier à 4 ° C pendant 1 h de traitement.
	<ol>
<li>Submerger la bague de clonage avec mélange solidifié dans l’éthanol à 70 % en préparation pour l’enrobage de paraffine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Enteroid Collection d’ARN et de protéine d’Extraction
<ol><li>Retirez doucement humaine Minigut Media complet de chaque puits.</li>
	<li>
Ajouter 1 mL de PBS et pipetez doucement haut et bas pour dissoudre la matrice de la membrane basale. Veillez à ne pas dissocier l’enteroids.
	<ol>
<li>Placer PBS/enteroid mélange dans un tube conique stérile de 2 mL.</li>
		<li>Centrifuger à < 300 x g pendant 5 min granuler.</li>
		<li>Retirez délicatement le PBS, en prenant soin de ne pas pour enlever l’enteroids.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Répétez l’étape série 5.2 deux fois plus.</li>
	<li>Congeler à-80 ° C jusqu’au moment de la protéine ou extraction de l’ARN.</li>
	<li>Effectuer le gène expression protéique isolement et de l’enteroids en utilisant bien établie qRT-PCR et les techniques Western Blotting.</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Zachos, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Enteroids%2FColonoids+and+Intestinal+Organoids+Functionally+Recapitulate+Normal+Intestinal+Physiology+and+Pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology.</a> The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine+%28Maywood%29%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+%28Caco-2%29+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).</li>
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<li>Senger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Fetal-Derived+Enterospheres+Provide+Insights+on+Intestinal+Development+and+a+Novel+Model+to+Study+Necrotizing+Enterocolitis+%28NEC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC).</a> Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).</li>
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<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+induction+of+autophagy+in+the+regulation+of+enterocyte+migration+and+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis.</a> The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).</li>
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<li>Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+epithelial+enteroids+and+colonoids+from+whole+tissue+and+biopsy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), 52483(2015).</li>
<li>Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+strategies+in+kidney+regeneration+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Nephrology+and+Hypertension%22%5BJournal%5D)">New strategies in kidney regeneration and tissue engineering.</a> Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).</li>
<li>Leaphart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+TLR4+in+the+pathogenesis+of+necrotizing+enterocolitis+by+modulating+intestinal+injury+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair.</a> The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).</li>
<li>Neal, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterocyte+TLR4+mediates+phagocytosis+and+translocation+of+bacteria+across+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier.</a> The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).</li>
<li>Sodhi, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+Toll-like+receptor+4+regulates+goblet+cell+development+and+is+required+for+necrotizing+enterocolitis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice.</a> Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).</li>
<li>Koo, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+gene+expression+in+primary+Lgr5+organoid+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures.</a> Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce roman ex vivo enteroid intestinal humain modèle sert d’une méthode utile pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière intestinale dans l’entérocolite nécrosante (NEC). Les méthodes de traitement enteroid présentées ici ont été adaptés des travaux précédent du DRS Misty Good, Michael Helmrath et Jason Wertheim10,11,12.
Détails qui entoure l’ensemble prélèvement tissulaire et le calendrier de l’i...

Enteroids humains sont un ex vivo système de culture 3 dimensions généré à partir de cellules souches isolées de cryptes intestinales des échantillons de tissu intestinal humain. Ce modèle révolutionnaire a été lancé par Hans Clevers et coll. en 2007 suite à la découverte de Lgr5 + des cellules souches dans les cryptes de l’intestin grêle dans la souris1. Leur travail a jeté les bases pour l’établissement d’un ex vivo la culture épithéliale intestinale de plusieurs types de cellules qui pourraient être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Depuis cette découverte, enteroids ont servi comme un nouveau modèle pour étudier la physiologie digestive normale et la physiopathologie des maladies intestinales telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, interactions hôte-pathogène et la médecine régénérative,2.
L’utilisation d’enteroids comme un ex vivo de modèle pour l’étude de la physiopathologie intestinale présente plusieurs avantages sur les autres techniques. Pour les dernières décennies, les modèles animaux et lignées cellulaires dérivées de cancer intestinal immortalisées ont servi à étudier la physiologie intestinale3,4,5. Single-cell cultures ne représentent pas la diversité des types de cellules présents dans l’épithélium intestinal normal, manquant ainsi une cellule à la diaphonie et segment-spécificité dans l’expression de la protéine, la signalisation et la maladie induite par l’agent pathogène6. Enteroids les cellules souches se différencient en les principaux types de cellules épithéliales comme les entérocytes, cellules de Paneth, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines et plus3. Ils présentent la polarité, assure les fonctions de transport épithélial et permettant un segment intestinal spécificité6. Étant donné qu’enteroids peut récapituler les multiples types de cellules de l’épithélium intestinal humain, ils sont capables de surmonter cette limitation reconnue des systèmes basés sur les cellules de cancer. Au fil du temps, dérivés de lignées cellulaires sont sous-cloné et d’évoluent pour exposer une plus grande diversité d’expression et la localisation protéine3. Au contraire, les enteroids peuvent être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Bien qu’il existent de nombreux modèles animaux pour NEC, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En raison de ces limitations, produits thérapeutiques dérivés de modèles animaux ne parviennent pas à 90 % du temps lorsqu’il est testé dans des essais humains en raison de différences dans la toxicité ou l’efficacité3. Enteroids servir de modèles précliniques prometteurs qui peuvent surmonter ces insuffisances, conduisant à une meilleure compréhension de la physiopathologie intestinale complexe et donc plus efficace et rentables des innovations thérapeutiques. Il y a aussi des éléments de preuve récente que l’âge des tissus qui ont un enteroid est généré reste biologiquement importants7. Il s’agit d’un détail particulièrement important pour notre modèle puisque les enteroids sont générés à partir du tissu néonatal, ainsi maintenir la pertinence physiologique aux patients avec NEC.
L’utilité d’enteroids comme modèles de maladies humaines continue à se développer, dans l’espoir de trouver des remèdes aux conditions graves et profondes. L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice intestinale des nouveaux-nés que se caractérise par une nécrose intestinale et fréquemment conduit à la perforation de la paroi intestinale, septicémie et mort8. En raison de la physiopathologie complexe et multifactorielle de l’entérocolite Nécrosante, le mécanisme exact de la maladie n'a pas encore été complètement élucidé ; Cependant, une augmentation de la perméabilité intestinale a été clairement impliquée dans le processus de la maladie8. Étant donné que l’étude de NEC et agents thérapeutiques potentiels est éthiquement difficile sur des sujets humains, en particulier les enfants, il est hautement souhaitable d’utiliser un modèle d’enteroid biologiquement pertinente de NEC à l’aide de tissus humains néonatale. Jusqu’ici, les enteroids ont un rôle limité dans l’étude de l’entérocolite Nécrosante. Ce protocole décrit l’utilisation d’enteroids provenant d’échantillons de tissu intestinal humain comme un roman ex vivo de modèle pour l’étude de l’entérocolite nécrosante.

<table><tbody><tr><td>4 % Paraformaldéhyde</td><td>ThermoFisher</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>A-83</td><td>R& D Tocris</td><td>2939/10</td><td></td></tr><tr><td>Amphotéricine B</td><td>ThermoFisher</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>supplément B-27 moins vitamine A</td><td>ThermoFisher</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Matrice de membrane basale (Matrigel)</td><td>Corning</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher</td><td>MT-16-405-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>11-965-118</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique (EGF)</td><td>Sigma</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal de bovin (FBS)</td><td>Gemini Bio-Pro</td><td>100-125</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Sigma</td><td>G5013-1G</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX ( L-glutamine)</td><td>ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>I9278-5mL</td><td></td></tr><tr><td>[leu] 15-gastrin 1</td><td>Sigma</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharide (LPS)</td><td>Sigma</td><td>L2630-25MG</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplément</td><td>ThermoFisher</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-2-hydroxyéthylpipérazine-N-2-éthane sulfonique (HEPES)</td><td>ThermoFisher</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>N-acétylcystéine</td><td>Sigma</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma</td><td>N0636-100G</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>R& D Systems INC</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>ThermoFisher</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P5368-5X10PAK</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin</td><td>PEPROTECH INC</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Gel de traitement tissulaire (Histogel)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-110-678</td><td></td></tr><tr><td>Wnt3a</td><td>R& D Systems INC</td><td>5036-WN-010</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr></tbody></table>

un nouveau modèle de enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice chez le nouveau-né. Il se caractérise par plusieurs altérations physiopathologiques de l’épithélium intestinal humain, conduisant à une augmentation de la perméabilité intestinale, avec facultés affaiblies de restitution et a augmenté la mort cellulaire. Bien qu’il existe de nombreux modèles animaux de l’entérocolite Nécrosante, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En outre, il est éthiquement difficile d’étudier la physiopathologie de la maladie ou de nouveaux agents thérapeutiques directement sur des sujets humains, en particulier les enfants. Par conséquent, il est hautement souhaitable d’élaborer un nouveau modèle de NEC à l’aide de tissus humains. Enteroids y a 3 dimensions organoïdes dérivées de cellules épithéliales intestinales. Elles sont idéales pour l’étude des interactions physiologiques complexes, la signalisation cellulaire et de la défense de l’hôte-pathogène. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole cette enteroids humaine de cultures après isoler des cellules souches intestinales des patients devant subir une résection de l’intestin. Les cellules des cryptes sont cultivées dans des milieux contenant des facteurs de croissance favorisant la différenciation dans le natif de types différentes cellules de l’épithélium intestinal humain. Ces cellules sont cultivés dans un mélange synthétique, collagène de protéines qui servent comme un échafaudage, imitant la membrane basale extra-cellulaires. Ainsi, enteroids développer apicale-basolatérale polarité. L’administration concomitante du lipopolysaccharide (LPS) dans les médias provoque une réaction inflammatoire dans l’enteroids, menant à histologique, génétiques et altérations d’expression de protéines similaires à celles observées chez les humain NEC. Un modèle expérimental de NEC à l’aide de tissus humains peut fournir une plateforme plus précise pour les médicaments et traitements tests avant les essais chez l’homme, nous nous efforçons d’identifier un remède pour cette maladie.

Immédiatement après l’ensemencement, les cryptes intestinales fraîchement isolés apparaissent sous forme de tiges allongées. Dans les heures, l’enteroid aura une apparence ronde (Figure 1a). Au cours des prochains jours, l’enteroids va commencer formant des sphères comme on le voit dans la Figure 1b. En herbe doit avoir lieu entre 5-10 jours (Figure 1c</stron...

Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.

Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Les entéroïdes sont des organoïdes tridimensionnels dérivés de cellules épithéliales intestinales. Ils sont idéaux pour l’étude des interactions physiologiques complexes, de la signalisation cellulaire, et de la défense d’agent pathogène d’hôte. Notre protocole décrit comment cultiver les entéroïdes humains après isoler les cellules souches intestinales des patients subissant la résection intestinale.La co-administration du lipopolysaccharide dans nos médias de culture cause une réponse inflammatoire dans les enteroids menant aux changements histologiques, génétiques, et d’expression de protéine semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine. Étant donné que l’étude de l’entérocolite nécrosante et des agents thérapeutiques potentiels est éthiquement difficile chez les sujets humains, en particulier chez les enfants, il est hautement souhaitable d’utiliser ce nouveau modèle entéroïde biologiquement pertinent de l’entérocolite nécrosante utilisant le tissu néonatal humain. Le principal avantage de cette technique est que les entéroïdes sont capables de récapituler les multiples types de cellules de l’épithélium intestinal humain et sont capables de surmonter les limitations reconnues des modèles animaux et des systèmes cellulaires.Christie Buonpane, résidente en chirurgie, et Carrie Yuan, technicienne de laboratoire de notre laboratoire, contribueront à démontrer l’intervention. Au moment de la collecte dans la suite opératoire, placez le petit échantillon de tissu intestinal humain dans le DPBS froid. Lavez le spécimen dans le DPBS froid jusqu’à ce qu’il soit dégagé du sang et des selles.Conservez le spécimen dans le milieu RPMI 1640 à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’il soit prêt pour l’isolement de la crypte. Lorsque vous êtes prêt à procéder, vérifiez à nouveau que le spécimen est dégagé des selles et du sang. À l’aide de ciseaux dissecting délicats enlever tout excès de graisse ou de clips chirurgicaux et agrafes.Weight le spécimen et viser une pièce qui est d’environ 0,75 à 2,5 grammes. Ensuite, coupez le tissu en morceaux de 0,5 centimètre et placez-les dans un tube contenant 30 millilitres de tampon numéro un. Agiter à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Filtrez ensuite le tissu à travers une passoire cellulaire de 100 micromètres et jetez le flux à travers. Ajouter le tissu filtré à un tube contenant 30 millilitres de tampon numéro deux. Agiter à basse vitesse pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Filtrer le tissu à travers un filtre de 100 micromètres et jeter le flux à travers. Après cela, décongeler 500 microlitres de matrice membranaire du sous-sol sur la glace pour une utilisation ultérieure. Ajouter un peu de tissu à 10 millilitres de DMEM froid dans un tube conique de 50 millilitres et agiter vigoureusement à la main pendant 10 secondes.Filtrer cette suspension à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et recueillir le flux à travers. Gardez ce tube sur la glace. Ajouter un peu de tissu à un autre 10 millilitres de DMEM froid dans un tube conique séparé de 50 millilitres et agiter vigoureusement à la main pendant 10 secondes.Filtrer cette suspension à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et recueillir le flux à travers. Répétez le processus deux fois de plus jusqu’à ce qu’il y ait quatre tubes coniques contenant le flux à travers étiqueté un à quatre. Ensuite, filtrer la solution dans le tube numéro un à travers une passoire à cellules de 100 micromètres et transférer le flux à travers dans un tube conique de 15 millilitres également étiqueté numéro un.Répétez ce processus pour les tubes deux à quatre. Centrifugeuse les tubes de 15 millilitres à 200 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Dans le capot d’écoulement laminaire, retirez le supernatant de chaque tube et jetez-le.Évitez de perturber le nuage de tissu immédiatement au-dessus de la pastille, même si cela signifie laisser un peu de surnatant derrière. Dans chaque tube, pipette de haut en bas lentement pour mélanger la pastille avec les restes supernatants. Transférer le mélange de chaque tube dans un seul tube conique de deux millilitres et centrifugeuse à 200 fois G et à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.Après cela, retirez le supernatant et réutilisez la pastille dans 500 microlitres de matrice membranaire prégelée du sous-sol. Utilisez une pointe de pipette réfrigérée pour appliquer 50 microlitres de cette suspension au centre d’un puits dans une plaque de 24 puits. Cet échantillon doit apparaître en forme de dôme.Répétez ce processus de demande neuf fois pour remplir 10 puits totaux. Transférer la plaque de puits 24 dans un incubateur de dioxyde de carbone de 5 % à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes pour permettre la polymérisation. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de miniguts humains complets à chaque puits.Continuez à couver dans les mêmes conditions, en vous assurant de remplacer ce média tous les deux jours. Tout d’abord, ajouter 10 microlitres de LPS à une concentration de cinq milligrammes par millilitre aux 500 microlitres de miniguts humains complets dans chaque puits de la plaque le jour zéro. Continuer à couver à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone et remplacer les médias supplémentaires tous les deux jours jusqu’à la collecte.Pour se préparer à l’intégration de la paraffine, retirez d’abord doucement le média, ajoutez un millilitre de PBS, et pipette doucement de haut en bas pour dissoudre la matrice membranaire du sous-sol tout en prenant soin de ne pas lyse les entéroïdes. Centrifugeuse à une vitesse inférieure à 300 fois G pendant cinq minutes pour pelleter, puis enlever le PBS. Ajouter 4% de paraformaldéhyde et réserver le tube pendant une heure pour fixer à température ambiante.Centrifugeuse à une vitesse inférieure à 300 fois G pendant cinq minutes à pelleter, puis enlever le paraformaldéhyde. Laver délicatement avec un millilitre de PBS et une centrifugeuse à une vitesse inférieure à 300 fois G pendant cinq minutes. Retirez ensuite le PBS.Répétez ce processus de lavage avec PBS une fois. Placer la quantité désirée du gel de traitement des tissus dans un tube conique et le réchauffer dans un incubateur de bain sec à 65 degrés Celsius pendant trois à 10 minutes jusqu’à ce qu’il soit liquide. Après cela, ajouter le gel fondu de traitement des tissus à la pastille et mélanger délicatement.Placer un petit anneau de clonage dans un coverslip. Pipette le gel de traitement des tissus et le mélange enteroid dans l’anneau de clonage qui est monté sur un coverslip. Laissez le gel de traitement tissulaire et le mélange enentéroïde se solidifier à quatre degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, submergez l’anneau de clonage avec le mélange solidifié en 70% d’éthanol pour se préparer à l’intégration de la paraffine. Immédiatement après le placage, les cryptes intestinales fraîchement isolantes apparaissent sous forme de tiges allongées. En quelques heures, les enteroids prennent une apparence ronde.Au cours des prochains jours, les entéroïdes commenceront à former des sphères. Le bourgeonnement devrait se produire entre cinq et 10 jours, c’est-à-dire lorsque la collecte enteroid devrait se produire. Les entéroïdes en croissance présentent également une polarité, contenant un lumen centralisé, une bordure apical, et un domaine basilateral.Les entéroïdes montrent également l’intégrité structurale représentée par un cytosquelette d’actine robuste. Après plusieurs jours en culture, les enteroïdes traités par LBS éprouvent plus d’apoptose et ont un rendement inférieur à celui du groupe témoin. Comme on le voit chez l’homme NEC dans les modèles murins de NEC, une expression accrue du péage comme le récepteur quatre se trouve dans les enteroids traités par LPS par rapport aux contrôles.Les entéroïdes peuvent également être recueillis pour l’extraction de l’ARN et des protéines à l’aide de qRT-PCR bien établis et les techniques occidentales de ballonnement l’expression des gènes et l’isolement des protéines peuvent être effectuées.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Cette vidéo démontre le développement de la maladie d’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entéroïde néonatal d’origine humaine induit par un traitement par lipopolysaccharides. Ce modèle permet d’étudier la physiopathologie intestinale.

Induction de l’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entérocolite épithéliale humaine

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Ce protocole décrit un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante (ECN) et l’isolement ultérieur des cellules immunitaires de la lamina propria de l’intestin grêle murin néonatal.

Un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante et d’isolement de la lamina propria pour le profilage des cellules immunitaires

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Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

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