Analyse des Complexes de chaîne respiratoire mitochondriale dans les cellules humaines cultivées à l’aide de bleu sur Native de Gel de Polyacrylamide et Immunoblotting

L’électrophoresis natif bleu de gel de polyacrylamide permet l’analyse des complexes in-tact du système oxydant mitochondrique de phosphorylation. Il s’agit d’une technique pratique et peu coûteuse qui peut être utilisée pour superposer l’assemblage de complexes entiers de système de phosphorylation oxydative mitochondriale. Pour préparer les lysates mitochondriaux, utilisez d’abord la solution PBS glacée pour laver doucement les cellules une fois.

Grattez les cellules et granulez-les à quatre degrés Celsius à 800 G pendant 10 minutes. Ensuite, lavez la pastille de cellules deux fois avec le PBS glacé et la centrifugeuse à quatre degrés Celsius à 800 G pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’inhibiteur de la protéase 100x à 20 millilitres de PBS.

Suspendre à nouveau les cellules du mélange inhibiteur de la protéase PBS à une concentration finale de protéines de cinq milligrammes par millilitre. Pour préparer une digitonine de 3,3 millimlaires dans PBS avec inhibiteur de la protéase, dissoudre quatre milligrammes de digitonine dans un millilitre de PBS à 100 degrés Celsius jusqu’à ce qu’aucun précipité ne soit visible. Refroidir immédiatement sur la glace et ajouter 10 microlitres d’inhibiteur de la protéase 100x à un millilitre de la solution digitonine.

Ensuite, ajoutez le mélange inhibiteur de la protéase de digitonine aux cellules à la concentration finale de 1,65 millimolaire. Bien mélanger et incuber sur la glace pendant cinq minutes. Ensuite, ajoutez le mélange inhibiteur de la protéase PBS aux cellules au volume final de 1,5 millilitres.

Centrifugeuse à 4 degrés Celsius à 10 000 G pendant 10 minutes. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille mitochondriale dans un tampon mitochondrial. Préparez un millilitre de 10% de mountased frais de loreal dans la solution d’inhibiteur de PBS.

Ajouter 10% de mountased loreal aux mitochondries à la concentration finale de 1% Incuber sur la glace pendant au moins 15 minutes. Centrifugeuse à 4 degrés Celsius à 20 000 G pendant 20 minutes. Recueillir le supernatant dans un nouveau tube et ajouter le tampon de l’échantillon.

Pour préparer le gel de gradient pour la page native bleue, placez d’abord le fabricant de gradient sur une plaque d’agitation et connectez-le avec un tube flexible à la pompe périssaliste. Fixer un ensemble d’infusion avec une aiguille sur le tube. Placez un agitateur magnétique dans la chambre proximale du fabricant de gradient et lavez le tube avec de l’eau distillée à la vitesse maximale de la pompe pendant 10 minutes.

Ensuite, videz le tube et le fabricant de gradient. Utilisez une pipette pour enlever les restes d’eau distillée dans le canal entre les chambres du fabricant de gradient. Fermez le chenal et le tube avec la vanne.

Assemblez deux plaques de verre dans le support et placez-les sur le support. À l’aide du trou sur le fond du porte-gel, placez l’aiguille reliée au tube entre les plaques de verre. Pour faire un gel de 8,3 par 7,3 centimètres, préparez d’abord des solutions de gel à 6 % et 15 % et gardez-les sur la glace.

Mélangez-les doucement pour éviter de faire des bulles d’air. Ensuite, chargez l’extrémité proximale de la chambre de tube de mélangeur de gel de gradient avec 2,6 millilitres du gel de 6% et de l’extrémité distale avec 2,1 millilitres du gel de 15%. Ensuite, allumez l’agitateur magnétique et ouvrez le tube et le canal entre les chambres du fabricant de gradient.

Allumez immédiatement la pompe périssaltique à cinq millilitres par minute. Remplissez les plaques de verre et retirez l’aiguille lorsqu’il n’y a pas de gel dans le tube. Superposer délicatement le gel avec de l’eau distillée et garder le gel à température ambiante pendant au moins une heure.

Lavez immédiatement le tube en remplissant les chambres de gradient avec de l’eau distillée et en utilisant la pompe périssaliste à la vitesse maximale. Ajouter six millilitres d’eau distillée à trois millilitres du tampon gel 3x pour faire tampon gel 1x. À l’aide d’un papier filtre, retirer délicatement l’eau distillée de la surface du gel.

Laver la surface du gel avec le tampon de gel 1x, et retirer délicatement le tampon avec le papier filtre. Préparez 4% de gel d’empilage selon le manuscrit. Mélanger délicatement pour éviter de faire des bulles d’air.

Ensuite, placez le peigne entre les plaques de verre et versez le gel d’empilage sous le peigne. Immerger le peigne complètement. Laissez le gel empilage polymériser pendant au moins 30 minutes.

Ensuite, retirez le peigne et utilisez une pipette pour laver les puits avec un tampon de gel 1x. Pour effectuer l’électrophoresis bleu de gel indigène, d’abord, ajoutez le tampon bleu de cathode à la cassette de gel. Utilisez une pipette pour laver et remplir les puits avec le tampon cathodique bleu.

Ensuite, chargez de cinq à 30 microgrammes d’échantillons de protéines dans les puits. Remplissez doucement la cassette de gel vers le haut avec le tampon cathodique bleu, et le réservoir avec le tampon d’anode. Tout d’abord, faire fonctionner le gel à une tension constante de 40 volts pendant 15 minutes.

Ensuite, augmenter la tension à 80 volts. Faire fonctionner le gel jusqu’à ce que le colorant atteigne les 2/3 de la longueur du gel. Remplacez le tampon cathodique bleu par le tampon cathodique et continuez l’électrophorèse jusqu’à ce que l’avant du colorant ait été coupé du gel.

Récupérer les plaques de verre et transférer les protéines à la membrane PVDF par ballonnement semi-sec. Utilisez une tension constante de 25 volts et un courant limité à un ampère pendant 30 minutes. L’assemblage des complexes de chaîne respiratoire dans les cellules humaines de neuroblastoma ont été inhibés sur le traitement de chloramphenicol par rapport aux cellules de contrôle sans traitement.

En revanche, les complexes codés par les gènes nucléaires ont été régulés. La dégradation des complexes oxydants de phosphorylation a été observée sur les cycles multiples de gel-dégel. La qualité du gel pourrait affecter la détection des complexes oxydatifs de phosphorylation.

En outre, le décapage de la membrane a abaissé le rapport signal-bruit. Lors de l’exécution de la procédure, il est important de se rappeler d’effectuer une préparation simple et gel électrophorèse dans des conditions froides pour préserver les complexes OXPHOS in-tact. Après la page native bleue, une page SDS de deuxième dimension peut être appliquée pour étudier les sous-unités protéiques des complexes de chaînes respiratoires.

La page bleue native permet aux chercheurs d’étudier l’assemblage de complexes et même de super-complexes du système oxydatif de phosphorylation.