Dissection des signaux locaux Ca^{2 +} dans les cellules cultivées par axés sur la Membrane Ca^{2 +} indicateurs

La dissection des signaux de calcium à une résolution sous-cellulaire, est l’une des étapes les plus importantes pour décoder les signaux intracellulaires de calcium qui déterminent le phénomène biologique de sortie. Ce protocole décrit une nouvelle méthode d’imagerie calcique qui permet de surveiller le moment même de l’afflux de calcium et de la libération de calcium. Ce protocole s’applique à tous les types de cellules qui permettent l’expression d’indicateurs de calcium génétiquement codés.

Nous croyons que notre méthode a le potentiel d’être étendue à la dissection des signaux de calcium à la résolution sous-cellulaire chez les animaux vivants dans la culture de laboratoire. Matsumi Hirose, technicienne de notre laboratoire, aidera à démontrer la procédure. Pour commencer cette procédure, placez un couvercle en verre de 18 millimètres de diamètre dans chaque puits d’une plaque de 12 puits.

Utilisez de l’eau stérilisée et préparez 12,5 millilitres d’une solution de 0,4 % à l’Île-du-Prince-Édouard pour chaque 12 plaques de puits utilisées. Ajoutez un millilitre de la solution de l’Île-du-Prince-Édouard à chaque puits et assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles sous les feuillets de couverture. Incuber la nuit dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius.

Le lendemain, utilisez un aspirateur pour supprimer la solution de l’Î.-P.-É. Ajouter un millilitre d’eau stérilisée à chaque puits et secouer la plaque de sorte que la solution de l’Île-du-Prince-Édouard entre le glissement du couvercle et la plaque soit bien lavée. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus avec de l’eau fraîche stérilisée.

Après le lavage final, aspirer complètement l’eau de chaque puits. À l’intérieur du capot, utiliser une lumière ultraviolette pour sécher et stériliser les glissements de couvercle pendant au moins 15 minutes. Le plat enduit de l’Île-du-Prince-Édouard peut être conservé à quatre degrés Celsius jusqu’à deux mois.

Lorsque vous êtes prêt à procéder, illuminez la vaisselle avec la lumière ultraviolette pendant 15 minutes, juste avant l’utilisation. Ajouter cinq millilitres d’eau distillée stérile dans l’espace entre les puits pour éviter l’évaporation du milieu de culture. Tout d’abord, laver les cortices avec de l’incubation saline.

Puis, incuber les cortices avec trypsine et DNAse en incubation saline pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez les cortices trois fois avec de la glace froide incubation saline. Retirer le supernatant et ajouter deux millilitres de placage moyen complété par 150 microlitres de bouillon DNAse I.

Dissocier les cellules en pipetting vingt fois ou moins et filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire avec une taille de pore de 70 micromètres. Ensuite, lavez la passoire cellulaire avec 20 millilitres du milieu de placage. Pour la préparation du bouillon de cellules congelées, lavez les cellules avec 20 millilitres du milieu de lavage.

Diluer les cellules corticales avec le milieu de placage à une densité de 140 000 cellules viables par millilitre. Ajouter ensuite un millilitre de suspension cellulaire diluée aux feuillets de housse enduits de l’Île-du-Prince-Édouard dans les 12 plaques de culture du puits. Maintenir les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours.

Lorsque les cellules sont stables, deux à trois jours après le placage, changer le milieu de culture au milieu d’entretien. Pour la préparation du stock cellulaire congelé, faites tourner la cellule à l’aide d’un rotor pivotant pour centrifuger les cellules à 187 fois G pendant trois minutes. Aspirer le supernatant et ajouter le milieu de cryopréservation, maintenu à quatre degrés Celsius, pour obtenir une densité cellulaire de 10 millions de cellules par millilitre.

Aliquot un millilitre de la suspension cellulaire en tubes cryogéniques. Placez les tubes dans un contenant de congélation cellulaire avec un taux de congélation de moins un degré Celsius par minute, jusqu’à ce qu’une température de moins 80 degrés Celsius soit atteinte. Transférer le contenant de congélation dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius.

Pour faire revivre les cellules congelées, préchauffer le milieu de lavage et le milieu d’entretien des cellules corticales congelées. Ensuite, décongelez rapidement les cellules gelées dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius. Diluer délicatement les cellules avec un moyen de lavage préchauffé et une centrifugeuse avec un rotor de balançoire à 187 fois G pendant trois minutes.

Suspendre à nouveau la pastille en un millilitre de milieu de lavage et mesurer la densité cellulaire viable. Ensuite, diluer les cellules avec le milieu d’entretien pour les cellules corticales congelées, pour donner une densité cellulaire de 300 000 cellules par millilitre. Cédez un millilitre de cette suspension cellulaire dans les puits de l’Île-du-Prince-Édouard enduit 12 plaques de puits.

Pour la transfection trois à huit jours après le placage, étiqueter deux tubes, l’un pour l’ADN plasmatique et l’autre pour le réaccente de transfection. Ajouter 50 microlitres de sérum moyen réduit par puits, à chaque tube. Ajouter 0,5 microgramme d’ADN plasmatique par glissement de couverture et un microlitre de supplément accompagné d’un réaccente de transfection pour les neurones, par puits au tube d’ADN plasmatique.

Pour la co-transfection de Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f, mélanger 0,5 microgramme de chaque plasmide et un microlitre de supplément dans 50 microlitres de sérum moyen réduit par puits. Ensuite, ajoutez un microlitre de réaccente de transfection par puits au tube de réaccentation transfection. Vortex les deux tubes pendant une à deux secondes.

Ajouter ensuite le mélange de réaccente de transfection au mélange d’ADN. Pipette doucement pour mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Chargez ce mélange sur les cellules d’une manière goutte-sage.

Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours jusqu’à ce que les protéines marqueurs soient exprimées. Mélanger L et O pour faire l’infection aac. Ajouter trois microlitres d’AAC par puits à la culture mixte neurone-astrocyte.

Faire bercer délicatement le plat pour le mélanger. Maintenir la culture pendant une à deux semaines jusqu’à ce que les IGE soient exprimés. Montez d’abord le bordereau de couverture contenant les cellules transfectées avec Lck-RCaMP2 et OER-CaMPG6f dans la chambre d’enregistrement du microscope.

Ajouter 400 microlitres du milieu d’imagerie et placer un couvercle sur le dessus de la chambre. Choisissez l’ensemble de filtres pour GCaMP6f et la source de lumière. Localiser les astrocytes exprimant OER-GCaMP6f.

Ensuite, choisissez un ensemble de filtres et une source de lumière pour RCaMP2 et confirmez si Lck-RCaMP2 est exprimé dans les mêmes astrocytes. Enregistrez des images en accéléré de Lck-RCaMP2 à deux Hertz pendant deux minutes et enregistrez les données d’imagerie. Après cela, changer le filtre en arrière à celle de GCaMP6f.

Enregistrement des images de laps de temps d’OER-GCaMP6f à deux Hertz pendant deux minutes et enregistrer les données d’imagerie. Dans cette étude, Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f sont exprimés dans les cellules HeLa et les deux signaux ont été enregistrés simultanément à l’aide de l’optique de fractionnement d’image, 24 heures après la transfection. Lors de l’ajout d’Histamine, l’intensité du signal de Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f a augmenté.

Les cours du temps d’élévation de l’ion calcium rapportés par Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f sont comparés dans les mêmes régions d’intérêt. Les deux capteurs signalent une élévation d’ion de calcium oscillation-comme. Et les deux montrent le même cours de temps dans deux des cinq cellules examinées.

Cependant, les élévations d’ion de calcium montrées par Lck-RCaMP2 restent au niveau plus élevé que OER-GCaMP6f dans les autres cellules. Ces résultats indiquent que l’élévation d’ion de calcium est prolongée dans le voisinage de la membrane de plasma, alors qu’elle est terminée plus tôt autour de l’ER, qui est la source de ce signal d’ion de calcium induit par la stimulation d’Histamine. Les signaux spontanés d’ion de calcium des astrocytes dans la culture mélangée de neurone-astrocyte de l’hippocampe de rat et des cortices sont montrés par Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f.

Les élévations spontanées d’ion de calcium sont visibles seulement au processus astrocytic, pas au corps cellulaire qui est compatible aux rapports précédents. Des élévations spontanées d’ion de calcium par Lck-GCaMP6f dans les neurones hippocampal immatures de rat sont vues à deux Hertz. Les cours du temps pour cinq régions d’intérêt différentes suggèrent que ces élévations sont localement confinées aux domaines subcellulaires.

Les neurones hippocampaux matures de souris infectés par des vecteurs AAV d’expression OER-GCaMP6f montrent des réponses d’ion de calcium en réponse à l’ajout de DHPG. Pour l’imagerie calcique, la puissance de lumination d’excitation est le facteur le plus critique. S’il vous plaît garder la lumière d’excitation aussi bas que possible pour éviter le photo-blanchiment et la photo-toxicité.

La source des signaux calcique peut encore être confirmée par Pomakorzi en utilisant des inhibiteurs spécifiques aux canaux calcique. Le décodage des signaux calciques pour évoquer une production spécifique a été une question biologique fondamentale. Cette technique d’imagerie calcique ouvre la voie à la décrire la diversité des signaux de calcium intracellulaires.