Détermination du taux de fécondation des oeufs de Bemisia tabaci , utilisant une Technique cytogénétique

Le protocole que Liz a développé nous permet de déterminer le taux de fécondation de la fly blanche. L’application de cette technique améliorera notre compréhension du comportement et de l’écologie des mouches blanches. Les mouches blanches sont haplodiploïdes, de sorte que le taux de fécondation est égal au rapport de sexe à l’oviposition.

Ce protocole est le premier décrit pour les mouches blanches, à notre connaissance, et peut être complété dans les trois heures. Pour commencer, faire un trou coverable dans le couvercle de la boîte de Pétri pour insérer et enlever les mouches blanches adultes. Installez une chambre d’humidité et façonner une sonde en insérant une fine broche à un angle de travail confortable dans une pointe de pipette fondue pour faire une sonde mince.

En option, allongez les pointes de pipette en verre avec de la chaleur pour faciliter la manipulation des œufs à l’huile blanche. Ensuite, laissez les mouches blanches femelles s’oviposer sur une feuille propre, coupées pour tenir sur l’agar dans une boîte de Pétri. Pendant l’oviposition de la linge blanche, nettoyez une lame de microscope avec du savon et de l’eau.

Séchez-le bien et étirez un morceau de film de paraffine sur une extrémité pour permettre aux liquides de former des gouttes et des oeufs d’être plus facilement visibles. Pour déchorionner les œufs, utilisez une pipette Pasteur en verre pour ajouter des gouttes de solution d’eau de Javel hypochlorite de sodium à 83 % au film de paraffine juste avant l’enlèvement des adultes et la collecte des œufs. L’eau de Javel et l’acide acétique glaciaire sont tous deux corrosifs.

Ils doivent être manipulés avec des gants dans une hotte ou une zone bien ventilée. Dapi est également un irritant et doit être manipulé avec des gants. Ensuite, retirez les mouches blanches adultes de la feuille et placez la feuille sous un microscope.

Soulevez soigneusement chaque œuf de sa base jusqu’à ce que le pédicure soit retiré de la feuille. Pratiquez sur de nombreux oeufs avant d’exécuter ce protocole. Soulevez les œufs lentement de la base et soulevez-les complètement de la feuille une fois que vous pouvez voir que le pédicure de l’œuf est retiré de la feuille.

Transférer deux à trois œufs à chaque goutte d’eau de Javel et les laisser pendant 10 minutes. Pour fixer les œufs, utilisez une pipette en verre pour jeter l’eau de Javel. Ajouter ensuite les gouttes d’acide acétique glaciaire et attendre trois minutes.

Ensuite, retirez l’acide acétique glaciaire et ajoutez des gouttes de la solution de Clarke. Ensuite, attendez 10 minutes jusqu’à ce que la majeure partie de la solution se soit évaporée. Ajouter des gouttes de 70% d’éthanol et attendre à nouveau pendant 10 minutes.

Pour tacher les œufs, retirez d’abord tout éthanol résiduel. Ensuite, ajouter des gouttes de 1xPBS aux œufs pour obtenir le pH près de sept. Mettez la lame de microscope dans une chambre d’humidité pour empêcher la dessiccation.

Après 30 minutes, retirer le 1xPBS et ajouter des gouttes de 1 microgramme par millilitre DAPI. Mettez la lame de microscope dans une chambre sombre d’humidité et attendez au moins 15 minutes. Pour laver les œufs, retirez d’abord la solution DAPI.

Ajouter ensuite des gouttes de 1xTBST aux œufs. Après cinq minutes, retirer le 1xTBST. Répétez ce lavage deux fois de plus pour un total de trois lavages.

Après le lavage final, pipette soigneusement tous les oeufs du parafilm sur une partie propre de la lame de microscope. Enlevez l’excès de TBST et ajoutez 20 microlitres de supports de montage. Enfin, placez une glissière propre sur les œufs, scellez la glissière de couverture avec du vernis à ongles clair pour un stockage à long terme, et passez à l’imagerie à l’aide d’un microscope fluorescent.

La déchorionation des œufs suivie de la coloration nucléaire DAPI a permis l’attribution de la fécondation et du sexe embryonnaire lorsqu’elle a été observée au microscope fluorescent. Le pronucléus femelle est près du centre de l’oeuf femelle fécondé et de l’oeuf mâle non fertilisé, et le sperme est visible comme une strie lumineuse près du sommet de l’oeuf femelle seulement. Une application de cette technique est de déterminer si les endosymbionts bactériens affectent les rapports sexuels primaires des mouches blanches.

Par exemple, les ratios sexuels primaires des œufs pondus par les mouches blanches B.tabici infectées par Rickettsia et non infectées n’ont montré aucune différence significative entre le rapport entre les sexes dans les deux traitements. En ce qui concerne les œufs élevés à l’âge adulte, des résultats similaires ont été observés chez les adultes infectés par Rickettsia et non infectés, ne fournissant aucune preuve, du moins dans cette étude, de taux de fécondation plus élevés chez les femelles infectées par Rickettsia. En utilisant ce protocole, on peut déterminer si le sperme interspécifique peut féconder les ovules.

Si aucune fécondation n’est observée, on pourrait reculer et chercher à voir si le sperme est transféré pendant l’accouplement en regardant dans le spermatheca de la femelle. Si la fécondation se produit, on pourrait comparer le rapport entre les sexes des adultes et le taux de fécondation afin de déterminer la viabilité du développement de la progéniture hybride.