Inoculation de cellules de carcinome épidermoïde chez les souris pour tumeur immunitaire profilage et évaluation de réponse traitement suffit

Nous présentons ici une méthode reproductible pour le développement d’un modèle murin d’orthotopique du carcinome épidermoïde tête et du cou. Les tumeurs démontrent cliniquement pertinentes caractéristiques histopathologiques de la maladie, y compris nécrose, une différenciation pauvre, métastases nodales et infiltration immunitaire. Souris de tumeur-roulement développent des symptômes cliniquement pertinentes y compris la dysphagie, déplacement de la mâchoire et la perte de poids.

Les cancers de la région de la tête et du cou sont de plus en plus répandus. Pourtant, il y a une compréhension limitée du microenvironnement de tumeur et des mécanismes de résistance de traitement dans cette région. Cette technique peut être utilisée pour récapituler le microenvironnement indigène des tumeurs de la tête et du cou d’une manière accessible et produit des manifestations cliniques similaires à celles observées chez l’homme.

Lorsque la culture des cellules tumorales a atteint 70% de confluence, laver les cellules trois fois avec pbs froid par lavage et attacher les cellules avec suffisamment de trypsine de 0,25% pour couvrir la surface inférieure de la fiole de culture. Après trois à quatre minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, confirmer le détachement sous un microscope léger et neutraliser la trypsine avec 12 millilitres de DMEM F12 moyen, complété par sérum bovin fœtal. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres et mélanger les cellules trois à quatre fois par inversion.

Puis recueillir les cellules par centrifugation et de suspendre à nouveau la pastille dans le sérum et sans antibiotiques DMEM à une fois 10 à la sixième cellules tumorales par 50 microlitres de concentration moyenne sur la glace. Immédiatement avant l’injection, mélanger les cellules à une suspension de cellules tumorales à un rapport de matrice membranaire du sous-sol sur la glace. Chargez une seringue de 0,5 millilitre munie d’une aiguille de calibre 23 avec 100 microlitres de cellules par animal receveur.

Placez les seringues sur la glace et confirmez un manque de réponse au pincement des pieds chez une souris anesthésiée. Ensuite, insérez l’aiguille dans la région buccale droite ou gauche à travers l’espace ouvert disponible de chaque côté de la bouche en gardant la seringue parallèle à la région buccale alors qu’elle est à l’intérieur de la cavité buccale pour faciliter l’injection du volume complet de 100 microlitres de la suspension de la matrice membranaire du sous-sol cellulaire sur une période de cinq secondes. Gardez la seringue en place pendant cinq secondes supplémentaires pour vous assurer que tout le matériel a été injecté avant de retirer doucement la seringue.

Les tumeurs deviendront grossièrement visibles dans environ une semaine. Une semaine après l’injection, utilisez des étriers pour mesurer la longueur et la largeur de chaque tumeur pour déterminer le volume tumoral une à deux fois par semaine. Et mesurer le poids de chaque animal pour évaluer les effets de la croissance tumorale sur l’alimentation.

Au point de terminaison expérimental approprié, utilisez des ciseaux pointus et des forceps contondants pour faire une incision cutanée à travers la ligne médiane dans le cou. Et insérez doucement les ciseaux sous la peau couvrant la tumeur pour créer des poches d’air en poussant les ciseaux à travers et dans la peau. Une fois que la peau est suffisamment détachée de la tumeur, exciser les ganglions lymphatiques drainants pour éviter d’avoir le tissu tumoral confondu par la présence de tissu lymphatique et couper à travers les frontières de la tumeur jusqu’à ce que le volume entier soit détaché.

Pour traiter la tumeur pour l’analyse en aval, coupez la tumeur en morceaux de taille d’un à deux millimètres et placez les morceaux dans un tube conique de 50 millilitres contenant la collagène trois, DNA un, et inhibiteur de trypsine. Après avoir incubé les morceaux de tumeur à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, en secouant toutes les 10 minutes, ajouter 20 millilitres de HBSS au tube et passer la suspension contenant les morceaux de tumeur à travers une passoire en nylon de 70 micromètres. Utilisez un piston de seringue de cinq millilitres pour écraser les morceaux de tumeur dans la passoire et ajouter 10 millilitres supplémentaires de HBSS à travers la passoire.

Faites tourner les cellules par centrifugation. Suspendre à nouveau la pastille en deux à trois millilitres de tampon de lyse de globule rouge avec pipetting rigoureux, neutralisant la lyse avec 20 millilitres de HBSS frais après deux minutes à température ambiante. Puis re-suspendre les cellules dans un supplément de 20 millilitres de HBSS pour une autre centrifugation et forcer les cellules à travers un filtre de coulée de 40 micromètres pour enlever tous les débris finaux de la suspension cellulaire tumorale.

Les tumeurs de LY2 se développent à un taux plus élevé, comparées aux tumeurs de B4B8. Et les souris qui présentent un déplacement de la mâchoire développent rapidement une perte de poids, due à la dysphagie. La survie médiane chez les souris LY2 est également inférieure à la moitié de celle observée chez les souris tumorales B4B8.

La formation image de résonance magnétique des souris tumeur-roulement montre les tumeurs bien-délimitées s’étendant dans la couche intérieure de la muqueuse buccale, mais pas dans la langue ou d’autres organes voisins. L’examen histologique indique que toutes les souris tumeur-roulements LY2 développent le carcinome squamous mal différencié de cellules, alors que les souris portant des tumeurs de B4B8 développent le carcinome squamous modérément différencié de cellules. Toutes les souris porteuses de tumeur de LY2 ont également la nécrose histologiquement confirmée, avec la majorité démontrant la nécrose modérée à grave.

Dans cette expérience représentative, une tumeur de LY2 a été récoltée et traitée trois semaines après injection buccal de cellules de tumeur de région, comme démontré. Les cellules immunitaires CD45-positives ont représenté 7.3%de la population totale de cellules de tumeur. Les cellules myéloïdes CD11b-positives ont représenté 37,8% de toutes les cellules CD45-positives, dont la majorité ont été déterminées pour être des macrophages F480-positifs, avec de petites populations de neutrophiles et de cellules suppressrices myéloïdes-dérivées également observées.

Les lymphocytes T représentaient 15,9 % de la population de cellules immunitaires CD45 positives, dont 53,4 % étaient des lymphocytes T régulation foxp3 positifs en CD4. Les cellules tueuses naturelles représentaient moins de 2 % de toutes les cellules CD45 positives. Il est important de pratiquer l’injection afin de développer la confiance et le confort dans la tenue de l’aiguille et la souris destinataire et en exposant la bouche de l’animal.

Une fois que la procédure a été exécutée avec succès, des expériences impliquant l’évaluation de la réponse de tumeur à la thérapie ou à l’évaluation des facteurs intrinsèques et microenvironnementaux de tumeur peuvent être exécutées. Cette technique a ouvert la voie à la conception d’un essai clinique initié par un chercheur, évaluant les effets de la combinaison de la radiothérapie avec la thérapie anti-PL1 chez les patients atteints de cancer de la tête et du cou.