Moyen-throughput Screening tests pour l’évaluation des effets sur Ca^{2 +}-signalisation et Acrosome Reaction en sperme humain

Nos analyses peuvent être utilisées pour tester les composés pour leurs effets sur la fonction des spermatozoïdes humains. Plus précisément, ces méthodes peuvent être utilisées pour dépister rapidement et facilement un grand nombre de composés pour leurs effets sur la signalisation du calcium et la réaction acrosome dans les spermatozoïdes humains. Les démonstrations visuelles de cette méthode faciliteront la mise en place d’expériences similaires dans leurs propres laboratoires.

Commencez par placer un tube de 50 millilitres par millilitre d’échantillon de sperme brut dans un support à tubes à un angle de 45 degrés et en ajoutant quatre millilitres de 37 degrés Celsius fluide tubaire humain ou milieu positif HTF à chaque tube. Ensuite, pipette soigneusement un millilitre d’échantillon de sperme liquéfié au fond de chaque tube et placer les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure. À la fin de l’incubation, utilisez une pointe de pipette modifiée maintenue à un angle de 45 degrés pour transférer doucement autant de la fraction supérieure de la cellule de sperme motile contenant le milieu positif HTF que possible dans un nouveau tube en plastique de 15 millilitres.

Pour compter les spermatozoïdes recueillis, diluer un aliquot de 20 microlitres à un facteur de 10, 20, 30, 50 ou 90 dans le tampon S100 dans un tube rond inférieur de deux millilitres selon la concentration prévue. Vortex les spermatozoïdes dilués pendant 10 secondes à 700 rotations par minute. Ensuite, plongez une cassette SP1 dans l’échantillon et déprimez complètement le piston blanc pour aspirer un aliquot de l’échantillon dans la cassette.

Ensuite, placez la cassette dans le plateau de cytomètre d’image et exécutez l’analyse des spermatozoïdes humains tachés d’IP selon le facteur de dilution appliqué. Pour mesurer les changements dans la concentration libre de calcium intracellulaire, pipette doucement l’échantillon de sperme de haut en bas une fois et utiliser une pipette répéteur automatique à aliquot 50 microlitres de spermatozoïdes fluorophore-souillés à 24 puits d’une rangée d’une plaque de puits de 384 micro. Placez la plaque de micro puits dans le lecteur de plaque de fluorescence à 30 degrés Celsius et choisissez le protocole approprié pour le fluorophore.

Sélectionnez un puits dans la rangée de spermatozoïdes et ajustez le gain à une valeur cible de 20%, puis commencez la mesure. Après 10 cycles de base, mettre en pause l’expérience et éjecter le tiroir avec la plaque de micro puits. À l’aide d’une pipette à 12 canaux, ajoutez rapidement 25 microlitres des solutions préparées de composés et de contrôles d’intérêt dans les 12 puits en double de la rangée et retournez immédiatement la plaque au lecteur pour continuer la mesure le plus rapidement possible.

Tout changement de fluorescence en réponse à l’ajout de composés ou de commandes sera capturé par l’instrument. Pour l’analyse de réaction acrosome, après avoir incubé les spermatozoïdes capacités avec les colorants fluorescents appropriés, les composés ou les contrôles, mélanger les échantillons par pipetting et ajouter 50 microlitres de chaque échantillon d’essai à 100 microlitres de solution d’immobilisation. Mélangez à nouveau les échantillons et chargez les chambres d’une diapositive A2 par échantillon avec environ 30 microlitres d’échantillon par chambre.

Placez ensuite la première glissière chargée sur le plateau du cytomètre d’image. Sélectionnez le protocole FlexiCyte et appuyez sur Exécuter. Ici, les résultats représentatifs d’une expérience testant l’effet de quatre composés, un contrôle positif de la progestérone et un contrôle tampon négatif en utilisant l’analyse de signalisation du calcium à débit moyen tel que démontré peuvent être observés.

Dans ce graphique, une courbe de réponse de dose de progestérone dérivée des changements de pourcentages de crête dans la concentration libre intracellulaire de calcium induite par la concentration périodiquement diluée de progestérone est montrée. Ces données illustrent les effets d’un négatif ou d’un des deux contrôles positifs sur l’induction d’une réaction acrosome dans les spermatozoïdes humains capacitated dans un essai de réaction acrosome de débit moyen. Pour éviter de manquer les pics des signaux induits, il est essentiel d’ajouter rapidement les produits chimiques aux puits de reproduction et de poursuivre immédiatement la mesure par la suite.

En changeant le type de fluorophores et de colorants, nos analyses peuvent facilement être modifiées pour répondre à différentes questions scientifiques. Ces analyses ont déjà été utilisées dans plusieurs études pour tester de grands groupes de composés pour leurs effets sur la fonction du sperme humain.