Name: Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 24 s
Description: Découvrez une technique cytogénétique au DAPI pour déterminer le taux de fécondation de Bemisia tabaci. Cette méthode innovante permet d'étudier la dynamique des populations de cet insecte ravageur haplodiploïde.

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Cette recherche a été financée par une subvention de NSF (DEB-1020460) à n235 et une subvention de l’USDA AFRI (2010-03752) à n235 Les auteurs remercient Brennan Zehr pour la coloration des oeufs de la mouche blanche avec beaucoup de compétence et Zen. Les auteurs remercient Mike Riehle permettant l’utilisation de son microscope à fluorescence pour l’imagerie. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Marco Gebiola pour les images de l’oeuf. Les auteurs remercient Suzanne Kelly et Jimmy Conway pour aider à des moments cruciaux au cours des expériences.

Remarque : Veiller à ce que tout le travail est effectué à la température ambiante dans un endroit bien ventilé ou sous une hotte aspirante. Tous les « gouttes » dans le présent protocole sont définies comme 5 – 20 µL, selon les préférences de l’opérateur.
1. première installation
<ol><li>Permettre aux aleurodes femelles à pondent leurs oeufs sur les feuilles propres. Exemples d’arénas de la ponte des cages de clip ou de feuilles coupées pour s’adapter sur la gélose dans une boîte de pétri. Faire un trou couvrable dans la cage de clip ou le couvercle de la boîte de pétri pour insérer et retirer les adultes. Sinon, rapidement mettre un navire des adultes prélevés sur la glace et, ensuite, déposez-les sur la feuille. Limiter le temps entre la ponte et fixation de le œuf à pas plus de 60 min, afin d’assurer l’observation de la transition de sperme dans le pronucleus paternel dans les oeufs. Remarque : Œufs ne pas retirés de la feuille peuvent être élevés jusqu'à l’âge adulte pour enregistrer adultes sex ratios.</li>
	<li>Avant ou pendant la ponte de la mouche blanche, préparer une lame de microscope en le nettoyant avec du savon et l’eau, séchage il bien et puis qui s’étend d’un morceau de pellicule de paraffine sur une extrémité, en s’assurant que la surface de film de paraffine ne casse pas (Figure 1). Remarque : Le film de paraffine est hydrophobe et semi-opaque, permettant aux liquides de forme gouttes et d’oeufs pour être vu plus facilement.</li>
</ol>2. Dechorionation
<ol><li>Avec un verre de Pasteur, pipette, ajouter des gouttes de solution d’eau de Javel (hypochlorite de sodium 0,83 %) pour le film de paraffine. Remarque : Il est plus facile de garder une trace des oeufs si seulement 2 – 3 oeufs sont contenus dans chaque goutte. Sinon, pour gérer un certain nombre de gros oeuf, recueillir les oeufs en gouttes de 1 x solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mise en garde : Eau de Javel est corrosif ; Portez des gants lorsque vous manipulez de Javel et ne pas inhalent.</li>
	<li>Retirez les aleurodes adultes de la feuille.</li>
	<li>Placez la feuille sous un microscope pour discerner les oeufs et collecter les œufs séparément et soigneusement avec une sonde fine. Pour faire une sonde, insérez une tige de nadel minuten à 45° ou à un angle de travail confortables dans un fondu de pipette (Figure 2).</li>
	<li>Transférer les oeufs à l’eau de javel ou PBS 1 x. Si vous utilisez la solution 1 PBS x, enlever le 1 x PBS avec un verre de Pasteur pipeter une fois tous les oeufs sont prélevés et, ajoutez ensuite l’eau de Javel aux œufs. Remarque : Lors de la collecte des œufs, soulevez lentement l’oeuf de sa base jusqu'à ce que le pédicelle est retiré de la feuille. Le pédicelle est collant, et le œuf communément collera à l’extrémité de la sonde jusqu'à ce qu’il est plongé dans l’eau de Javel. Remarque : Il est recommandé d’utiliser le verre séparée pipettes Pasteur pour tous les réactifs et les pipettes peuvent être modifiés avec la chaleur pour faire les pointes plus étroit et réduire le risque d’aspiration accidentellement les oeufs de la mouche blanche. Pour éviter les résidus éventuels et contamination, nettoyez les pipettes avec de l’eau désionisée après chaque utilisation.</li>
	<li>Attendez 10 min. S’il y a un intérêt dans l’embryogenèse dans les oeufs de plus de 1 h, laisser les oeufs dans l’eau de Javel pendant jusqu'à 15 minutes. Remarque : Pour les œufs qui sont vieux jusqu'à 1 h, 10 min est suffisant.</li>
</ol>3. la fixation
Remarque : Ces étapes sont tirées d’un hyménoptère protocole17.
<ol><li>Retirez l’eau de Javel (contenant les fragments de chorion) avec une pipette Pasteur en verre et jetez-le. Ajouter les gouttes d’acide acétique glacial avec un verre de Pasteur pipetter et attendent 3 min. Mise en garde : Procéder à cette étape sous une hotte aspirante. Acide acétique glacial est corrosif ; porter des gants lorsque manipulation d’acide acétique glacial et ne pas respirer, surtout en combinaison avec l’eau de Javel résiduelle.</li>
	<li>Retirer l’acide acétique glacial avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de solution de Clarke (3:1 d’éthanol absolu : acide acétique glacial) avec un verre de Pasteur pipeter. Patientez jusqu'à ce que la majeure partie de la solution se soit évaporée (ou 10 min max).</li>
	<li>Ajouter des gouttes d’éthanol à 70 % aux oeufs avec une pipette Pasteur en verre et attendre jusqu'à ce que la plupart de l’éthanol s’est évaporée (ou 10 min max).</li>
</ol>4. coloration
<ol><li>Supprimer toute éthanol résiduel avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de PBS 1 x aux œufs avec une pipette Pasteur en verre pour obtenir le pH proche de 7,0. Mettre la lame de microscope dans une chambre humide pour empêcher la dessiccation, par exemple, dans une boîte de pointe de pipette vide avec une serviette de papier humide à l’intérieur (Figure 3). Attendez au moins 30 min. Remarque : C’est le meilleur point si une pause est nécessaire, aussi longtemps que la chambre de l’humidité peut empêcher la dessiccation.</li>
	<li>Supprimer le PBS 1 x avec une pipette Pasteur en verre et ajouter des gouttes de 0,1 μg/mL DAPI, une tache fluorescent de l’ADN, avec un verre de Pasteur pipeter. Réglez la lame de microscope dans une chambre sombre humidité et attendre au moins 15 min. Mise en garde : Le DAPI est un irritant, donc le manipuler avec des gants.</li>
</ol>5. lavage
<ol><li>Retirez le DAPI avec une pipette Pasteur en verre.</li>
	<li>Ajouter des gouttes de 1 x TBST (5 x solution fabriqués à partir de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de polysorbate 20 et 1,0 g de NaN3 [pH 7.5] et portée à 1 L avec de l’eau de la PCR grade) aux oeufs avec un verre de Pasteur pipeter. Attendre 5 min avant de retirer le 1 x TBST avec une pipette Pasteur en verre. Répétez cette étape 2 fois.</li>
</ol>6. montage
<ol><li>Après le lavage final, soigneusement pipette tous les oeufs du film de paraffine sur une partie propre de la lame de microscope. Retirez l’excès 1 x TBST ; puis, ajouter 20 µL de supports de montage (glycérol 80 % et 20 % 1 x TBST avec 2 % n-gallate de propyle) et placez une lame propre de la couverture sur le dessus les oeufs.</li>
	<li>Pour le stockage à long terme, sceller le coulisseau de couverture avec vernis à ongles transparent et, ensuite stocker la diapositive dans le noir à 2 ° C ou il découvre immédiatement sous un microscope à fluorescence.</li>
</ol>

<ol><li>Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCharnov%2C+EL+%22The+Theory+of+Sex+Allocation%22">The Theory of Sex Allocation</a>. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).</li>
<li>Godfray, H. C. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGodfray%2C+HCJ+%22Parasitoids%3A+behavioral+and+evolutionary+ecology%22">Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).</li>
<li>Bourke, A. F. G., Franks, N. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBourke%2C+AFG+%22Social+Evolution+in+Ants%22">Social Evolution in Ants</a>. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).</li>
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<li>Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+inheritance+of+a+single+somatic+animal+cell+displayed+by+the+bacteriocyte+in+the+whitefly+Bemisia+tabaci%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci.</a> Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).</li>
<li>Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+generation+effects+of+high+temperature+on+the+development+and+fecundity+of+Bemisia+tabaci+%28Gennadius%29+%28Hemiptera%3A+Aleyrodidae%29+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B.</a> Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).</li>
<li>Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+heat+shock+on+survival+and+reproduction+of+two+whitefly+species%2C+Trialeurodes+vaporariorum+and+Bemisia+tabaci+biotype+B%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B.</a> Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).</li>
<li>Boykin, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bemisia+tabaci+nomenclature%3A+Lessons+learned%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned.</a> Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).</li>
<li>Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+insight+into+reproductive+incompatibility+between+putative+cryptic+species+of+the+Bemisia+tabaci+whitefly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex.</a> Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole est le premier à capturer le taux de fécondation ou sex-ratio primaire de b. tabaci. Le défi du présent protocole, c’est qu’il exige des chercheurs apprendre à gérer les oeufs de la mouche blanche rapidement, veiller à ce que pas plus de 1 h est écoulé depuis que les oeufs ont été pondus jusqu'à ce qu’ils sont fixés. Au cours d’expériences préliminaires, les oeufs qui ont été fixés à 3 h ou plus ponte étaient trop vieux pour observer la fécondation, la Syngamie avait eu lieu et divisions mitotiques ...

L’étude de la répartition du sexe, ou l’investissement relatif chez les descendants mâles et femelles, est des pierres angulaires de l’écologie comportementale1,2,3. En plus de sa puissance pour tester des modèles adaptatifs de comportement, connaître la stratégie d’allocation de sexe d’un organisme peut améliorer les modèles de sa dynamique de population. Chez de nombreuses espèces, allocation de sexe est contrôlée par les mères. Pour déterminer l’allocation de sexe, il est important de déterminer le sex-ratio primaire ou la proportion des femelles au moment de la ponte. Bien que le rapport des sexes à l’émergence des adultes peut fournir des indices d’allocation de sexe, la mortalité différentielle développementale entre mâles et femelles juvéniles peut biaiser communément substantiellement le sex-ratio adult. Chez certaines espèces d’hyménoptères, l’ordre des insectes qui contient des fourmis, abeilles et guêpes, le sex-ratio primaire a été déterminé avec des analyses cytogénétiques, souillant les embryons pour afficher génétique ADN. Comme les hyménoptères sont haplodiploïdes, un œuf mâle naissant est haploïde et contient seulement le pronucleus femelle (n), tandis que naissantes œufs femelles sont diploïdes et contenant le pronucléus mâles et femelles (2n). Bien que Aleyrodidae, la famille sap qui se nourrissent des Hémiptères (Hemiptera) appelées mouches blanches, sont également haplodiploïdes, il n’a pas été un dosage établi pour trouver le sex-ratio primaire chez ces insectes. C’est peut-être surprenant étant donné l’intensité de l’étude des parasites graves peu cosmopolites dans cette famille et de l’importance du sex-ratio chez les interactions compétitives des aleurodes4,5,6,7 ,8,9,10 et dans la dynamique de la population en général. Aussi, chez les insectes haplodiploïdes sex-ratio sont sans contrainte par les systèmes de détermination sexuelle, prévoyant la possibilité de fécondation sélective et sex-ratio labile qui varient avec l' environnement2. Nous présentons ici une technique pour déterminer le sex-ratio primaire du complexe espèces d’aleurodes, connus collectivement comme les aleurodes de patate douce, b. tabaci. Ce nom d’une espèce englobe plus de 28 espèces dans le monde entier11et comprend certains des plus dommageables des ravageurs envahissants global12,13. L’application de cette technique pour déterminer les patrons d’allocation de sexe de b. tabaci et autre Aleyrodidae permettra une enquête plus rigoureuse de variables, telles que température, plante-hôte, des bactéries endosymbiotiques ou plante/aleurodes agents pathogènes, qui peuvent influencer les aleurodes sex-ratio primaire et dynamique de population des aleurodes.
Nous sommes pas au courant de toute technique de coloration à le œuf comparables pour b. tabaci. Le protocole est pratique par rapport aux méthodes de coloration utilisées pour les autres œufs d’insectes14 car il omet une nuit étape de fixation et, par conséquent, peut être complété en 3 h. Comme exemple d’une application, une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, est associé de partialité féminine dans nos lignes de laboratoire de b. tabaci Moyen Orient-Asie mineure 1 (MEAM1)15,16. En une seule ligne de laboratoire de MEAM1 de b. tabaci (« MAC1, » prélevés dans le centre agricole de Maricopa), nous testons si Rickettsia-fertilisent les femelles (R+) infectées plus d’oeufs que les femelles infectées (R-).

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x TBST</td><td>N’importe quelle</td><td></td><td>solution 5x à base de 30 g de Tris, 43,8 g de NaCl, 5 mL de Tween-20 et 1,0 g de NaN3 pH 7,5 et ramenée à 1 L avec de l’eau de qualité PCR</td></tr><tr><td>Eau de Javel</td><td>Clorox</td><td></td><td>Tout agent de Javel ménager fonctionnera tant qu’il peut être dilué à 0,83 % Hypochlorite</td></tr><tr><td>de sodium Vernis à ongles transparent</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPI dilactate</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc300415</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Tout</td><td></td><td>dilué à 70 % EtOH</td></tr><tr><td>Microscope fluorescent</td><td>Nikon</td><td></td><td>Nikon Eclipse 50i a été utilisé dans cette expérience, mais tout microscope fluorescent avec un filtre d’excitation de 340/380 nm et un grossissement d’au moins 4-10x peut être utilisé</td></tr><tr><td>Acide acétique glacial</td><td>Mallinckrodt</td><td>UN2789</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>microscope Wild</td><td></td><td></td><td>Un microscope Wild M5A a été utilisé pour cette expérience, mais n’importe quel microscope où l’opérateur peut clairement voir les œufs d’aleurodes peut être utilisé</td></tr><tr><td>Couvercles de lames de microscope</td><td>Toutes les</td><td></td><td>méthodes sont pour des couvercles de lames de 18 mm x 18 mm. Il faudra ajouter plus de supports de montage pour les couvertures de diapositives plus grandes.</td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>N’importe quelle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>broche de nadel Minuten</td><td>BioQuip</td><td>1208SA</td><td>Les broches de nadel Minuten sont facultatives pour le façonnage en sondes avec pointes de pipette</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>N’importe quel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Any</td><td></td><td></td></tr><tr><td>n-propyl-gallate</td><td>Sigma/Santa Cruz Biotechnology</td><td>P3130/sc-250794</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pipettes Bemis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td><td>Fisherbrand Pipettes jetables en verre borosilicaté Pasteur 5,75 po. Un bec Bunsen peut également être nécessaire si l’opérateur souhaite allonger et rétrécir les pipettes</td></tr><tr><td>Eau de qualité PCR</td><td>Toutes</td><td></td><td></td></tr><tr><td>les pointes de pipette</td><td>Toutes</td><td></td> les <td>pointes de pipette sont facultatives pour être façonnées comme des sondes avec des broches de nadel</td></tr><tr><td>minuscules Petite poire compte-gouttes</td><td>Tout</td><td></td><td>Doit s’adapter sur la pipette Pasteur</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Tout</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Tout</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

détermination du taux de fécondation des oeufs de bemisia tabaci , utilisant une technique cytogénétique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Quelques espèces d’aleurodes suceurs de sève sont des ravageurs plus dommageables terrestres dans le monde entier en raison des dommages causés aux cultures qu’ils infligent et phytovirus qu'ils vector. Malgré de nombreuses études sur la biologie de ces espèces dans des environnements différents, un paramètre de clé cycle biologique, progéniture sex-ratio, a reçu peu d’attention, est encore important pour prédire la dynamique de la population. Le sex-ratio primaire (sex-ratio à la ponte) de Bemisia tabaci , n’a jamais été signalé mais peut être trouvé en déterminant le taux de fécondation des oeufs d’insecte haplodiploïdes. La technique consiste à le dechorionation des oeufs avec l’eau de Javel, une série d’étapes de fixation et l’application de la tache fluorescente générale de l’ADN, DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phénylindole, un colorant fluorescent de liaison à l’ADN), lier à pronucléus femelles et mâles. Nous présentons ici la technique et un exemple de son application, pour tester si une bactérie endosymbiotique, Rickettsia SP. nr. bellii, influencé le sex-ratio primaire de b. tabaci. Cette méthode peut aider dans l’étude de la population de mouches blanches, ou pour déterminer si l’attribution du sexe existe avec certains stimuli de l’environnement.

Pour vérifier que Rickettsia affecte le taux de fécondation des femelles MEAM1 de b. tabaci , nous avons élevé Rickettsia-infecté (R+) ou non infecté (R-) b. tabaci sur les plantes de niébé (Vigna unguiculata) dans séparer les cages à 27 ° C, humidité relative de 70 % et une photopériode foncé h de lumière/8 h 16. R+ et R– quatrième stade larvaire les aleurodes ont été soigneusement retirés des feuill...

Nous présentons une technique cytogénétique simple à l’aide de 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour déterminer le taux de fécondation et sex-ratio primaire du ravageur envahissantes haplodiploïdes Bemisia tabaci.

Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique

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Le protocole que Liz a développé nous permet de déterminer le taux de fécondation de la fly blanche. L’application de cette technique améliorera notre compréhension du comportement et de l’écologie des mouches blanches. Les mouches blanches sont haplodiploïdes, de sorte que le taux de fécondation est égal au rapport de sexe à l’oviposition.Ce protocole est le premier décrit pour les mouches blanches, à notre connaissance, et peut être complété dans les trois heures. Pour commencer, faire un trou coverable dans le couvercle de la boîte de Pétri pour insérer et enlever les mouches blanches adultes. Installez une chambre d’humidité et façonner une sonde en insérant une fine broche à un angle de travail confortable dans une pointe de pipette fondue pour faire une sonde mince.En option, allongez les pointes de pipette en verre avec de la chaleur pour faciliter la manipulation des œufs à l’huile blanche. Ensuite, laissez les mouches blanches femelles s’oviposer sur une feuille propre, coupées pour tenir sur l’agar dans une boîte de Pétri. Pendant l’oviposition de la linge blanche, nettoyez une lame de microscope avec du savon et de l’eau.Séchez-le bien et étirez un morceau de film de paraffine sur une extrémité pour permettre aux liquides de former des gouttes et des oeufs d’être plus facilement visibles. Pour déchorionner les œufs, utilisez une pipette Pasteur en verre pour ajouter des gouttes de solution d’eau de Javel hypochlorite de sodium à 83 % au film de paraffine juste avant l’enlèvement des adultes et la collecte des œufs. L’eau de Javel et l’acide acétique glaciaire sont tous deux corrosifs.Ils doivent être manipulés avec des gants dans une hotte ou une zone bien ventilée. Dapi est également un irritant et doit être manipulé avec des gants. Ensuite, retirez les mouches blanches adultes de la feuille et placez la feuille sous un microscope.Soulevez soigneusement chaque œuf de sa base jusqu’à ce que le pédicure soit retiré de la feuille. Pratiquez sur de nombreux oeufs avant d’exécuter ce protocole. Soulevez les œufs lentement de la base et soulevez-les complètement de la feuille une fois que vous pouvez voir que le pédicure de l’œuf est retiré de la feuille.Transférer deux à trois œufs à chaque goutte d’eau de Javel et les laisser pendant 10 minutes. Pour fixer les œufs, utilisez une pipette en verre pour jeter l’eau de Javel. Ajouter ensuite les gouttes d’acide acétique glaciaire et attendre trois minutes.Ensuite, retirez l’acide acétique glaciaire et ajoutez des gouttes de la solution de Clarke. Ensuite, attendez 10 minutes jusqu’à ce que la majeure partie de la solution se soit évaporée. Ajouter des gouttes de 70% d’éthanol et attendre à nouveau pendant 10 minutes.Pour tacher les œufs, retirez d’abord tout éthanol résiduel. Ensuite, ajouter des gouttes de 1xPBS aux œufs pour obtenir le pH près de sept. Mettez la lame de microscope dans une chambre d’humidité pour empêcher la dessiccation.Après 30 minutes, retirer le 1xPBS et ajouter des gouttes de 1 microgramme par millilitre DAPI. Mettez la lame de microscope dans une chambre sombre d’humidité et attendez au moins 15 minutes. Pour laver les œufs, retirez d’abord la solution DAPI.Ajouter ensuite des gouttes de 1xTBST aux œufs. Après cinq minutes, retirer le 1xTBST. Répétez ce lavage deux fois de plus pour un total de trois lavages.Après le lavage final, pipette soigneusement tous les oeufs du parafilm sur une partie propre de la lame de microscope. Enlevez l’excès de TBST et ajoutez 20 microlitres de supports de montage. Enfin, placez une glissière propre sur les œufs, scellez la glissière de couverture avec du vernis à ongles clair pour un stockage à long terme, et passez à l’imagerie à l’aide d’un microscope fluorescent.La déchorionation des œufs suivie de la coloration nucléaire DAPI a permis l’attribution de la fécondation et du sexe embryonnaire lorsqu’elle a été observée au microscope fluorescent. Le pronucléus femelle est près du centre de l’oeuf femelle fécondé et de l’oeuf mâle non fertilisé, et le sperme est visible comme une strie lumineuse près du sommet de l’oeuf femelle seulement. Une application de cette technique est de déterminer si les endosymbionts bactériens affectent les rapports sexuels primaires des mouches blanches.Par exemple, les ratios sexuels primaires des œufs pondus par les mouches blanches B.tabici infectées par Rickettsia et non infectées n’ont montré aucune différence significative entre le rapport entre les sexes dans les deux traitements. En ce qui concerne les œufs élevés à l’âge adulte, des résultats similaires ont été observés chez les adultes infectés par Rickettsia et non infectés, ne fournissant aucune preuve, du moins dans cette étude, de taux de fécondation plus élevés chez les femelles infectées par Rickettsia. En utilisant ce protocole, on peut déterminer si le sperme interspécifique peut féconder les ovules.Si aucune fécondation n’est observée, on pourrait reculer et chercher à voir si le sperme est transféré pendant l’accouplement en regardant dans le spermatheca de la femelle. Si la fécondation se produit, on pourrait comparer le rapport entre les sexes des adultes et le taux de fécondation afin de déterminer la viabilité du développement de la progéniture hybride.

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Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique

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