Méthode de préparation d'échantillons de microscope électronique de balayage et de transmission pour les appendices du bec de bois

Coléoptère de bois leur surface de corps sont toujours dures dans SEM. Le Tween-20 est ajouté dans la solution fixative et de lavage. La surface du corps du coléoptère du bois Dans TEM, le Tween-20 peut améliorer la pénétration fixative dans la paroi du corps et mieux fixer les tissus et les organes dans le corps.

Le microscope à fluorescence est utile pour améliorer la précision du tranchage. La technique est utile pour laver la surface du corps et pénétrer dans la paroi du corps dans le coléoptère woodboring. Ainsi, il permettrait d’effacer la vision SEM et TEM.

Microscope à fluorescence est utile pour améliorer la précision de tranchage dans TEM. Zhang Yanru, un étudiant diplômé de notre laboratoire, démontrera la procédure. Dans une zone où vit chlorophorus caragana, placez des pièges de champ appâtés avec des attractants végétaux tels que l’isophorone sur un piège en entonnoir.

Attirez les adultes de coléoptères de bois dans les pièges. Préserver les corps propres de chlorophorus caragana adulte dans 0,1 grain de beauté par litre PBS au pH 7,2, 2,5% de poids par glutaraldehyde volume, et 0,06% volume par volume Tween-20. Fixez l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant trois jours.

Retirer les corps du liquide de conservation et rincer en PBS. Au microscope stéréo, utiliser des forceps pour enlever les appendices et les nettoyer par ultrasons à 40 kilohertz dans PBST. Après le nettoyage pendant 100 secondes, transférez l’échantillon au microscope pour vérifier s’il est propre.

Ne pas nettoyer plus de 400 secondes pour éviter les dommages. Puis immerger les échantillons dans de l’éthanol à une série de concentrations pendant 20 minutes chacune pour effectuer la déshydratation. Après la déshydratation, au microscope stéréo, utilisez du ruban adhésif à double face de carbone pour fixer séparément trois surfaces d’observation, dorsales, ventrales et latérales, sur des talons.

Assurez-vous que toutes les surfaces d’observation sont propres et exemptes de contamination. Placer l’étape de l’échantillon dans une boîte de Pétri contenant un desiccant en gel de silice pendant 48 heures. Ensuite, sur un instrument de pulvérisation d’ion, faites pivoter la valve principale vers la position ouverte, retirez le couvercle de la chambre d’échantillon et mettez l’échantillon dans la chambre.

Allumez l’interrupteur et assurez-vous que la lumière prête est allumée. Réglez le temps de pulvérisation comme 45 secondes et l’épaisseur de revêtement comme 70.875 angstrom. Une fois que l’index du cadran sous vide de la pompe mécanique descend en dessous de sept, pressez la décharge et commencez à pulvériser du platine.

À la fin de la procédure, éteignez l’alimentation électrique et sortez l’échantillon de la chambre. Calculer l’épaisseur du film de pulvérisation D dans angstrom égalant K fois je fois V fois T.K est une constante déterminée par le métal pulvérisé et le gaz. Je suis le flux plasmatique en milliamps tandis que V est la tension appliquée en kilovolts et T est le temps en secondes.

Insérez le talon contenant l’échantillon sur la scène du SEM. Assurez-vous que l’étape de l’échantillon avec le talon de l’échantillon a suffisamment de hauteur pour permettre une bonne image. Ouvrez le logiciel SEM et sélectionnez la tension de fonctionnement désirée à partir de 20 kilovolts.

Après avoir obtenu les appendices de chlorophorus caragana adulte, lavez les échantillons dans PBST dans un bain ultrasonique pendant trois heures, puis post-fixez-les en 1% de poids par tétroxide d’osmium de volume dans PBS pendant une heure à 25 degrés Celsius. Déshydrater les échantillons en utilisant des traitements successifs de 20 minutes dans 50%60%70%80%85%90%95%100%et 100% volume par volume d’éthanol à température ambiante. Avec des forceps, appliquer de la résine chauffée dans un moule d’intégration plat et intégrer les échantillons dans la résine.

Assurez-vous que l’échantillon est au fond de la plaque et placé le plus près possible du bord de la rainure encastrée. Étiquetez puis couvez la plaque contenant l’échantillon à 60 degrés Celsius pendant 72 heures. Après l’incubation, retirer la plaque de l’incubateur et vérifier que la résine s’est polymérisée.

Une fois que l’échantillon s’est solidifié, placez chaque bloc de résine sous un microscope à fluorescence, déplacez la source de lumière fluorescente du microscope pour irradier l’échantillon avec la lumière bleue d’en haut et photographiez-les. Assurez-vous que la sensilla dans le bloc de résine sont clairement visibles. Mesurez la distance entre le bord du bloc de résine et le capteur cible pour cibler la sensilla.

Référez-vous à l’image SEM des palpes et coupez grossièrement le bloc de résine à l’aide d’une lame de rasoir près du récepteur cible. Ensuite, sous une microscopie de fluorescence de lumière bleue, ajustez la source lumineuse d’en haut de sorte que la sensilla soit observée clairement. Ajouter le micromètre objectif au stade du microscope à fluorescence.

Photographiez le bloc de résine grossièrement coupé, puis à l’aide d’ImageJ mesurer la distance entre la cible et le bord de la résine. Placez l’échantillon de résine sur un ultramicrotome et coupez des sections de 50 à 60 nanomètres d’épaisseur jusqu’à ce que la position cible ait été atteinte. Montez les sections sur des grilles de cuivre en maille recouvertes de formvar dans des boîtes de Pétri.

Tacher les grilles avec une solution filtrée saturée d’acétate d’uranyle à température ambiante. Couvrir les sections pendant la coloration pour bloquer les précipités induits par la lumière. Tacher pendant 10 minutes.

Dans un capot fumigène, rincer deux fois dans 50% de méthanol, puis deux fois dans de l’eau dégazée filtrée. Déposer les gouttes de tache de citrate de plomb préparée sur les carrés des boîtes de Pétri en plastique et les laisser reposer pendant huit minutes. Rincer à l’eau filtrée dégazée et sécher.

Montez les grilles sur une étape d’échantillon à l’intérieur de la machine TEM. Réglez la tension à 80 kilovolts et examinez les sections. Dans ce protocole, utilisant la solution de nettoyage et fixative avec Tween-20, une image claire de SEM a été observée que cela sans Tween-20.

Avec la solution de fixation Tween-20 permettant à la solution de fixation du glutaraldehyde de pénétrer dans le tissu, des structures de microtubules ont été clairement vues dans l’image TEM tandis que la structure interne de l’échantillon préparée sans Tween-20 était floue. Les vues transversales continues de la cheville de la brindille de sensilla de type un basiconica sur les palpes maxillaires ont montré que la gaine dendritique entourait les segments dendritiques externes et s’étendait au pore de pointe. Sept segments dendritiques externes non ramifiés existaient à l’intérieur de la cavité lymphatique du récepteur intérieur qui était entourée d’une cavité externe.

Le corps tubulaire a été séparé par une gaine dendritique d’autres segments dendritiques externes à chaque base de prise sensillar. Dans la région ciliaire, huit dendrites de diamètres différents ont été identifiés indiquant la présence de huit neurones bipolaires. La technique peut être utilisée pour étudier plus avant la fonction des nerfs tels que l’enregistrement à cellule unique ou l’hybridation in situ.