Name: Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Découvrez comment visualiser l'altération des barrières endothéliales et gliales dans l'encéphalomyélite allergique expérimentale chez la souris. Cette méthode permet d'étudier la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique et l'activité des métalloprotéinases matricielles.

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Nous reconnaissons avec Lydia Sorokine, qui a partagé son original in situ zymographie protocole10 avec nous.

Toutes les études ont été menées au titre des directives conformément à la législation suisse sur la protection des animaux et ont été approuvés par l’Office vétérinaire Suisse du Canton de Berne, (numéro d’autorisation : BE 31/17 et être 77/18).
1. logement de souris C57BL/6 dans les conditions (SPF) gratuites agent pathogène spécifique
<ol><li>Cycle de souris communes dans des cages individuelles ventilés avec un 12/12 h lumière-obscurité. Fournir de la nourriture et l’eau ad libitum. Pour superviser la qualité microbiologique des souris, la cohorte expérimentale a subi une surveillance de la santé trimestrielle par literie sale sentinelles suit FELASA recommandations13.</li>
	<li>Utilisation les poinçons d’oreille pour marquer individuellement les souris C57BL/6 femelles de 8-12 semaines vieux.</li>
</ol>2. l’immunisation de souris C57BL/6
<ol><li>Préparation de solutions14:<ol>
<li>Pour l’Adjuvant de Freund complet (FCA), mix 30 mL d’Adjuvant de Freund incomplet avec 120 mg de chaleur fraîchement pestled inactivé Mycobacterium tuberculosis (H37RA) sous une hotte aspirante. Stocker la solution-mère à 4 ° C.</li>
		<li>Pour la solution MOGaa35-55-peptide, dissoudre MOGaa35-55-peptide dans du PBS stérile (4 mg/mL) et conserver à-80 ° C.</li>
		<li>Préparer l’émulsion-MOG :<ol>
<li>Diluer le CFA 1 / 2 avec solution MOG-peptide dans un microtube 2 mL.</li>
			<li>Sceller le microtube avec film d’étanchéité et le fixer sur un vortex en couvrant complètement le tube avec du ruban adhésif. Émulsion de vortex pendant 4 h à 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer les seringues avec émulsion stable :<ol>
<li>Prenez le microtube et tourner rapidement vers le bas de l’émulsion à l’aide d’une centrifugeuse de petite table. Recueillir émulsion dans une seringue à l’aide d’une aiguille d’injection 18 x 1½'' (1,2 x 40 mm).</li>
			<li>Selon le nombre de souris régler le volume de l’émulsion dans la seringue (100 µL/souris) et remplacer l’aiguille 18 G avec une aiguille d’injection 27 x ¾'' (0,4 mm x 19 mm). Sceller l’aiguille d’injection fixé la seringue avec film d’étanchéité.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pour la solution étalon de la toxine (PTx) coqueluche, dissoudre 50 µg de PTx lyophilisée dans 500 µL de PBS stérile (100 ng/µL). Stocker la solution-mère à 4 ° C.</li>
		<li>Pour la solution de travail PTx, mélanger 97 µL de PBS stérile 3 µl de la solution mère de PTx (300 ng/100 µL) par souris (à utiliser une aiguille 30 x ½'' (0,3 mm x 13 mm) d’injection intrapéritonéale).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Induction de l’EAE<ol>
<li>Anesthésier souris C57BL/6 avec isofluorane à l’aide d’un système de vaporisateur. Pour induire l’anesthésie chez les souris, exposer la souris à 4,5 % isofluorane en oxygène dans une chambre de petit d’incubation avant de transférer la souris à un masque facial avec 2,1 % isofluorane. Utiliser une unité d’anesthésie équipée de coussin chauffant pour éviter l’hypothermie, de la souris.</li>
		<li>Fixer la souris anesthésiée dans une main et tout d’abord injecter 30 µL de MOG35-55/CFA-émulsion par voie sous-cutanée dans les flancs de la patte arrière (Figure 1:1 + 2 ; au total 60 µL ; 30 µL et flanc droit 30 µL de flanc gauche) en étroite proximité avec les ganglions inguinaux.</li>
		<li>Placez votre souris sur le ventre et injecter 20 µL de MOGaa35-55/CFA-émulsion dans le tissu adipeux programmable droite et gauche à la racine de la queue (Figure 1:3 + 4 ; au total 40 µL ; racine 20 µL de queue de droite et gauche queue racine 20 µL) et une petite gouttelette de MOGaa35-55/CFA-émulsion int o le cou de la souris (Figure 1: 5).</li>
		<li>Injecter 100 µL de solution de PTx par voie intrapéritonéale chez la souris. Maintenez la tête de la souris sous le centre du corps en évitant l’injection dans l’intestin.</li>
		<li>Remplacer le maintien (extrudat nutriments majeurs : matière grasse brute 4,5 % ; fibre brute 4,5 %, cendres brutes 6,5 % ; amidon 35 %, 18,5 % de protéines brutes ; énergie métabolique : 13,1 MJ/kg) à la diète de reproduction (extrudat fertilisants majeurs : 23,5 % de protéines brutes, matières grasses brutes 5,5 % ; fibres brutes 3 % ; cendres brutes 5,7 % ; amidon 36 % ; l’énergie métabolique : 14,3 MJ/kg) afin de fournir les souris avec de la nourriture de la teneur énergétique plus élevée avant et pendant la maladie clinique attendue.</li>
		<li>Retirer le masque facial et transférer la souris dans sa cage maison avec un coussin chauffant. Assurez-vous que la souris est pleinement éveillé et mobiles au bout de 10 minutes.</li>
		<li>Renouveler l’injection de PTx (2.2.4) 48 h après le premier traitement.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. cotation des souris EAE
<ol><li>Vérifier l’état de santé des souris EAE chaque matin en prenant un coup d’oeil à l’intérieur des cages.</li>
	<li>Score de souris EAE tous les après-midi.</li>
	<li>Prendre chaque souris individuelle incluse dans l’expérience de l’EAE hors de la cage et vérifiez si la queue a un tonus en le déplaçant vers le haut avec un doigt. Une souris en bonne santé maintiendra sa queue (la queue a un tonus). Si EAE clinique a commencé, le tonus de la queue sera basse, visible par une baisse progressive de la queue. Finalement, la souris ne sera pas capable de soulever sa queue du tout.</li>
	<li>Placez chaque souris individuelle incluse dans l’expérience de l’EAE sur le banc propre et observer et documenter le comportement de marche. Voir le tableau 115 pour les critères de notation pour l’évaluation de la gravité de la maladie (la partition de l’EAE).</li>
	<li>Évaluer et documenter le poids de chaque souris comprise dans le test.</li>
	<li>Pour assurer une alimentation adéquate et l’absorption d’eau par souris affichant un EAE clinique score de 1 alimentation humide aliments dans un récipient en plastique sur le fond de la cage et actualise tous les jours.</li>
</ol>4. essai de perméabilité In vivo
<ol><li>Préparations de solutions :<ol>
<li>Pour les solutions mères de dextran, dissoudre 10 mg de 10 kDa 488 de Dextran Alexa Fluor ainsi que 3 kDa Dextran Texas Red dans 500 µL de solution de chlorure de sodium 0,9 % (20 mg/mL).</li>
		<li>Pour la solution de travail dextran, juste avant l’injection ajouter 55 µL de 10 kDa 488 de Dextran Alexa Fluor solution (20 mg/mL) sur un morceau de film d’étanchéité de mère et ajouter 55 µL de 3 kDa dextran solution mère de Texas Red (20 mg/mL). Mélanger et prélever 100 µL dans une seringue jetable et fine (concentration finale 2 mg/100 µL).</li>
		<li>Pour la solution mère de formaldéhyde (PFA) de 10 %, mélanger 10 g de poudre extra pure PFA, 100 mL de PBS et 200 µL de solution de NaOH 1N dans un bécher de verre propre et de la chaleur jusqu'à précisément de 56 ° C sous agitation à l’aide d’un agitateur magnétique ; garder à 56 ° C pendant 30 min jusqu'à dissolution complète de la PFA ; refroidir à température ambiante ; ajuster le pH à 7,4 ; et filtrer sur un filtre en papier. Conserver à - 20 ° C. La solution peut être diluée plus loin à l’aide de PBS.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Peu de temps anesthésier chez la souris C57BL/6 ou souris C57BL/6 souffrant d’EAE à l’isoflurane (la souris va être sous sédation pendant environ 1 min). Utiliser un système automatisé comme au point 2.2.1 (souris seront exposés à 4,5 % isoflurane en oxygène dans une chambre à induction et ensuite transférées dans un masque facial avec 2,1 % isoflurane).</li>
	<li>Placez votre souris anesthésiée en position latérale sur la table, puis par voie intraveineuse (p. ex. rétro-orbitalement) injecter 100 µL de traceurs fluorescents à la souris avant de la souris se réveille.</li>
	<li>Retirer le masque facial immédiatement et assurez-vous que la souris est pleinement éveillé et motiles après l’anesthésie courte. Laisser le traceur à circuler pendant 15 min.</li>
	<li>Passez à l’étape 5.1.</li>
</ol>5. la perfusion de souris
<ol><li>
Pour l’évaluation de la perméabilité in vivo :
	<ol>
<li>Commencer la procédure 15 min après l’injection du traceur fluorescent en induisant l’anesthésie isoflurane profonde. Pour induire une anesthésie profonde chez la souris utiliser 2,3 % d’isoflurane en oxygène. Le réflexe de retrait patte permet de juger de la profondeur de l’anesthésie (pincer la peau entre les orteils, un manque de flexion indique une profondeur suffisante) et sonder les réflexes de la patte antérieure et le membre postérieur chez les souris soumises à l’EAE.</li>
		<li>Difficulté de la souris sur le dos et le ventre de pulvérisation avec de l’éthanol. Ouvrir la cage thoracique à l’aide de ciseaux et retirer la membrane. Ouvrez l’oreillette droite du cœur battant à l’aide de ciseaux et perfuse la souris à travers le ventricule gauche du coeur avec 10 mL de PBS puis 10 mL de 4 % PFA dans du PBS. Attention : Pour éviter d’inhaler des PFA, perfuse la souris sous une hotte.</li>
		<li>Passez à la section 6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour in situ zymographie :
	<ol>
<li>Induire l’anesthésie isoflurane profonde l’isoflurane de 2,3 % en oxygène dans une souris souffrant d’EAE et vérifier la profondeur de l’anesthésie comme au point 5.1.1.</li>
		<li>Ensuite, fixer la souris sur le dos et le ventre de pulvérisation avec de l’éthanol. Ouvrir la cage thoracique à l’aide de ciseaux et retirer la membrane. Ouvrez l’oreillette droite du cœur battant à l’aide de ciseaux et perfuse la souris à travers le ventricule gauche du coeur avec 20 mL de PBS.</li>
		<li>Passez à la section 6.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. dissection et gel des cerveaux
<ol><li>Préparation du bain de refroidissement :<ol>
<li>Remplir un récipient de dewar plat avec glace pilée et ajoutez 2-méthylbutane (Isopentane) jusqu'à ce que le liquide atteigne environ 1 cm au-dessus du pack de glace carbonique. Couvrir avec un couvercle lâche – par exemple, un couvercle de seau à glace.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Couper la tête de la souris perfusée avec des ciseaux pointus et enlever la peau et des oreilles à l’aide d’un ensemble plus restreint de ciseaux.</li>
	<li>Disséquer attentivement la Scutellaire en coupant depuis le trou occipital vers l’avant à gauche et à droite permettant d’upfold la calotte sur le cerveau. Ensuite, soulevez lentement sur le cerveau intact de la base du crâne tout en coupant les nerfs optiques à l’aide d’une spatule plate en métal.</li>
	<li>Placez le cerveau sur feuille d’aluminium et couper le cerveau en trois morceaux (frontale cerveau, cerveau moyen et cervelet + tronc cérébral) en plaçant deux coupes coronales.</li>
	<li>Remplir un cryomold (25 x 20 x 5 mm) pour le premier trimestre avec matrice de découpage (PTOM) de température optimale, placer des tranches de cerveau avec la face antérieure de chaque morceau de cerveau vers le bas dans le cryomold et couvrir le tissu complètement avec la matrice des PTOM.</li>
	<li>Placer le cryomold avec le tissu dans une orientation horizontale dans le bain 2-Méthylbutane et s’assurer que le tissu se fige, du bas vers le haut dans la minute en évitant de plonger le bloc de tissu ensemble dans le bain.</li>
	<li>Transfert de tissus congelés à-80 ° C pour le stockage et passez à la section 7.</li>
</ol>7. préparation des coupes de tissus congelés
<ol><li>Equilibrer la température des tissus congelés de-80 ° C à-20 ° C dans le cryostat pendant 30 min.</li>
	<li>Retirer le bloc de tissu du cryomold et monter sur le support de papier cryostat (réglé à-15 ° C) à l’aide de la matrice des PTOM.</li>
	<li>Découpez les bords du bloc de tissu sur le support du cryostat avec un scalpel tranchant et commencer à couper dans le bloc de tissu en enlevant 20 µm sections avec le couteau du cryostat, jusqu'à ce que le tissu soit visible.</li>
	<li>
Pour l’analyse de la perméabilité BBB in vivo :
	<ol>
<li>Couper des sections de tissu de 6 à 10 µm, collectionnez-les sur lames de verre d’adhérence et d’image immédiatement les sections recouvertes d’une lamelle couvre-objet à l’aide d’un microscope à fluorescence.</li>
		<li>Évaluer l’apparence des vaisseaux sanguins dans le cerveau (faire attention aux aiguës les frontières des vaisseaux non perméable par rapport à la diffusion des profils de fluorescence observés pour les vaisseaux sanguins qui fuites). Comme contrôle positif, vérifier les fuites du traceur dans le stroma des organes circumventriculaires ou les plexus choroïdes qui n’ont pas un BBB.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Pour in situ zymographie :
	<ol>
<li>Couper 6 µm des sections de tissu à l’aide d’un cryostat, collectionnez-les sur lames de verre d’adhérence et congeler à-20 ° C dans une boîte de gel contenant du gel de silice dans le couvercle des sections de tissu.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. in situ zymographie combiné avec laminin/CD45 immunofluorescence souillant
<ol><li>Préparer des solutions :<ol>
<li>Préparer la solution de l’encastrement :<ol>
<li>Mélanger les 6 g de glycérol (pureté analytique), 2,4 g de poly (alcool vinylique), 6 mL de ddH2O et 12 mL de tampon Tris de 0,2 M, pH 8 et remuer (agitateur magnétique) la solution pendant 4 h à température ambiante.</li>
			<li>Transvaser la solution dans un tube à centrifuger 50 mL et laissez-la reposer pendant 2 h à température ambiante. Par la suite incuber la solution pendant 10 min à 50 ° C (bain-marie) et centrifuger pendant 20 min à 2 700 x g à la température ambiante.</li>
			<li>Prenez le surnageant et congeler en portions à-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer la solution de gélatine froide :<ol>
<li>Dissoudre 0,1 g de gélatine froide de peau bovine dans 10 mL de ddH2O.</li>
			<li>Laisser tremper pendant au moins 1 jour et stocker les aliquotes à 4 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer le méthanol glacée (-20 ° C) :<ol>
<li>Mettre 100 % de méthanol dans une coloration et refroidir à-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer 10 % solution mère de l’azoture de sodium :<ol>
<li>Ajouter 1 g d’azide de sodium à 10 mL de ddH2O et conserver à température ambiante.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer la solution de travail d’azoture de sodium 0,1 % :<ol>
<li>Mix 99 µL du ddH2O 1 µl de la solution mère 10 % sodium azide.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Dissoudre 1 mg de fluorescéine conjuguée ajouté un colorant (DQ) gélatine de peau de porc dans 1 mL de l’azide de sodium travail solution et magasin 100 µL d’extraits abri de la lumière à 4 ° C.</li>
		<li>Dissoudre 30 mg de 1, 10-phénanthroline monohydraté dans 76 µL d’éthanol et de conserver à-20 ° C.</li>
		<li>Préparer 25 x solution d’inhibiteur de protéase :<ol>
<li>Ajouter 1 comprimé d’inhibiteur de protéase libre d’EDTA à 2 mL de ddH2O. Conserver à-20 ° C.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Juste avant utilisation, préparer la solution de réaction (150 µL/section) :<ol>
<li>Centrifuger le 1 mg/mL de solution de gélatine DQ pendant 5 min à 13 300 x g.</li>
			<li>Mix 127,2 µL de ddH2O, 15 µL de 10 x tampon de réaction (trousse Gélatinase/collagénase ; voir Table des matières), 0,3 µL de gélatine froide 20 mg/mL, 1,5 µL de gélatine DQ 1 mg/mL et 6 µL de 25 x solution d’inhibiteur de protéase.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Juste avant utilisation, préparer phenantroline solution de réaction de contrôle négatif (150 µL/section) :<ol>
<li>Mix 125.2 µL de ddH2O et 15 µL de 10 x tampon de réaction, 0,3 µL de gélatine froide 20 mg/mL, 1,5 µL de gélatine DQ 1 mg/mL, 6 µL de 25 x inhibiteur de la protéase EDTA libre 2 µL de 1,10 M 2-phenantroline (inhibiteur de la MMP).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Juste avant utilisation, préparer la solution de réaction de contrôle négatif (non fluorescent) gélatine froide (150 µL/section) :<ol>
<li>Mix 128,7 µL de 6 µL d’inhibiteur de protéase x 25 sans EDTA, 0,3 µL de gélatine froide 20 mg/mL, ddH2O et 15 µL de 10 x tampon de réaction.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Préparer des anticorps primaire cocktail pour contre-coloration, par exemple, 0,95 µg/mL d’anticorps anti-laminin anticorps polyclonal de lapin et 10 µg/mL rat polyclonaux anti-CD45 anticorps BSA 1 % dans du PBS et préparer isotype appropriées de contrôle des cocktails de l’anticorps primaire.</li>
		<li>Préparer des solution d’anticorps secondaire, par exemple, 7,5 µg/mL Cy3 chèvre anti-rat + 15 µg/mL anti-lapin AMCA BSA 1 % dans du PBS (protéger de la lumière).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Décongeler 6 sections de tissu de cerveau non fixée µm de souris EAE à l’intérieur de la boîte de congélation en plastique contenant du gel de silice dans le couvercle dans une hotte aspirante pour éviter la rétention d’eau dans les tissus et séparer les 2 sections de tissu sur une diapositive en dessinant des lignes avec une plume hydrofuge</li>
	<li>Préparer des solutions (pas 8.1.9-8.1.11) de la réaction, centrifuger pendant 5 min à 13 400 g à température ambiante et pré chaud à 37 ° C à l’aide d’un bain d’eau.</li>
	<li>Réhydrater les coupes de tissus pendant 5 min à 37 ° C à l’aide de 1 x tampon de réaction. Ensuite, videz la 1 x tampon de réaction, ajouter la solution de réaction sur les sections de tissu et incuber pendant 4 h à 37 ° C. Les lames 5 fois en ddH2O.</li>
	<li>Difficulté des sections pendant 5 min avec du méthanol glacée à-20 ° C et ensuite laver les sections une fois avec du PBS à température ambiante.</li>
	<li>Ajouter 1 % de BSA dans du PBS dans les sections et incuber pendant 20 min à température ambiante (protéger de la lumière). Ensuite, jeter 1 % BSA dans du PBS des sections par retournement de la glisse sur le tissu, ajouter le cocktail de l’anticorps primaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante (protéger de la lumière).</li>
	<li>Laver les sections deux fois avec du PBS, ajouter le cocktail d’anticorps secondaire et incuber pendant 1 heure à température ambiante (protéger de la lumière).</li>
	<li>Laver les sections deux fois avec du PBS, monter les lames avec intégration de solution, laisser sécher toute la nuit à température ambiante les sections montées (protéger de la lumière). Enfin, analyser des sections de tissu teinté à l’aide d’un microscope à fluorescence.</li>
</ol>

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<li>Grewal, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD62L+is+required+on+effector+cells+for+local+interactions+in+the+CNS+to+cause+myelin+damage+in+experimental+allergic+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD62L is required on effector cells for local interactions in the CNS to cause myelin damage in experimental allergic encephalomyelitis.</a> Immunity. 14, 291-302 (2001).</li>
</ol>

Aucun conflit d’intérêts ne déclarés.

Nous présentons ici un protocole pour induire et contrôler l’EAE chez les souris C57BL/6 femelles. Les femelles sont préférentiellement choisies, et on observe une incidence des femmes : hommes de 3:1 dans la SP. Pour évaluer la gravité de l’EAE, nous avons fait utiliser une feuille de notation de 3 points. Gravité de l’EAE est généralement marquée par rapport à la gravité des dysfonctionnements moteurs. Souris avec pointe de stades de l’EAE, c'est-à-dire présentant un score supérieur à 2 devrait être sacrifié pour évite...

Le système nerveux central (CNS) coordonne tous les corps et les fonctions mentales chez les vertébrés, et homéostasie CNS est essentiel pour une bonne communication des neurones. L’homéostasie du CNS est justifié par l’unité neurovasculaire (UNV), qui protège le système nerveux central du milieu changeant de la circulation sanguine. Le NVU est composé de cellules endothéliales microvasculaires CNS, qui sont biochimiquement unique et mettre en place la barrière sang - encéphalique (BHE) en continu diaphonie avec les péricytes et astrocytes, neurones, constituants de la matrice extracellulaire (ECM), instituant deux distinctes des membranes basales1. La membrane basale endothéliale que cellules l’aspect abluminal des cellules endothéliales BBB recèle un nombre élevé de péricytes et se compose de la laminine α4 et laminine α5, en plus d’autres protéines de ECM2. En revanche, la membrane basale parenchymateuse se compose de la laminine α1 et α2 de laminine et est adoptée par fin-pieds astrocytaires. La membrane basale parenchymateuse ainsi que les astrocytes fin-pieds compose la glia limitans qui sépare le réseau neuronal CNS du périvasculaires rempli de liquide céphalo-rachidien ou espaces sous-arachnoïdienne3. En raison de l’architecture unique de l’UNV, des cellules immunitaires dans le SNC le trafic sont distinct que dans les tissus périphériques car il nécessite un processus en deux étapes avec les cellules immunitaires, tout d’abord viole la BHE endothéliale et par la suite le limitans glia afin de atteindre le parenchyme de la CNS.
Sclérose en plaques (MS) est une maladie fréquente des thérapeutiques de la CNS, dans lequel un grand nombre de cellules immunitaires circulantes entrer dans le SNC et provoquer la neuroinflammation et démyélinisation focale perte d' intégrité BBB4. Perte d’intégrité BBB est un début de MS, comme en témoigne la présence de contraste gadolinium amélioration des lésions dans le système nerveux central comme visualisées par l’imagerie par résonance magnétique (IRM)5. Extravasation de leucocyte dans le SNC se produit au niveau des veinules postcapillaires ; Cependant, les mécanismes précis diapédèse des cellules immunitaires à travers la membrane basale BBB et par la suite la barrière gliale restent à explorer. Encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) sert un modèle animal de la SP et a largement contribué à nos connaissances actuelles sur la pathogénie de MS. Par exemple, en utilisant le modèle de l’EAE on a découvert qu’extravasation de leucocyte se produit dans un processus multipas, y compris une capture initiale et laminage étape par l’intermédiaire de sélectines et les molécules de type mucine comme ligand de glycoprotéine P-sélectine (se) -1, suivie de l’arrestation ferme intégrine-dépendante et rampant des lymphocytes T sur les cellules endothéliales de BBB à côtés permissives pour diapédèse6.
Une fois que les cellules T ont traversé le BBB endothélial et la membrane basale endothéliale, ils doivent rencontrer leur antigène analogue sur les macrophages ou cellules dendritiques stratégiquement localisés dans les espaces méningées ou périvasculaires. Cette interaction induit focale production de médiateurs pro-inflammatoires que déclencher les mécanismes suivants requis pour invasion tissulaire CNS des cellules immunitaires par l’intermédiaire de la glia limitans7,8,9. Activation de focale-métalloprotéinases matricielles (MMP) -2, MMP-9 modifie chemokine activation et provoque la dégradation des récepteurs de la matrice extracellulaire sur astrocyte-embouts, qui est une condition sine qua non pour immunitaire cell migration à travers la limitans de cellules gliales dans le Parenchyme CNS et d’induire l’apparition des symptômes cliniques de l’EAE10,11.
La combinaison de détection des CNS s’infiltrer dans les cellules immunitaires avec BBB activité fuite et gélatinase dans des sections de tissu CNS fournit des informations précieuses sur l’intégrité fonctionnelle de la barrière endothéliale et gliale dans le contexte de la neuroinflammation. Par exemple, nous avons étudié récemment la perte constitutive de la molécule d’adhérence jonctionnelles molécule endothéliales jonction serrée (JAM)-B dans le trafic de cellules immunitaires dans le SNC dans le contexte de l’EAE. Chez la souris C57BL/6 type sauvage, sains littermates JAM-B-deficient montrent à sans altération de l’intégrité de la BBB comme indiqué par l’évaluation de la perméabilité in vivo à l’aide de traceurs tant endogène qu’exogène,12. Dans le contexte de l’EAE, JAM-B-deficient C57BL/6 souris ont montré des symptômes de maladie flexibilit, qui a été associée par piégeage de cellules inflammatoires dans les espaces méningées et périvasculaires à12. Pour étudier ce phénomène, nous avons appliqué in situ zymographie, permettant d’identifier l’activité gélatinase afin de tester si le manque d’activité de gélatinase dans les souris déficientes en B-confiture peut être responsable de la réduction du nombre de cellules immunitaires capables de rompre le glia limitans12.
Compte tenu de la disponibilité des différents génétiquement souris modèles n’ayant pas, par exemple, différentes molécules de jonction serrée BBB qui peuvent entraîner des modifications en fonction de la BBB, méthodologies d’enquête sur l’intégrité BBB sont importants. En outre, nouveaux médicaments pourraient avoir une incidence sur les obstacles NVU. Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active avec la glycoprotéine oligodendrocyte de myéline (MOG)-peptide AA 35-55 en adjuvants de Freund complet. Puis, nous expliquons comment localiser l’infiltration de cellules immunitaires à travers les barrières endothéliales et gliales de l’UNV et étudier l’intégrité des barrière endothéliale et gliales in vivo par détection in situe des traceurs exogènes et activité de gélatinase, respectivement.

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-lapin AMCA</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-045</td><td>Magasin à 4 &deg ; C; protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Anticorps anti-CD45 (30F11)</td><td>Pharmingen</td><td>07-1401</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Anticorps anti-laminine</td><td>DAKO</td><td>Z0097</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Nourriture d’élevage</td>, <td>par exemple PROVIMI KLIBA SA</td><td>3336</td><td></td></tr><tr><td>Cages ventilées individuellement, ligne bleue de type II ou III,</td><td>par exemple Tecniplast </td><td>1145T, 1285L</td><td></td></tr><tr><td>BSA fraction V</td><td>Applichem</td><td>A1391</td><td>Stocker à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>Gélatine froide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G 9391</td><td></td></tr><tr><td>Pot Coplin + support,</td><td>par ex. Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>H554.1 ; H552.1</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 anticorps anti-rat</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-156-144</td><td>Stocker à 4 &deg ; C; protection contre la lumière</td></tr><tr><td>Couvercles 24 x 40 mm # 1</td><td>par exemple Thermo Scientific</td><td>85-0186-00</td><td></td></tr><tr><td>Dextran Alexa Fluor 488 (10 000 MW)</td><td>par exemple Sondes moléculaires</td><td>D22910</td><td>Stocker à -20 &deg ; C; protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Dextran Texas Red (3000 MW)</td><td>Invitrogen</td><td>D3328</td><td>Se conserve à -20 &deg ; C; protéger de la lumière Kit de</td></tr><tr><td>dosage de gélatinase/collagénase EnzChek&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher Scientific ; EnzCheck</td><td>E12055</td><td>Stocker à -20 &deg ; C; protection de la forme légère</td></tr><tr><td>Souris femelles C57BL/6J (8-12 semaines)</td><td>par exemple Janvier Labs</td><td></td><td>Femelles, 8-12 semaines</td></tr><tr><td>Boîte de congélation pour lames d’histologie</td><td>, par exemple Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>2285.1</td><td></td></tr><tr><td>18G x 1&frac12 ; &rsquo; &rsquo; aiguille d’injection (1,2 mm x 40 mm),</td><td>par exemple BD, BD Microlance 3</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>27G x &frac34 ; &rsquo; &rsquo; &ndash ; Aiguille d’injection n° 20 (0,4 mm x 19 mm),</td><td>par exemple BD, BD Microlance 3</td><td>302200</td><td></td></tr><tr><td>30G x &frac12 ; &rsquo; &rsquo; (0,3 mm x 13 mm) aiguille d’injection</td><td>, par exemple BD, BD Microlance 3</td><td>304000</td><td></td></tr><tr><td>Incomplete Freund' s adjuvant (IFA)</td><td>e.g. Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-24648</td><td>Stocker à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>Entretien alimentaire</td><td>, p.ex. PROVIMI KLIBA SA</td><td>3436</td><td></td></tr><tr><td>MOGaa35-55 peptide</td>, <td>pex. GenScript</td><td></td><td>Store à -80 &deg ; </td></tr><tr><td>Lames de microscope C (Superfrost Plus) Thermo</td> <td>Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Mycobacterium tuberculosis H37RA</td><td>par exemple BD</td><td>231141</td><td>Store à 4 &deg ; C&nbsp ;</td></tr><tr><td>NaCl 0,9 %</td><td>B. Composé</td><td>3535789</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. de Braun (Tissue-Tek )</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 30G x &frac12 ; &rsquo; '</td><td>B. Braun</td><td>9151125S</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Merck</td><td>30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Toxine coquelucheuse</td><td>, p. ex. List biological laboratories, Inc.</td><td>180</td><td>Magasin à 4 &deg ; C</td></tr><tr><td>poly(alcool vinylique) (Mowiol 4-88)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de protéase sans EDTA (Roche)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693132001</td><td>Stocker à 4 &deg ; Stylo</td></tr><tr><td>répulsif, par exemple DAKO Pen</td>, <td>par exemple DAKO</td><td>S2002</td><td></td></tr>, <tr><td>film d’étanchéité, par exemple Parafilm M,</td><td>par exemple Sigma-Aldrich</td>, <td>P7793</td><td></td></tr>, <tr><td>gel de silice</td><td>, par exemple Carl Roth GmbH + Co., KG</td><td>9351.1</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à coudre</td>, <td>F.S.T</td><td>15012-12</td><td></td></tr>, <tr><td>seringue 1 ml</td><td>, par exemple PRIMO</td><td>62.1002</td><td></td></tr>, <tr><td>seringue 10 ml</td><td>, par exemple CODAN Medical ApS</td><td>2022-05</td><td></td></tr><tr><td>système de vaporisation Univentor 400</td><td>UNO. Bv</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

L’unité neurovasculaire (UNV) est composée de cellules endothéliales microvasculaires formant la barrière sang - encéphalique (BHE), une membrane basale endothéliale avec péricytes embarqués, et le glia limitans composé par la membrane basale parenchymateuse et astrocytes fin-feed embrassant l’aspect abluminal des microvaisseaux de système nerveux central (SNC). En plus de maintenir les CNS homéostasie l’UNV contrôle traite des cellules immunitaires dans le SNC. Au cours de l’immunosurveillance du SNC des lymphocytes activés en faibles effectifs peuvent traverser la barrière endothéliale sans causer le dysfonctionnement BBB ou cliniques de la maladie. En revanche, au cours de la neuro-inflammation comme dans la sclérose en plaques ou son modèle animal encéphalomyélite allergique expérimentale (EAE) un grand nombre de cellules immunitaires peut croiser le BBB et par la suite la glia limitans atteignant le parenchyme de la CNS conduisant à la maladie clinique. 
Migration de cellules immunitaires dans le parenchyme de la CNS est donc un processus en deux étapes qui implique une migration séquentielle à travers la barrière endothéliale et gliale de l’UNV employant les mécanismes moléculaires distincts. Si après leur passage à travers la barrière endothéliale, lymphocytes T rencontrent leur apparenté antigène sur les cellules présentatrices d’antigène périvasculaires, leur réactivation locale va initier les mécanismes conduisant à l’activation de focale des gélatinases, qui permettra aux lymphocytes T à traverser la barrière gliale et entrer dans le parenchyme de la CNS. Ainsi, évaluer tous les deux, perméabilité BBB et activité du MMP en corrélation spatiale à l’accumulation de cellules immunitaires dans le SNC au cours de l’EAE permet de spécifier la perte d’intégrité des barrières endothéliales et gliales de l’UNV. 
Ici, nous montrons comment induire EAE chez les souris C57BL/6 par immunisation active et analyser par la suite la perméabilité BBB in vivo à l’aide d’une combinaison des traceurs fluorescents exogènes. Nous montrons également, comment visualiser et localiser l’activité gélatinase dans les cerveaux de l’EAE en zymogaphy in situ, couplé à des salissures par immunofluorescence des membranes basales BBB et CD45 + invasion des cellules immunitaires.

Évaluation de l’évolution clinique de l’EAE chez les souris C57BL/6 devrait se traduire par une courbe de la maladie comme illustré à la Figure 2 a et variations dans le poids de corps de souris tels que présentés dans la Figure 2 b. C57BL/6 souris immunisées avec MOGaa35-55 habituellement commencent à développer des symptômes de la maladie autour de jour 10-12 après immunisation active (Figure 1 a). En général, souris immunisées mo...

Nous présentons ici les protocoles pour enquêter sur la dépréciation de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale in vivo. Nous abordons plus précisément comment déterminer la perméabilité de la barrière hémato - encéphalique et activité de gélatinase impliquée dans la migration des leucocytes à travers la glia limitans.

Visualiser l’altération des barrières endothéliales et gliales de l’unité neurovasculaire au cours de l’encéphalomyélite allergique expérimentale In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

Les méthodes présentées ici nous permettent d’étudier les mécanismes moléculaires de la migration des cellules immunitaires à travers les barrières cérébrales dans l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale, un modèle animal pour la sclérose en plaques. En étudiant la perméabilité de barrière de sang-cerveau et l’activité matrix-metalloprotease en même temps dans la corrélation spatiale à l’infiltration de cellules immunisées dans les sections de tissu de cerveau, nous pouvons précisément associer ces événements neuroinflammatory aux signes cliniques d’EAE. La manipulation professionnelle des souris malades nécessite une formation approfondie, ainsi que la notation correcte des signes cliniques de l’EAE.Ainsi, la démonstration visuelle est bénéfique. Commencez cette procédure par l’anesthésie des souris C57-Black/6 qui ont été logées dans des conditions spécifiques exemptes d’agents pathogènes, telles que décrites dans le protocole textuel. Fixez la souris anesthésiée dans une main, injectez 30 microlitres de peptide MOG et complétez l’émulsion adjuvante de Freund sous-cutanée dans chacun des flancs de la jambe postérieure, à proximité des ganglions lymphatiques inguinaux.Maintenant, placez la souris sur son ventre, et injectez 20 microlitres de l’émulsion MOG-peptide dans le tissu adipeux mou à gauche et à droite à la racine de la queue. Aussi, injecter une petite gouttelette de l’émulsion dans le cou de la souris. Injecter 100 microlitres de solution de toxine de coqueluche intraperitoneally dans la souris.Tenez la tête de la souris sous le centre du corps pour éviter l’injection dans l’intestin. Remplacer le régime alimentaire d’entretien par le régime alimentaire reproducteur afin de fournir aux souris des aliments d’une teneur énergétique plus élevée avant et pendant la maladie clinique prévue. Répétez l’injection de toxine de coqueluche 48 heures après le premier traitement.Vérifiez l’état de santé des souris EAE tous les matins en jetez un oeil à l’intérieur des cages. Marquez des souris EAE tous les après-midi. Sortez chaque souris incluse dans l’expérience EAE de la cage et vérifiez si la queue doit tonus.Déplacez la queue vers le haut avec un doigt. Une souris en bonne santé gardera sa queue vers le haut. Si l’EAE clinique a commencé, le tonus de queue sera inférieur, visible par une baisse graduelle de la queue.Finalement, la souris ne sera pas en mesure de soulever sa queue du tout. Placez chaque souris individuelle incluse dans l’expérience EAE sur le banc propre pour observer et documenter le comportement de marche. Voir le texte pour les critères de notation pour l’évaluation de la gravité de la maladie, qui est le score EAE.Évaluer et documenter le poids de chaque souris incluse dans l’expérience. Pour préparer des solutions de stock dextran, dissoudre 10 milligrammes de de trois kilodaltons Dextran Texas Red en 500 microlitres de solution chlorure de sodium à 0,9% et cinq milligrammes de 10 kilodaltons Dextran Alexa Fluor 488 en 250 microlitres de solution chlorure de sodium à 0,9%. Pour la solution de travail dextran, juste avant l’injection, pipette 55 microlitres de 10 kilodalton Dextran Alexa Fluor 488 solution de stock sur un morceau de film d’étanchéité.Ensuite, ajoutez 55 microlitres de solution de stock de trois kilodaltons Dextran Texas Red. Mélanger et recueillir 100 microlitres dans une seringue fine jetable. Ensuite, placez une souris anesthésiée en position latérale sur la table.Injectez par voie intraveineuse 100 microlitres de traceurs fluorescents dans la souris avant que la souris ne se réveille. Laissez le traceur circuler pendant 15 minutes avant d’effectuer la perfusion des souris comme détaillé dans le protocole de texte. Remplir un récipient plat de dewar de glace sèche concassée et ajouter 2 méthylbutane jusqu’à ce que le liquide atteigne environ un centimètre au-dessus de la banquise sèche.Couvrir d’un couvercle lâche, comme un couvercle de seau à glace. Après avoir coupé la tête de la souris perfusée avec des ciseaux pointus, retirez la peau et les oreilles à l’aide d’un plus petit ensemble de ciseaux. Disséquer soigneusement la calotte crâneuse en coupant du magnum foramen vers l’avant à gauche et sur le côté droit, pour permettre le ressac de la calotte sur le cerveau.Puis, soulevez soigneusement le cerveau intact de la base du crâne tout en coupant les nerfs optiques à l’aide d’une spatule en métal plat. Placez le cerveau sur du papier d’aluminium. Couper le cerveau en trois morceaux en plaçant deux coupes coronale.Les trois pièces représentent le cerveau frontal, le cerveau moyen et le cervelet avec le tronc cérébral. Remplissez un Cryomold jusqu’au premier trimestre avec une matrice de coupe à température optimale. Ensuite, placez les tranches de cerveau dans le Cryomold, avec le côté antérieur de chaque morceau de cerveau faisant face vers le bas.Couvrez complètement le tissu de matrice. Placez le Cryomold avec le tissu dans une orientation horizontale dans le bain à 2 méthylbutanes. Assurez-vous que le tissu gèle du bas vers le haut dans la minute en évitant de plonger l’ensemble du bloc tissulaire dans le bain.Transférer les tissus congelés à moins 80 degrés Celsius pour les entreposer. Voir le protocole texte pour la préparation des sections des tissus congelés. Récupérer six microns, sections de tissu cérébral non fixe qui avaient été préparés à partir de souris EAE.Dans un capot de fumée, décongeler les sections à l’intérieur de la boîte de congélation en plastique contenant du gel de silice dans le couvercle pour éviter la rétention d’eau dans le tissu. Séparez deux sections de tissu sur une diapositive en dessinant des lignes avec un stylo répulsant l’eau. Solutions de réaction centrifugeuse pendant cinq minutes à 13, 300 fois g à température ambiante, et préchauffer à 37 degrés Celsius à l’aide d’un bain d’eau.Ensuite, réhydrater les sections tissulaires pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius à l’aide d’un tampon de réaction 1X. Après cinq minutes, versez le tampon de réaction 1X. Ajoutez une solution de réaction sur les sections tissulaires et incubez pendant quatre heures à 37 degrés Celsius.Ensuite, lavez les glissières cinq fois dans de l’eau doublement distillée. Maintenant, fixez les sections pendant cinq minutes avec du méthanol glacé à moins 20 degrés Celsius avant de les laver une fois avec du PBS à température ambiante. Ajouter 1%BSA en PBS à la section, et incuber pendant 20 minutes à température ambiante.Ensuite, jetez le tampon de la section en renversant la lame sur un tissu. Ajouter le cocktail d’anticorps primaires à la section et incuber pendant une heure à température ambiante. Après avoir lavé les sections deux fois avec du PBS, ajouter le cocktail secondaire d’anticorps et incuber pendant une heure à température ambiante.Ensuite, lavez les sections deux fois avec PBS, et montez les diapositives avec la solution d’intégration. Après avoir laissé sécher les sections montées toute la nuit à température ambiante, analyser les sections de tissus tachés à l’aide d’un microscope fluorescent. La gravité de la maladie d’EAE augmente jusqu’au pic de la maladie, qui peut être prévu entre les jours 16 et 20 après l’induction d’EAE.Au sommet de l’EAE clinique, les souris ont également montré le poids corporel le plus bas, qui augmente en corrélation avec l’amélioration de l’EAE dans la phase de rémission de la maladie. On y voit une image représentative du plexus choroïde et du parenchyme cérébral adjacent d’une souris C57-Black/6 souffrant d’EAE. La souris a été injectée par voie intraveineuse 15 minutes avant de sacrifier.Les traceurs se diffusent facilement à travers les microvétères fenestrated dans la stomie du plexus choroïde, tandis que la barrière hémato-encéphalique ne permet pas la diffusion de traceurs circulants dans le parenchyme cérébral, qui est donc dépourvu de tout signal fluorescent. Ces images montrent des vaisseaux sanguins représentatifs qui fuient dans le cervelet d’une souris C57-Black/6 souffrant d’EAE. Les pointes de flèche indiquent des traceurs diffusés à travers les microvessels de cerveau dans le parenchyme de CNS, suggérant que la fonction de barrière hémato-encéphalique soit altérée dans ces vaisseaux.Dans le parenchyme du SNC, le signal fluorescent vert et rouge est visible à l’extérieur des parois des vaisseaux sanguins. Le placement sous-cutané correct de l’émulsion MOG-CFA est essentiel pour monter la réponse immunitaire appropriée menant à l’EAE. L’injection intraperitoneal et intramusculaire devrait être évitée.Préparer le CFA sous un capot de fumée pour éviter l’inhalation de la Mycobacterium atténuée. En outre, évitez l’auto-injection avec l’émulsion MOG-CFA, car cela peut causer le condylome ou même conduire à l’EAE chez les personnes qui sont génétiquement prédisposées. Les cellules immunitaires infiltrant le cerveau peuvent être isolées du SNC de souris souffrant d’EAE pour quantifier l’infiltration de sous-ensembles de cellules immunitaires pendant la neuroinflammation par cytométrie d’écoulement.L’évaluation de l’intégrité de l’endothélial et des barrières glialement cérébrales peut se traduire par l’analyse de modèles muraux génétiquement modifiés ou par des modèles d’autres troubles neurologiques.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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