Points de terminaison et marqueurs proliférants importants pour évaluer les petites blessures intestinales et l'adaptation à l'aide d'un modèle de souris de mucosite induite par la chimiothérapie

Ce modèle de mucosite induite par la chimiothérapie peut être utilisé pour déterminer des critères d’évaluation importants et des marqueurs proliférés de petites lésions intestinales et d’hyperprolifération compensatoire chez la souris. Cette méthode est rapide et rentable et facile à réaliser. Avec une méthode standardisée comme celle-ci, il est plus facile de comparer les paramètres analytiques avec peu de variations.

Pour l’induction de mucosite de 5-Florauracil ou de 5FU, chargez une seringue de 1 millilitre équipée d’une aiguille de 27 jauges par 19 millimètres avec le volume approprié de 5FU et retenez manuellement une souris destinataire. Tout en maintenant la souris dans une poignée ferme mais douce, exposez le côté ventral de l’animal et insérez l’aiguille dans la cavité intraparitoneal dans l’un des quadrants inférieurs de l’abdomen. Ensuite, aspirer pour assurer un bon placement de l’aiguille et injecter le 5FU.

Au point de terminaison expérimental approprié, la quantification 4-Bromo-Deoxyuridine ou BrdU, pèsent une souris animale blessée de 5FU et livrent 5 milligrammes par kilogramme de BrdU par injection intraperitoneal dans une hotte de fumée. 150 minutes après l’injetion de BrdU, confirmer un manque de réponse au pincement des pieds, enregistrer le poids de la souris anesthésiée, et placer l’animal dans la position supine. Effectuer une laparotomie pour exposer la cavité abdominale et faire une incision de la cavité thoracique pour introduire le pneumothorax.

Couper supérieure au pylorus, et extraire soigneusement retirer le tissu intestinal de l’animal jusqu’à ce que le cecum est atteint. À l’aide de forceps, serrez doucement le lumen proximal fermé et utilisez une seringue de 10 millilitres munie d’une aiguille de calibre 25 pour rincer l’intestin grêle avec de la solution saline. Ensuite, placez l’intestin vidé sur du papier buvard propre pour enlever soigneusement l’excès de solution de sel.

Pour la collecte des tissus, récolter l’intestin grêle de l’animal injecté comme il vient de le démontrer et enregistrer le poids du tissu rincé. Après traitement histologique, le tissu peut être photographié sous l’objectif 10x d’un microscope léger relié à une caméra pour obtenir des photos histologiques du tissu récolté. Pour mesurer la zone des cellules immunoréactives BrdU, ouvrez l’image d’intérêt pour l’image J et ouvrez l’image du micromètre de scène.

Utilisez l’outil de sélection en ligne droite pour tracer une ligne droite sur l’image du micromètre pour définir une distance connue et sélectionner l’échelle définie dans le menu d’analyse. Entrez une valeur dans la boîte de distance connue et définissez l’unité de longueur dans l’unité de la boîte de longueur. Ouvrez une image d’intérêt pour mesurer la zone des cellules immunoréactives BrdU par crypte, et réglez les graphiques de couleur en 8 bits sous le menu de type image.

Augmentez le contraste de l’image sous contraste amélioré par le processus et réglez les pixels saturés à 0,4 % Appliquez un seuil à l’image pour segmenter l’immunopositivité et sélectionnez l’image ajuster. Sélectionnez seuil et rouge, en déplaçant la barre de seuil pour sélectionner un seuil d’environ 10 à 20 pour cent. Ensuite, sélectionnez une crypte bien orientée, et utilisez l’outil de sélection à main levée pour marquer la zone autour d’elle.

Pour mesurer la zone du seuil, ouvrez l’onglet analyse et sélectionnez analyser les particules. Dans la fenêtre de particules d’analyse, réglez la taille à 20 à l’infini, et cliquez sur les unités de pixel de la boîte. Réglez la circularité à zéro contre un, et définissez le spectacle sur les contours.

Cliquez ensuite sur les résultats d’affichage, résumez et incluez des boîtes à trous. Les résultats de mesure seront affichés dans la fenêtre de synthèse. Pour mesurer la profondeur de la crypte, ouvrez une image en Lumière Zen et connectez-vous à la caméra.

Prenez des instantanés en mode caméra avec un objectif 20x, et passez en mode traitement pour ouvrir l’instantané. Passez à la vue de mesure. Utilisez l’outil de ligne pour démarrer une ligne au bas d’une crypte bien orientée, en terminant la ligne en haut de la crypte.

Exportez ensuite les mesures et calculez la moyenne de la profondeur de la crypte et remplissez comme hauteur. Le poids de l’intestin grêle diminue du jour 2 au jour 4, suggérant une perte de la masse des entérodocytes. Fait à noter, au jour 5, le poids n’est pas significativement différent du poids du jour 0 sur les animaux traités.

La prolifération mesurée par l’incorporation de BrdU est presque abolie aux jours 1 et 2, mais aux jours 4 et 5, il y a environ quatre et cinq fois plus de leur prolifération, respectivement. Cette hyperprolifération est également observée lors de la mesure de la profondeur de la crypte. Dans la phase régénérative de mucosite, il y a une forte corrélation entre l’incorporation de BrdU et la profondeur de crypte qui n’est pas observée pendant la phase aiguë, suggérant que l’utilisation de la profondeur de crypte comme point final pourrait convenir dans la phase aiguë de la mucosite.

Les souris transgéniques, avec une sécrétion insuffisante de cellules L, démontrent une perte significative de poids corporel et une diminution du poids de l’intestin grêle dans la phase de rétablissement, par rapport à celle observée chez les souris sauvages de type 5-FU. En outre, les souris transgéniques ne montrent pas d’hyperprolifération compensatoire car les cryptes sont significativement plus courtes que chez les souris de type sauvage et les témoins sains. Tout en essayant cette procédure, assurez-vous de vider complètement l’intestin grêle, et d’enlever l’excès de solution saline avant de peser le tissu pour obtenir le faible poids intestinal seulement.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de conduire, de recueillir et de déterminer les critères d’évaluation importants de petites blessures intestinales. Et d’obtenir efficacement des données reproductibles. N’oubliez pas que travailler avec des composés chimiques tels que 5FU et BrdU peut être dangereux et que des précautions, telles que l’utilisation d’un manteau de laboratoire, gants, et une hotte de fumée doit toujours être prise lors de l’exécution de ces procédures.