Un dispositif de positionnement pour le placement des souris pendant la livraison de siRNA intranasal au système nerveux central
15 août 2019
Ici, nous présentons un protocole utilisant un dispositif de positionnement de souris qui permet le placement approprié des souris pour l'administration intranasale d'une formulation de peptide-siRNA de cerveau-ciblage permettant le silençage efficace de gène dans le système nerveux central.
Ce protocole détaille l’utilisation d’un dispositif de positionnement pour la livraison intranasale de biomolécules à la souris CNS. L’utilisation de cet appareil réduit considérablement la manipulation des souris et le temps de traitement, ce qui améliore l’efficacité et la reproductibilité de la technique. Pour commencer cette procédure, évaluer le niveau d’anesthésie des souris par réflexe de pédale afin de maintenir le plan chirurgical.
Ensuite, placez le dispositif de positionnement à une distance et une hauteur appropriées pour permettre un accès pratique à tous les reagents requis. Ensuite, appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal. Attachez une souris avec des ceintures de chaise, en vous assurant que les membres antérieurs de la souris fournissent un soutien naturel alors qu’il est dans une position détendue sans aucun inconfort.
Répétez les procédures pour les souris restantes. Placez doucement chaque souris sur la chaise désignée en posant son dos parallèlement au support arrière de la chaise et à 90 degrés au siège de la chaise. Laissez l’animal se trouver naturellement dans la position de la tête vers le bas et vers l’avant sans pousser ou appuyer.
Une fois que toutes les souris sont attachées, commencez immédiatement l’inoculation intranasale. Pour effectuer la livraison intranasale, chargez la micropipette avec deux microlitres de solution complexe de siRNA RVG9R. Tenez la pipette dans la main dominante et soutenez-la d’autre part pour éviter les mouvements incontrôlés tout en administrant le siRNA.
Placez environ une gouttelette de deux microlitres très près d’une narine afin que la souris puisse l’inhaler directement. Si une petite goutte n’est pas facilement formée, remplacez la pointe pipette par une nouvelle et répétez l’opération. Poussez doucement la tête de la souris vers le bas avec l’index pendant cinq secondes pendant qu’elle inspire et maintenez la position.
Pour empêcher le drainage de la drogue dans les poumons, il est important de pousser la tête de la souris vers le bas avec l’index pendant cinq secondes pendant que la souris inspire. Démarrez un chronomètre pour horloge trois à quatre minutes après cela à l’inoculation du temps dans le deuxième nare de la première souris. Cet intervalle de temps est nécessaire pour que la souris complète l’inhalation de la première dose et restaure la respiration normale.
Dans l’intervalle de trois à quatre minutes entre l’inoculation des nares alternatifs sur la première souris, l’inoculation intranasale complète d’un nare dans chacune des trois souris restantes placées sur l’appareil. Lorsque le chronomètre retentit, inoculer la deuxième narine sur la première souris et répéter la procédure pour les autres souris comme ci-dessus. Répétez la procédure jusqu’à ce que les 20 à 30 microlitres soient livrés pour les quatre souris.
Il faudra environ 30 à 45 minutes pour compléter l’ensemble de la procédure d’inoculation. Retournez les animaux dans leurs cages désignées. Ne laissez pas les souris sans surveillance jusqu’à ce qu’elles aient repris suffisamment conscience pour maintenir la récumbence sternale.
Pour évaluer le silencing des gènes, extraire l’ARN de diverses régions du cerveau avec un kit de purification de l’ARN, inverser la transcription en CDNA à l’aide d’un kit de synthèse cDNA, et effectuer qPCR avec des paires d’amorce. La plupart des livraisons cérébrales du peptide RVG9R étiqueté avec Alexa Fluor 488 ont d’abord été testées à l’aide du dispositif de positionnement de la souris décrit ici. À 48 heures après l’inoculation, divers organes ont été excisés pour mesurer la fluorescence de l’A488.
Rien n’a été détecté dans aucun des organes dans les contrôles négatifs. D’autre part, un signal fluorescent fort D’A488 a été détecté exclusivement dans les cerveaux du groupe inoculé de RVG9R. En outre, la position de placement de souris a été comparée à la méthode de position de supine et à la méthode éveillée pour l’efficacité.
Les résultats ont indiqué que le positionnement de la tête et de l’avant des souris a amélioré la pénétration et le dépôt du RVG9R A488 dans tout le tissu cérébral. Pour confirmer davantage la livraison de siRNA au cerveau, le balayage complet de cerveau a été exécuté après une administration intranasal simple de RVG9R complexée au siRNA étiqueté de Cy5. Contrairement à PBS ou RVM9R, le complexage avec RVG9R a eu comme conséquence une forte accumulation de siRNA dans les régions principales de cerveau comprenant le bulbe olfactif, le cortex, l’hippocampe, le thalamus, l’hypothalamus, le milieu du cerveau, et le cervelet.
Le dispositif de positionnement peut être utilisé pour la livraison de médicaments ou de molécules à la souris CNS. Les applications s’étendent à l’essai des thérapeutiques aussi bien qu’à l’examen des mécanismes cellulaires dans le CNS. Ce dispositif de positionnement a été utilisé par les chercheurs pour démontrer la puissance des siARN dans le traitement de la maladie du virus du Nil occidental, ainsi que pour explorer des thérapies pour d’autres maladies du SNC.
Aperçu
Ce protocole décrit l'utilisation d'un dispositif de positionnement de souris pour l'administration intranasale d'une formulation peptidique ARNsi ciblant le cerveau, facilitant une inhibition efficace de l'expression génique dans le système nerveux central. La méthode améliore l'efficacité et la reproductibilité tout en minimisant la manipulation des souris.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Thérapie génique
- Délivrance biomoléculaire
Contexte
- L'administration intranasale est une voie prometteuse pour les thérapies ciblant le système nerveux central.
- Des techniques d'administration efficaces sont cruciales pour obtenir des résultats reproductibles.
- La positionnement de la souris peut influencer l'efficacité de la délivrance du médicament.
- La silenciation génique par ARNsi constitue un outil précieux dans la recherche en neurosciences.
Objectif de l'étude
- Mettre en place un protocole pour une administration intranasale efficace de siARN vers le SNC de la souris.
- Évaluer l'impact de la position de la souris sur l'efficacité de la délivrance du médicament.
- Démontrer l'utilité du dispositif de positionnement dans les applications de thérapie génique.
Méthodes utilisées
- Évaluation du niveau d'anesthésie chez les souris avant le positionnement.
- Utilisation d'un dispositif de positionnement pour maintenir les souris en position détendue.
- Inoculation intranasale d'une solution complexe d'ARNi.
- Extraction de l'ARN et PCR quantitative pour évaluer l'efficacité de la silenciation génique.
Résultats principaux
- Un silençage génique significatif observé dans les régions cérébrales après inoculation.
- Une délivrance améliorée de siARN grâce au dispositif de positionnement par rapport aux autres méthodes.
- Une forte fluorescence détectée dans les cerveaux des souris traitées, indiquant une délivrance réussie.
- La position tête en bas a amélioré la pénétrance et le dépôt de la formulation de siARN.
Conclusions
- Le dispositif de positionnement de la souris est efficace pour l'administration de médicaments au système nerveux central.
- Cette méthode peut être appliquée à divers contextes thérapeutiques et de recherche.
- Des études supplémentaires peuvent explorer son utilisation dans le traitement des maladies du système nerveux central.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
La délivrance intranasale efficace de thérapeutiques ciblant le système nerveux central reste un goulot d'étranglement critique dans le développement de la neurosciences précliniques et de la thérapie génique. Ce dispositif de positionnement permet une administration standardisée et à haut débit de biomolécules telles que l'ARNi, les peptides ou les nanoparticules au cerveau de la souris, améliorant ainsi la reproductibilité et réduisant la variabilité dans les études d'engagement cible. En assurant un positionnement constant de la tête vers le bas et vers l'avant, il renforce la fiabilité prédictive de l'absorption au niveau du SNC et diminue les risques lors du passage à l'échelle translationnelle des candidats thérapeutiques administrés par voie intranasale.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet une interrogation précise des hypothèses thérapeutiques en assurant une administration reproductible de composés actifs sur le SNC, comme les complexes RVG9R-siRNA.
- Valeur opérationnelle : Réduit la variabilité liée à l'opérateur dans la posologie, soutenant des évaluations fiables de l'engagement ciblé et de la modulation des voies.
- Fiabilité prédictive : Améliore la cohérence des lectures des biomarqueurs, tels que la silencing génique ou la réduction protéique, entre les groupes de traitement.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Prépare des systèmes biologiques standardisés pour des analyses en aval en assurant une administration uniforme des composés au système nerveux central.
- Valeur opérationnelle : Facilite la reproductibilité des tests grâce à un positionnement contrôlé des animaux et une réduction du stress lié à la manipulation.
- Réutilisation de la plateforme : Permet l'évaluation de diverses modalités, notamment les ARNsi, les nanoparticules et les anticorps, pour la délivrance au système nerveux central.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Préserve la pertinence pathologique en permettant une administration constante vers des régions cérébrales clés impliquées dans les modèles de neurodégénérescence ou d'infection virale.
- Valeur opérationnelle : Permet un test rapide de candidats thérapeutiques grâce au traitement parallèle de jusqu'à huit souris par séance.
- Progression ajustée au risque : Soutient les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en renforçant la confiance dans les données d'exposition au système nerveux central et de modulation de la cible.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Le dispositif s'intègre au flux de travail de découverte, de la validation précoce de la cible jusqu'à l'optimisation du composé candidat, en soutenant des évaluations fiables de l'administration au système nerveux central avant les études permettant l'AMM.
- Découverte biologique : Soutient la vérification d'hypothèses en permettant une administration reproductible d'ARNsi ou de thérapeutiques peptidiques afin de valider la modulation de cibles in vivo.
- Essais de dépistage : Améliore la préparation et la reproductibilité des tests en standardisant la position des animaux lors de l'administration intranasale de composés.
- Analytique : Permet une comparaison quantitative de la pénétration dans le système nerveux central (SNC) par des mesures de fluorescence, de qPCR ou de biomarqueurs entre différents groupes de traitement.
- Recherche translationnelle : Assure un lien entre la découverte et les étapes précliniques en améliorant la fiabilité des paramètres d'administration dans le SNC utilisés dans les études de détermination de la dose et d'efficacité.
- Réutilisation institutionnelle : Fonctionne comme une plateforme réutilisable pour évaluer plusieurs modalités ciblant le SNC dans divers projets et domaines thérapeutiques.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive en matière de distribution dans le système nerveux central et d'interaction avec la cible en réduisant la variabilité des procédures.
- Valeur opérationnelle : Améliore le débit et la standardisation, réduit le temps d'intervention manuelle et la dépendance aux techniciens.
- Valeur stratégique : Permet de meilleures décisions de poursuite ou d'abandon en améliorant la qualité des données et en réduisant les faux négatifs dans les tests de distribution dans le système nerveux central.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques intranasaux fondée sur des données reproductibles d'absorption dans le système nerveux central.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une formation à l'évaluation de l'anesthésie et au maintien adéquat de l'animal afin d'assurer son confort et un positionnement correct.
- Dépend de l'accès à un équipement pour l'administration intranasale, tel que des micropipettes et des embouts stériles, permettant une formation constante des gouttelettes.
- Exige une standardisation entre les équipes afin d'assurer un positionnement uniforme de la tête vers le bas et vers l'avant, ainsi qu'un intervalle régulier entre les inoculations dans chaque narine.
- Doit être adapté aux différentes souches ou tailles de souris à l'aide de réglages ajustables de la hauteur et de l'inclinaison du siège.
- Limité aux procédures nécessitant une administration intranasale précise ; n'est pas adapté aux voies d'administration intraveineuse ou orale.
